新教材適用2024版高考生物二輪總復習第1部分核心考點突破專題9生物技術與工程第2講細胞工程核心考點二動物細胞工程及其應用教師用書

核心考點二動物細胞工程及其應用1.理清動物細胞培養(yǎng)的基本條件、過程及相關酶(1)營養(yǎng)條件及氣體環(huán)境①加入動物血清等。②通入氧氣以滿足代謝的需要。③通入二氧化碳以維持培養(yǎng)液的pH。(2)胰蛋白酶的兩次使用：首先用胰蛋白酶處理動物的器官或組織，以制備單細胞懸液；培養(yǎng)過程中發(fā)生接觸抑制時，同樣要用胰蛋白酶使細胞分散開。(3)避免雜菌污染的措施：培養(yǎng)液及培養(yǎng)用具滅菌處理及在無菌條件下操作，定期更換培養(yǎng)液。(4)體外培養(yǎng)的細胞分兩類：貼壁生長和懸浮生長，貼壁生長的細胞會發(fā)生接觸抑制。2.完善下面克隆動物培育流程圖(1)克隆動物遺傳物質(zhì)來自兩個親本。(2)發(fā)育過程中可能發(fā)生基因突變或染色體變異。(3)外界環(huán)境條件可能引起不可遺傳的變異。3.把握動物細胞融合的原理、方法及應用(1)原理：細胞膜的流動性。(2)促融方法：滅活的病毒誘導法、物理法、化學法。(3)應用：制備單克隆抗體。4.單克隆抗體制備的過程真題感悟?？碱}型一動物細胞培養(yǎng)和單克隆抗體典例1(2022·湖北卷)某興趣小組開展小鼠原代神經(jīng)元培養(yǎng)的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其培養(yǎng)的原代神經(jīng)元生長緩慢，其原因不可能的是(A)A．實驗材料取自小鼠胚胎的腦組織B．為了防止污染將培養(yǎng)瓶瓶口密封C．血清經(jīng)過高溫處理后加入培養(yǎng)基D．所使用的培養(yǎng)基呈弱酸性【解析】小鼠胚胎腦組織中含有豐富的原代神經(jīng)元，細胞增殖能力強，不會造成生長緩慢，A符合題意；培養(yǎng)瓶瓶口密封會使培養(yǎng)液中缺氧，影響細胞有氧呼吸，造成供能不足，可能使細胞生長緩慢，B不符合題意；血清經(jīng)過高溫處理后，其中活性成分變性，失去原有功能，細胞生存環(huán)境嚴重惡化，可能使細胞生長緩慢，C不符合題意；小鼠內(nèi)環(huán)境為弱堿性，所使用的培養(yǎng)基呈弱酸性，使細胞生存環(huán)境惡劣，可能造成細胞生長緩慢，D不符合題意。典例2(2021·浙江1月卷)下圖為動物成纖維細胞的培養(yǎng)過程示意圖。下列敘述正確的是(C)A．步驟①的操作不需要在無菌環(huán)境中進行B．步驟②中用鹽酸溶解細胞間物質(zhì)使細胞分離C．步驟③到④的分瓶操作前常用胰蛋白酶處理D．步驟④培養(yǎng)過程中不會發(fā)生細胞轉(zhuǎn)化【解析】動物細胞培養(yǎng)過程需要無菌操作，故步驟①的操作需要在無菌環(huán)境中進行，A錯誤；動物細胞培養(yǎng)過程需要用胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理動物組織，分散成單個細胞，制成細胞懸液，B錯誤；傳代培養(yǎng)時需要用胰蛋白酶處理貼壁生長的細胞，使之分散成單個細胞，再分瓶培養(yǎng)，C正確；步驟④為傳代培養(yǎng)過程，該過程中部分細胞可能發(fā)生細胞轉(zhuǎn)化，核型改變，D錯誤。典例3(2022·山東卷)如圖所示，將由2種不同的抗原分別制備的單克隆抗體分子，在體外解偶聯(lián)后重新偶聯(lián)可制備雙特異性抗體，簡稱雙抗。下列說法錯誤的是(D)A．雙抗可同時與2種抗原結(jié)合B．利用雙抗可以將蛋白類藥物運送至靶細胞C．篩選雙抗時需使用制備單克隆抗體時所使用的2種抗原D．同時注射2種抗原可刺激B細胞分化為產(chǎn)雙抗的漿細胞【解析】根據(jù)抗原和抗體發(fā)生特異性結(jié)合的原理推測，雙抗可同時與2種抗原結(jié)合，A正確；根據(jù)抗原與抗體能夠發(fā)生特異性結(jié)合的特性，利用雙抗可以將蛋白類藥物運送至靶細胞，從而使藥物發(fā)揮相應的作用，B正確；由于雙抗是在兩種不同的抗原刺激下，B細胞增殖、分化產(chǎn)生不同的漿細胞分泌形成的，因此，篩選雙抗時需使用制備單克隆抗體時所使用的2種抗原來進行抗原—抗體檢測，從而實現(xiàn)對雙抗的篩選，C正確；同時注射2種抗原可刺激B細胞分化形成不同的漿細胞，而不是分化成產(chǎn)雙抗的漿細胞，D錯誤。故選D。典例4(2023·湖北卷)某病毒對動物養(yǎng)殖業(yè)危害十分嚴重。我國學者擬以該病毒外殼蛋白A為抗原來制備單克隆抗體，以期快速檢測該病毒，其主要技術路線如圖所示?；卮鹣铝袉栴}：(1)與小鼠骨髓瘤細胞融合前，已免疫的脾細胞(含漿細胞)不需要(填“需要”或“不需要”)通過原代培養(yǎng)擴大細胞數(shù)量；添加脂溶性物質(zhì)PEG可促進細胞融合，該過程中PEG對細胞膜的作用是使細胞接觸處的磷脂分子重新排布，細胞膜打開，細胞發(fā)生融合。(2)在雜交瘤細胞篩選過程中，常使用特定的選擇培養(yǎng)基(如HAT培養(yǎng)基)，該培養(yǎng)基對未融合的親本細胞和融合的具有同種核的細胞生長具有抑制作用。(3)單克隆抗體篩選中，將抗體與該病毒外殼蛋白進行雜交，其目的是通過抗體檢測呈陽性來獲得分泌所需抗體的雜交瘤細胞。(4)構(gòu)建重組質(zhì)粒需要使用DNA連接酶。下列屬于DNA連接酶底物的是④?！窘馕觥?1)漿細胞是高度分化的細胞，不能增殖，所以不能通過原代培養(yǎng)擴大細胞數(shù)量。脂溶性物質(zhì)PEG可使細胞接觸處的磷脂分子重新排布，細胞膜打開，細胞發(fā)生融合。(2)在雜交瘤細胞篩選過程中，用特定的選擇培養(yǎng)基進行篩選，在該培養(yǎng)基上，未融合的親本細胞和融合的具有同種核的細胞都會死亡，只有融合的雜交瘤細胞才能生長。(3)單克隆抗體篩選中，將抗體與該病毒外殼蛋白進行雜交，是運用了抗原—抗體雜交技術，抗體檢測呈陽性的細胞，即為所需的雜交瘤細胞。(4)DNA連接酶能連接DNA片段，脫氧核苷酸的磷酸基團位于5′端，—OH位于3′端，①②③脫氧核苷酸鏈的兩端基團有誤；DNA連接酶能催化合成磷酸二酯鍵，即將一條脫氧核苷酸5′端的磷酸基團與另一條脫氧核苷酸鏈的3′端的—OH相連，④符合題意。故選④。歸納提升：制備單克隆抗體的常考點(1)3種細胞特點不同①B淋巴細胞：能分泌抗體，不能大量增殖。②骨髓瘤細胞：能大量增殖，不能分泌抗體。③雜交瘤細胞：既能分泌抗體，又能大量增殖。(2)2次篩選目的不同①第1次：獲得雜交瘤細胞。②第2次：獲得能分泌所需特異抗體的雜交瘤細胞。(3)單克隆抗體的特點：特異性強、能準確地識別抗原的細微差異，可以大量制備。?？碱}型二核移植與克隆動物的培養(yǎng)典例5(2020·天津卷)在克隆哺乳動物過程中，通常作為核移植受體細胞的是去核的(C)A．卵原細胞 B．初級卵母細胞C．次級卵母細胞 D．卵細胞【解析】在克隆哺乳動物過程中，通常選擇減數(shù)第二次分裂中期的去核卵母細胞作為受體細胞，即次級卵母細胞。故選C。典例6(2021·遼寧卷)下圖是利用體細胞核移植技術克隆優(yōu)質(zhì)奶牛的簡易流程圖，有關敘述正確的是(B)A．后代丁的遺傳性狀由甲和丙的遺傳物質(zhì)共同決定B．過程①需要提供95%空氣和5%CO2的混合氣體C．過程②常使用顯微操作去核法對受精卵進行處理D．過程③將激活后的重組細胞培養(yǎng)至原腸胚后移植【解析】后代丁的細胞核的遺傳物質(zhì)來自甲，細胞質(zhì)的遺傳物質(zhì)來自于乙牛，則丁的遺傳性狀由甲和乙的遺傳物質(zhì)共同決定，A錯誤；動物細胞培養(yǎng)中需要提供95%空氣(保證細胞的有氧呼吸)和5%CO2(維持培養(yǎng)液的pH)的混合氣體，B正確；過程②常使用顯微操作去核法對卵母細胞進行處理，C錯誤；過程③將激活后的重組細胞培養(yǎng)至囊胚或桑葚胚后移植，D錯誤。故選B。典例7(2023·浙江6月卷)賴氨酸是人體不能合成的必需氨基酸，而人類主要食物中的賴氨酸含量很低，利用生物技術可提高食物中賴氨酸含量。回答下列問題：(1)植物細胞合成的賴氨酸達到一定濃度時，能抑制合成過程中兩種關鍵酶的活性，導致賴氨酸含量維持在一定濃度水平，這種調(diào)節(jié)方式屬于負反饋調(diào)節(jié)。根據(jù)這種調(diào)節(jié)方式，在培養(yǎng)基中添加一定濃度的賴氨酸類似物，用于篩選經(jīng)人工誘變的植物懸浮細胞，可得到抗賴氨酸類似物的細胞突變體，通過培養(yǎng)獲得再生植株。(2)隨著轉(zhuǎn)基因技術與動物細胞工程結(jié)合和發(fā)展，2011年我國首次利用轉(zhuǎn)基因和體細胞核移植技術成功培育了高產(chǎn)賴氨酸轉(zhuǎn)基因克隆奶牛。其基本流程為：①構(gòu)建乳腺專一表達載體。隨著測序技術的發(fā)展，為獲取富含賴氨酸的酪蛋白基因(目的基因)，可通過檢索基因文庫獲取其編碼序列，用化學合成法制備得到。再將獲得的目的基因與含有乳腺特異性啟動子的相應載體連接，構(gòu)建出乳腺專一表達載體。②表達載體轉(zhuǎn)入牛胚胎成纖維細胞(BEF)。將表達載體包裹到磷脂等構(gòu)成的脂質(zhì)體內(nèi)，與BEF膜發(fā)生融合，表達載體最終進入細胞核，發(fā)生轉(zhuǎn)化。③核移植。將轉(zhuǎn)基因的BEF作為核供體細胞，從牛卵巢獲取卵母細胞，經(jīng)體外培養(yǎng)及去核后作為受體細胞。將兩種細胞進行電融合，電融合的作用除了促進細胞融合，同時起到了激活重組細胞發(fā)育的作用。④重組細胞的體外培養(yǎng)及胚胎移植。重組細胞體外培養(yǎng)至桑葚胚或囊胚，植入代孕母牛子宮角，直至小牛出生。⑤檢測。DNA水平檢測：利用PCR技術，以非轉(zhuǎn)基因牛耳組織細胞作為陰性對照，以含有目的基因的牛耳組織細胞為陽性對照，檢測到轉(zhuǎn)基因牛耳組織細胞中存在目的基因。RNA水平檢測：從非轉(zhuǎn)基因牛乳汁中的脫落細胞、轉(zhuǎn)基因牛乳汁中的脫落細胞和轉(zhuǎn)基因牛耳組織細胞，提取總RNA，對總RNA進行DNA酶處理，以去除DNA污染，再經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA，并以此為PCR的模板，利用特定引物擴增目的基因片段。結(jié)果顯示目的基因在轉(zhuǎn)基因牛乳汁中的脫落細胞內(nèi)表達，而不在牛耳組織細胞內(nèi)表達，原因是什么？構(gòu)建的表達載體只含有乳腺特異性啟動子，只能在乳腺細胞中啟動轉(zhuǎn)錄，而在牛耳細胞中不能表達?！窘馕觥?1)負反饋調(diào)節(jié)是指在一個系統(tǒng)中，系統(tǒng)工作的效果，反過來又作為信息調(diào)節(jié)該系統(tǒng)的工作，并且使系統(tǒng)工作的效果減弱或受到限制，有助于系統(tǒng)保持穩(wěn)定。植物細胞合成的賴氨酸達到一定濃度時，能抑制合成過程中兩種關鍵酶的活性，導致賴氨酸含量維持在一定濃度水平，這種調(diào)節(jié)方式屬于負反饋調(diào)節(jié)。如果想得到抗賴氨酸類似物的細胞突變體可在培養(yǎng)基中添加一定濃度的賴氨酸類似物。(2)①從基因文庫中獲取目的基因：將含有某種生物的許多基因片段，導入受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物不同的基因，稱為基因文庫。當需要某一片段時，根據(jù)目的基因的有關信息，如根據(jù)基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色體上的位置、基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，以及基因的表達產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性來獲取目的基因。②表達載體包裹到磷脂等構(gòu)成的脂質(zhì)體內(nèi)，根據(jù)細胞膜成分，其與BEF膜發(fā)生融合。③去核的卵母細胞作為受體細胞，其處于減數(shù)第二次分裂中期，因為卵母細胞中含有促使細胞核表達全能性的物質(zhì)和營養(yǎng)條件。電融合的作用除了促進細胞融合，同時起到了激活重組細胞發(fā)育的作用。④胚胎發(fā)育到適宜階段可取出向受體移植。牛、羊一般要培養(yǎng)到桑葚胚或囊胚階段；植入代孕母牛子宮角，直至小牛出生。⑤陽性對照：按照當前實驗方案一定能得到正面預期結(jié)果的對照實驗。陽性對照是已知的對測量結(jié)果有影響的因素，目的是確定實驗程序無誤。陰性對照和陽性對照相反，按照當前的實驗方案一定不能得到正面預期結(jié)果的對照實驗，排除未知變量對實驗產(chǎn)生的不利影響。本實驗以非轉(zhuǎn)基因牛耳組織細胞作為陰性對照，為了檢測到轉(zhuǎn)基因牛耳組織細胞中存在目的基因，應該以含有目的基因的牛耳組織細胞為陽性對照。為了除去DNA污染，可以使用DNA酶使其水解。經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA，并以此為PCR的模板進行擴增。目的基因在轉(zhuǎn)基因牛乳汁中的脫落細胞內(nèi)表達，而不在牛耳組織細胞內(nèi)表達，原因是構(gòu)建的表達載體只含有乳腺特異性啟動子，只能在乳腺細胞中啟動轉(zhuǎn)錄，而在牛耳細胞中不能表達。典例8(2021·湖南卷)M基因編碼的M蛋白在動物A的肝細胞中特異性表達?，F(xiàn)設計實驗，將外源DNA片段F插入M基因的特定位置，再通過核移植、胚胎培養(yǎng)和胚胎移植等技術獲得M基因失活的轉(zhuǎn)基因克隆動物A，流程如圖所示。回答下列問題：(1)在構(gòu)建含有片段F的重組質(zhì)粒過程中，切割質(zhì)粒DNA的工具酶是限制酶(限制性內(nèi)切核酸酶)，這類酶能將特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。(2)在無菌、無毒等適宜環(huán)境中進行動物A成纖維細胞的原代和傳代培養(yǎng)時，需要定期更換培養(yǎng)液，目的是清除代謝(產(chǎn))物，防止細胞代謝(產(chǎn))物積累對細胞自身造成危害。(3)與胚胎細胞核移植技術相比，體細胞核移植技術的成功率更低，原因是體細胞分化程度高，恢復(表現(xiàn))其全能性十分困難。從早期胚胎中分離獲得的胚胎干細胞，在形態(tài)上表現(xiàn)為細胞體積小，細胞核大，核仁明顯(答出兩點即可)，功能上具有發(fā)育的全能性。(4)鑒定轉(zhuǎn)基因動物：以免疫小鼠的B淋巴細胞與骨髓瘤細胞進行融合，篩選融合雜種細胞，制備M蛋白的單克隆抗體。簡要寫出利用此抗體確定克隆動物A中M基因是否失活的實驗思路提取此克隆動物的肝臟蛋白，作為抗原，與M蛋白的單克隆抗體進行抗原—抗體雜交，若未出現(xiàn)雜交帶，證明M基因已失活?！窘馕觥?1)限制酶識別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸間的磷酸二酯鍵斷開。(2)動物細胞體外培養(yǎng)需要無菌、無毒等適宜環(huán)境，因此動物細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)液及所有培養(yǎng)用具使用前應進行無菌處理，還應定期更換培養(yǎng)液，以便清除代謝(產(chǎn))物，防止代謝(產(chǎn))物積累對細胞自身造成危害。(3)哺乳動物核移植分為胚胎細胞核移植和體細胞核移植，其中胚胎細胞核移植較易成功，因為與胚胎細胞相比，動物體細胞分化程度高，表現(xiàn)全能性十分困難。胚胎干細胞存在于早期胚胎中，在形態(tài)上表現(xiàn)為體積小、細胞核大、核仁明顯；在功能上具有發(fā)育的全能性。(4)制備單克隆抗體時，應將從免疫小鼠中得到的B淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合并篩選出可大量產(chǎn)生M蛋白抗體的雜交瘤細胞。為確定克隆動物A中M基因是否失活，可利用抗原—抗體特異性結(jié)合原理，將制備的M蛋白的單克隆抗體與轉(zhuǎn)基因動物肝臟中提取的蛋白質(zhì)混合，觀察是否產(chǎn)生雜交帶，若未出現(xiàn)雜交帶，說明M基因已失活。歸納提升：1．核移植獲得的克隆動物與提供細胞核的親本性狀可能不同的原因(1