生理指標測定實驗方案匯總

生理指標測定實驗方案匯總預測指標：抗氧化酶系統(tǒng).MDA可溶蛋白.超氧陰離子自由基葉綠素.類胡蘿卜素可溶性糖游離氨基酸過氧化氫谷胱甘肽.ASA抗氧化酶系統(tǒng).MDAA酶活測定試劑：PBS緩沖液0.05M（pH7.8） :取0.663gNaH2P04?2H20和16.384gNa2HP04?12H20,加PVPIOg，并加EDTA或者EDTA鹽，使其濃度為2mM,加蒸餾水定容至1L。用前冰箱或冰上預冷。樣品制備鮮樣0.1-0.5g加入1ml磷酸緩沖液（0.05M,pH7.8） ，稍許石英砂，研磨成勻漿；移入10ml離心管中，再用4ml磷酸緩沖液分兩次洗滌研缽并全部轉(zhuǎn)入離心管中；10000Xg4°C下離心20min；上清夜貯于4°C冰箱中保存?zhèn)錅y。同時稱取鮮樣一份（0.1g左右）烘干稱重。SOD（入=560nm）試劑配制：1LPBS緩沖液中加入Met1.93973gNBT［氮藍四唑］0.061323gEDTA-Na20.0037224g核黃素0.00075272g實驗步驟：2.725mL反應液+250uL蒸餾水+25uL酶液【樣品管】2.75mL反應液+250uL蒸餾水（光照作為100%CK）【照光對照管】2.75mL反應液+250uL蒸餾水（黑暗作為調(diào)零）【空白調(diào)零管】4000lx日光燈下反應20分鐘，560nm比色。反應溫度25~35°C。已知SOD活性單位以抑制NBT光化還原的50%為一個酶活性單位表示按下式計算SOD活性：SOD總活性=（Ack—AE）*V/（0.5*Ack*w*Vt）（式中SOD總活性以鮮重酶單位每克表示，Ack為照光對照管的吸光度，AE為樣品管的吸光度，V為樣品液的總體積ml,Vt為測定時樣品用量ml，w為樣品鮮重g）探※※【空白調(diào)零管】可在光反應快結束前配制并用黑色紙或鋁箔包裹以避光?！緲悠饭堋亢汀菊展鈱φ展堋吭诠夥磻旖Y束后至測定前應避光處理。POD（入=470nm比色）試劑配制：1.5%愈創(chuàng)木酚（1.5ml愈創(chuàng)木酚，用蒸餾水定容到100ml）300uM的H202：取30%的H2O21.53ml，用蒸餾水定容到50ml；實驗步驟：100ul酶液+2700ulPBS+100ul愈創(chuàng)木酚+100ulH2O2,于普通比色皿，輕輕搖勻2-秒，A470動力學測定1分鐘。選擇時間段較為筆直的曲線斜率為activity,此后測定均參考該時間段。結果計算：P0D（mmol/g）二activityXAXVXa/（EXw）A反應液總體積/ml；V提取液總體積/ml；a測定液體積/ml；w材料鮮重/g；E吸光系數(shù)/mM?cmTCAT（240nm比色）試劑配制：300uM的H202:取30%的H2021.53ml，用蒸餾水定容到50ml；實驗步驟：100ul酶液+2800ulPBS+100ulH2O2，于石英比色皿，輕輕搖勻2-秒，A240動力學測定1分鐘。選擇時間段較為筆直的曲線斜率為activity,此后測定均參考該時間段。結果計算:CAT（mmol/g）=activityXAXVXa/（EXw）APX（入=290nm比色）試劑配制：7.5mM的抗壞血酸（AsA）:66mgAsA用蒸餾水定容到50ml；300uM的H202:取30%的H2021.53ml，用蒸餾水定容到50ml；實驗步驟：100ul酶液+2700ulPBS+100ulAsA+100ulH2O2，于石英比色皿，輕輕搖勻2-秒，A290動力學測定1分鐘。選擇時間段較為筆直的曲線斜率為activity,此后測定均參考該時間段。結果計算:CAT（mmol/g）=activityXAXVXa/（EXw）B.丙二醛（MDA）含量的測定（入=450,532,600nm比色）試劑配制：5%三氯乙酸（TCA）：25g三氯乙酸定容到500mL。MDA反應液：2.5g硫代巴比妥酸，先用少量1M的氫氧化鈉溶解，再用5%三氯乙酸定容到500mL。實驗步驟：0.5mL酶液+2.5mL反應液，沸水浴反應15分鐘，立即冰浴，4800rpm離心10分鐘，上清轉(zhuǎn)入新管，波長450,532和600下比色，MDA反應液調(diào)零。結果計算：丙二醛含量（nmol.g-1）=（D532-D600）*A*V/（a*1.55*10-1*w）式中A為反應液總量（mL）；V為提取液總量（mL）；a為測量用提取液量（mL）；w為材料鮮重（g）。1.55X10-1為丙二醛的umol/L消光系數(shù)（nmol/mL消光系數(shù)）或者：MDA濃度（umol/L）二6.45（D532-D600）-0.56D450丙二醛含量（umol.g-1）=MDA濃度X提取液總體積（ml）/組織鮮重（g）/1000 植物體可溶性蛋白質(zhì)含量測定比色原理：染料考馬斯亮藍G-250在游離態(tài)下呈紅色，當它與蛋白質(zhì)的疏水區(qū)結合后變?yōu)榍嗌?，前者最大光吸收?65nm,后者在595nm。在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)(0?100ug/ml)，蛋白質(zhì)一色素結合物在595nm波長下的光吸收與蛋白質(zhì)含量成正比。故可用于蛋白質(zhì)的定量測定。蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍G-250結合在2min左右的時間內(nèi)達到平衡，完成反應分迅速，其結合物在室溫下1h內(nèi)保持穩(wěn)定。該反應非常靈敏，可測微克級蛋白質(zhì)含量，所以是一種比較好的蛋白質(zhì)定量法?！驹噭?.65mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH；如超氧陰離子自由基含量測定用。稱取K2HP04?3H20(MW=228.22)9.1234g和KH2P04(MW=136.09)3.406g，蒸餾水定容到1L?；騅2HP04?3H204.562g和KH2PO41.703g，蒸餾水定容到0.5L。考馬斯亮藍G-250：稱取100mg考馬斯亮藍G-250溶于50ml90%乙醇中，加入85%(W/V)磷酸100ml，最后用蒸餾水定容至1000ml。濾紙過濾后低溫儲存。常溫下可放置一個月；磷酸(85%，W/V):也即商業(yè)磷酸(濃度285%)。直接用。4.0.15M的NaCl(標準曲線用):NaCl0.8766g蒸餾水定容到100ml。【方法】標準曲線的繪制血清白蛋白(BSA)先用0.15M的NaCl配制成2mg/ml的原液。表1配制0?1000ug/ml血清白蛋白液管號123456牛血清蛋白原液(ml)磷酸鉀緩沖液量(ml)蛋白質(zhì)含量(ug/ml)01.000.10.92000.20.84000.30.76000.40.68000.50.51000以上各管混勻后，各取0.1ml于新的10ml離心管內(nèi)，各加5ml考馬斯亮藍染液，混勻放置2min，在595nm下比色，繪制標準曲線。折衷：表2配制0?1000ug/ml血清白蛋白液管號123456牛血清蛋白原液(ul)磷酸鉀緩沖液量(ul)蛋白質(zhì)含量(ug/ml)01000109020020804003070600406080050501000以上各管混勻后，各加5ml考馬斯亮藍染液，混勻放置2min，在595nm下比色，繪制標準曲線。樣品提取液中蛋白質(zhì)濃度的測定樣品制備參見超氧陰離子自由基含量測定方案。取樣品上清液0.1ml于新的10ml離心管內(nèi)，各加5ml考馬斯亮藍染液，混勻放置2min，在595nm下比色。結果計算樣品蛋白質(zhì)含量（mg/g鮮重）二C*V/W式中C—查標準曲線所得每管蛋白質(zhì)含量（mg/ml）；V—提取液總體積（ml）；此為樣品提取液總體積為3ml；W—取樣量（g）。探測定以上3項目時，同時取部分同批剩余鮮樣稱重后轉(zhuǎn)入紙袋烘干稱重?？扇艿鞍?超氧陰離子自由基植物材料0.1-0.2g左右（記錄準確稱量值）一65mmol/L磷酸鉀緩沖液（pH7.8） lml-少許石英砂一冰上充分研磨一轉(zhuǎn)入離心管一磷酸鉀緩沖液洗滌研缽2次，每次1ml全部轉(zhuǎn)入離心管（樣品提取液總體積為3ml）f4°C10000r/min離心15min一取上清液轉(zhuǎn)入新管標記低溫保存（待測液）。A.超氧陰離子自由基（入=530nm）比色原理：202.-+鹽酸羥胺一N02-+磺胺一重氮化磺胺+a-萘胺一偶氮化合物（粉紅色,在波長530nm處有顯著的光吸收）試劑準備：1.65mmol/L磷酸鉀緩沖液（pH7.8） ；【不用磷酸鈉】稱取K2HP04?3H2O（MW=228.22）9.1234g和KH2P04（MW=136.09）3.406g,蒸餾水定容到1L?；騅2HP04?3H204.562g和KH2P041.703g，蒸餾水定容到0.5L。2.10mmol/L鹽酸羥胺；稱取鹽酸羥胺(MW=69.49)0.06949g蒸餾水定容到lOOmL3.12mol/L乙酸：稱取冰乙酸(MW=60.05)144.1g蒸餾水定容到200mL4.58mmol/L磺胺(12mol/L乙酸為溶劑配制)；稱取磺胺(MW=172.21)0.9988g，用12mol/L乙酸溶解并定容到100mL5.7mmol/La-萘胺(12mol/L乙酸為溶劑配制)；稱取a-萘胺(MW=143.19)0.100233g(O.lg)，用12mol/L乙酸溶解并定容到100mL6.三氯甲烷(氯仿)；7.NaNO2(30umol/LNaN02)(用65mmol/L磷酸鉀緩沖液配制和稀釋)：稱取NaNO2(MW=69.00)0.207g用65mmol/L磷酸鉀緩沖液定容到1L(此時NaNO2濃度3mM),從中吸取5ul,加65mmol/L磷酸鉀緩沖液495ul即可(30uM)。其它25,20,15,10,5umol/LNaNO2，依此。測定流程圖空白調(diào)零組：磷酸鉀緩沖液0.5ml-鹽酸羥胺0.1ml—搖勻一25°C水浴10min—冰浴一磷酸鉀緩沖液0.5ml—搖勻f25C水浴20min—冰浴一磺胺1ml—a-萘胺1ml—搖勻一25C水浴20min—冰浴一三氯甲烷3ml—4C10000r/min離心3min—上層水相測定A530。第8頁共19頁試驗組：磷酸鉀緩沖液0.5ml-鹽酸羥胺0.1ml-搖勻-25°C水浴10min-冰浴一上清液0.5ml-搖勻一25°C水浴20min—冰浴一磺胺1ml—a-萘胺1ml—搖勻一25C水浴20min—冰浴一三氯甲烷3ml—4°C10000r/min離心3min—粉紅色水相（上層）測定A530。標準曲線：NaN02用65mmol/L磷酸鉀緩沖液配置成30umol/L，再稀釋成25,20,15,10,5和0umol/L。磷酸鉀緩沖液0.5ml—鹽酸羥胺0.1ml—搖勻—25C水浴10min—冰浴一加各種不同濃度的NaNO2各取0.5ml—搖勻一25C水浴20min—冰浴一磺胺1ml—a-萘胺1ml—搖勻一25C水浴20min—冰浴一三氯甲烷3ml—10000r/min離心3min—粉紅色水相（上層）測定A530。結果計算：通過標準曲線生成的NO2-與A530的方程，求出[NO2-],乘2則得[0-]。0-產(chǎn)生速率=[02.-]/樣品Pr含量/20min；02.-產(chǎn)生總量=[02.-]/樣品Pr含量（25C水浴共培養(yǎng)60min）。說明：鮮樣測定,不能用于干樣品,樣品也不宜液氮速凍后超低溫冰箱儲存后測定。鹽酸羥胺與樣品上清液的25C水浴共培養(yǎng)20min用于02.-產(chǎn)生速率測定；如果25°C水浴共培養(yǎng)60min則用于02.-含量測定°25C水浴共培養(yǎng)的時間為關鍵時間，必須掌握好，此步處理前后樣品試劑溶液盡量處于冰浴狀態(tài)。待測液制備后應盡快測定。干旱脅迫處理，要同時稱量所取用的同一樣品烘干至恒重稱出烘干重，以便計算單位干重樣品的02.-產(chǎn)生速率；或者用的同一新鮮樣品測定蛋白質(zhì)含量，以便計算單位蛋白質(zhì)質(zhì)量的02.-產(chǎn)生速率。B.可溶性蛋白質(zhì)含量測定比色原理：染料考馬斯亮藍G-250在游離態(tài)下呈紅色，當它與蛋白質(zhì)的疏水區(qū)結合后變?yōu)榍嗌罢咦畲蠊馕赵?65nm,后者在595nm。在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)(0?100ug/ml)，蛋白質(zhì)一色素結合物在595nm波長下的光吸收與蛋白質(zhì)含量成正比。故可用于蛋白質(zhì)的定量測定。蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍G-250結合在2min左右的時間內(nèi)達到平衡，完成反應分迅速，其結合物在室溫下1h內(nèi)保持穩(wěn)定。該反應非常靈敏，可測微克級蛋白質(zhì)含量，所以是一種比較好的蛋白質(zhì)定量法?！驹噭?.65mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH；如超氧陰離子自由基含量測定用。稱取K2HP04?3H20(MW=228.22)9.1234g和KH2P04(MW=136.09)3.406g,蒸餾水定容到1L。或K2HP04?3H204.562g和KH2PO41.703g，蒸餾水定容到0.5L?？捡R斯亮藍G-250：稱取lOOmg考馬斯亮藍G-250溶于50ml90%乙醇中，加入85%(W/V)磷酸100ml，最后用蒸餾水定容至1000ml。濾紙過濾后低溫儲存。常溫下可放置一個月；磷酸(85%,W/V):也即商業(yè)磷酸(濃度285%)。直接用。4.0.15M的NaCl(標準曲線用):NaCl0.8766g蒸餾水定容到100ml。【方法】標準曲線的繪制血清白蛋白(BSA)先用0.15M的NaCl配制成2mg/ml的原液。表1配制0?1000ug/ml血清白蛋白液管號123456牛血清蛋白原液(ml)磷酸鉀緩沖液量(ml)蛋白質(zhì)含量(ug/ml)01.000.10.92000.20.84000.30.76000.40.68000.50.51000以上各管混勻后，各取0.1ml于新的10ml離心管內(nèi)，各加5ml考馬斯亮藍染液，混勻放置2min，在595nm下比色，繪制標準曲線。折衷：表2配制0?1000ug/ml血清白蛋白液管號123456牛血清蛋白原液(ul)磷酸鉀緩沖液量（ul）蛋白質(zhì)含量（ug/ml）01000109020020804003070600406080050501000以上各管混勻后，各加5ml考馬斯亮藍染液，混勻放置2min，在595nm下比色，繪制標準曲線。樣品提取液中蛋白質(zhì)濃度的測定樣品制備參見超氧陰離子自由基含量測定方案。取樣品上清液0.1ml于新的10ml離心管內(nèi)，各加5ml考馬斯亮藍染液，混勻放置2min，在595nm下比色。結果計算樣品蛋白質(zhì)含量（mg/g鮮重）二C*V/W式中C—查標準曲線所得每管蛋白質(zhì)含量（mg/ml）；V—提取液總體積（ml）；此為樣品提取液總體積為3ml；W—取樣量（g）。探測定以上3項目時，同時取部分同批剩余鮮樣稱重后轉(zhuǎn)入紙袋烘干稱重。葉綠素.類胡蘿卜素葉綠素.類胡蘿卜素測量實驗步驟：葉片快速剪取并精確稱重0.1g左右，重復3次。再快速剪成細絲（或用打孔器打成小的葉圓片）轉(zhuǎn)入潔凈離心管，管內(nèi)加提取液10ml，于室溫下遮光靜置至樣品完全發(fā)白（期間多次搖動提取液），對提取液比色（以不加葉片的提取液調(diào)零），然后據(jù)提取液類型按下面公式計算葉綠素和類胡卜素含量。剪取葉片同時再精確稱取0.1-0.2g左右葉片，105°C殺青10min,80°C烘干恒重后稱重。結果計算：一.采用丙酮.無水乙醇.蒸餾水混合提取液(三者體積比4.5：4.5：1)Chla(mg/L)=9.784OD6634.650OD663,Chl(a+b)(mg/L)=5.134OD663+20.436OD645,Car(mg/L)=4.695OD440鈦復合物黃色沉淀，可被H2S04溶解后，在415nm波長下比色測定。在一定范圍內(nèi)，其顏色深淺與H202濃度呈線性關系。【試劑】1.100umol/LH2O2丙酮試劑：取30%分析純H20210.2ul,溶于100ml的丙酮(此時H202為1mmol/L)，混勻后從中吸取50ul再加丙酮450ul混勻(此時H202為100umol/L)。2.1mol/L硫酸：濃硫酸56ml，緩慢加蒸餾水944ml，混勻冷卻。3.5%(W/V)硫酸鈦：稱取5g硫酸鈦，加蒸餾水100ml溶解。丙酮(冰浴或冰箱預冷)；濃氨水。【方法】制作標準曲線：取10ml離心管7支，順序編號，并按表1和2加入試劑。表1測定H202濃度標準曲線配置表試劑（ml）離心管號1234567100umol/LH2O200.10.20.40.60.81.04°C下預冷丙酮1.00.90.80.60.40.205%硫酸鈦0.10.10.10.10.10.10.1濃氨水0.20.20.20.20.20.20.23000r/min離心10min，棄去上清夜，留沉淀1mol/L硫酸5.05.05.05.05.05.05.0表2測定H202濃度標準曲線配置表試劑（ml）離心管號12345671mmol/LH2O200.10.20.40.60.81.04C下預冷丙酮1.00.90.80.60.40.205%硫酸鈦0.10.10.10.10.10.10.1濃氨水0.20.20.20.20.20.20.23000r/min離心10min，棄去上清夜，留沉淀1mol/L硫酸5.05.05.05.05.05.05.0待沉淀完全溶解后，將其小心轉(zhuǎn)入新的10ml離心管中，并用蒸餾水少量多次沖洗原來的離心管，將洗滌液合并后定容至10ml刻度，415nm波長下比色。（2）用移液管吸取樣品提取液1ml，按表1或2加入5%硫酸鈦0.1ml和濃氨水0.2ml，待沉淀形成后3000rpm/min離心10min（或8000rpm離心5min），棄去上清液。沉淀用冷丙酮反復洗滌3?5次，每次1ml（具體為：沉淀加冷丙酮1ml,混勻，8000rpm離心1min，棄掉丙酮；重復此步驟三次），直到去除植物色素。（3）向洗滌后的沉淀中加入1mol/L硫酸5ml，搖勻，待完全溶解后，與標準曲線同樣的方法定容并比色。結果計算：植物組織中H202含量（umol/gFw）=式中C樣品提取液總體積（ml）；V1植物組織鮮重（g）。7.谷胱甘肽.ASAA.谷胱甘肽含量的測定還原型谷胱甘肽（GSH）是植物細胞內(nèi)另一種重要的抗氧化劑。它含有活性的巰基，極易被氧化。本實驗利用疏基試劑DTNB測定GSH的含量。試劑藥品：GSH的提取（下面的ASA測定也使用該提取液）精確稱0.2g左右葉片，將樣品剪碎加入5mL10%三氯乙酸，研磨，15000Xg離心10min,留取上清液備測。同時再精確稱取0.2g左右葉片，105°C殺青10min,80°C烘干恒重后稱重。1.10%三氯乙酸（TCA）溶液（W/V）：10g三氯乙酸，用蒸餾水配成100mL溶液；2.150mM磷酸緩沖液（pH7.5;含有5mMEDTA）:Na2HP04?12H2038.679g和NaH2P04?2H203.952g溶于約1L水；加入EDTA使其濃度為5mM，攪勻后蒸餾水定容。3.6mMDTNB（用上面的150mMNaH2PO4（pH7.5;含有5mMEDTA）來配制）實驗步驟：GSH標推曲線的制作配制濃度分別為0mM.0.02mM.0.04mM.0.06mM.0.08mM.0.10mM.0.12mM的標淮GSH溶液，吸取上述標準液各0.25mL。分別加入150mMNaH2PO4（pH7.4）2.60mL，混合均勾后，往各管中加人DTNB試劑0.15mL，搖勻厲，30°C保溫反應5min，測A412nm（以加磷酸緩沖液代替DTNB試劑作空白對照）。將測定結果以GSH濃度為橫坐標.光密度值為縱坐標制作標淮曲線。GSH的提取（下面的ASA測定也使用該提取液）精確稱0.2g左右葉片，將樣品剪碎加入5mL10%三氯乙酸，研磨，15000Xg離心10min,留取上清液備測。同時再精確稱取0.2g左右葉片，105°C殺青10min,80°C烘干恒重后稱重?？侴SH含量的測定分別取上述樣品提取液0.25mL，各加入磷酸緩沖液2.6mL.DTNB試劑0.15mL，以加磷酸緩沖液代替DTNB試劑作空白。搖勻后，于30°C保溫反應5min，測定412nm波長下的光吸收值。根據(jù)標準曲線計算樣品的GSH含量。折衷：分別取上述樣品提取液83uL，各加入磷酸緩沖液867uL.DTNB試劑50uL于1.5ml離心管中（總體積1ml），以加磷酸緩沖液代替DTNB試劑作空白。搖勻后，于30C保溫反應5min，使用微量比色皿測定412nm波長下的光吸收值。重