非B細(xì)胞來源IgκV區(qū)保守序列特異性抗體的制備及鑒定

非B細(xì)胞來源IgκV區(qū)保守序列特異性抗體的制備及鑒定免疫球蛋白（Ig）是重要的免疫分子,其兩種存在方式分別為:膜型和分泌型,前者作為B淋巴細(xì)胞表面的抗原受體在抗原識別、細(xì)胞的活化、分化甚至程序性細(xì)胞死亡中起重要作用;后者主要存在與血液及其它體液中的,能夠與相應(yīng)抗原相結(jié)合發(fā)揮抗體的效應(yīng)功能。經(jīng)典的免疫學(xué)理論認(rèn)為,Ig的來源為B淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞,Ig基因僅在B淋巴細(xì)胞發(fā)育過程中成功進(jìn)行選擇性重排,而在其它體細(xì)胞中該基因處于胚系狀態(tài),或者僅能發(fā)生不完全的重排,即不發(fā)生功能性基因重排,故不會有Ig分子的產(chǎn)生。2003年,北京大學(xué)邱曉彥教授課題組在CancerResearch發(fā)表論文證實(shí)上皮來源腫瘤細(xì)胞可產(chǎn)生Ig分子,該工作被評為2004年中國醫(yī)藥研究領(lǐng)域十大新聞之一。其工作證明了除B淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞外,在一些非免疫細(xì)胞,如上皮來源的腫瘤細(xì)胞（如肺癌、卵巢癌、腸癌、鼻咽癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌等）及部分正常的上皮細(xì)胞內(nèi)Ig基因同樣存在功能性基因重排,并可以產(chǎn)生Ig分子,因此現(xiàn)將其稱為非B細(xì)胞來源Ig（nonB-Ig）;此外,更重要的是該課題組通過對nonB-Ig分子功能的研究,表現(xiàn)在基因及蛋白質(zhì)水平抑制癌細(xì)胞Ig分子的表達(dá)或封閉其活性,則癌細(xì)胞增殖能力明顯減弱。上述現(xiàn)象將有可能使人們重新定義Ig分子的來源及其潛在的、有別于經(jīng)典Ig的生物學(xué)活性,具有重要的學(xué)術(shù)價(jià)值。同時(shí),也將對腫瘤發(fā)生與發(fā)展的生物學(xué)研究以及以腫瘤細(xì)胞表達(dá)的Ig分子做為靶點(diǎn)的腫瘤生物治療研究產(chǎn)生重要的影響?？上驳氖?非B細(xì)胞能夠產(chǎn)生Ig的現(xiàn)象已逐漸被國內(nèi)外學(xué)者所證實(shí)與認(rèn)同。已知,B細(xì)胞來源的Ig具獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和功能,主要表現(xiàn)在:其可變區(qū)（V區(qū)）識別特定的抗原決定簇,不同的B淋巴細(xì)胞克隆產(chǎn)生不同的IgV區(qū)結(jié)構(gòu),從而構(gòu)成了Ig分子的多樣性,使得免疫系統(tǒng)能夠應(yīng)對自然界不同的抗原;其恒定區(qū)與一組特定的分子（如Fc受體、信號傳導(dǎo)分子、補(bǔ)體的級聯(lián)成分）相結(jié)合,行使Ig分子的效應(yīng)功能。根據(jù)恒定區(qū)的不同,B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的Ig分子根據(jù)重鏈不同被分為五類,分別是IgG、IgM、IgA、IgD和IgE;其輕鏈則分為κ與λ型。B細(xì)胞來源的Ig分子的可變區(qū)序列呈高度多樣性,這是構(gòu)成抗體及BCR多樣性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。對非B細(xì)胞來源的Ig基因研究結(jié)果顯示,與經(jīng)典的Ig分子相似,這些nonB-Ig分子的重鏈及輕鏈編碼基因均發(fā)生了典型的基因重排及轉(zhuǎn)錄。但在其V-D-J或V-J序列、體細(xì)胞突變特點(diǎn)和類別轉(zhuǎn)換等方面均呈現(xiàn)出與經(jīng)典Ig分子不同的特征。邱曉彥教授課題組借助激光顯微切割（LCM）及RT-PCR技術(shù),證明所有腫瘤細(xì)胞來源的Ig分子V-D-J或V-J片段組合方式有明顯的傾向性。表現(xiàn)在同一個(gè)體的不同細(xì)胞克隆、甚至不同個(gè)體腫瘤來源的Ig序列之間高度同源,甚至完全相同,并且這些序列在B淋巴細(xì)胞表達(dá)的Ig數(shù)據(jù)庫中均無記錄,提示這些序列的確是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的。更令人驚奇的是,所有腫瘤細(xì)胞均表達(dá)序列完全相同或極其相似的（個(gè)別堿基的替換）重排模式,即Vκ4—1/Jκ3型Igκ轉(zhuǎn)錄本（專利申請?zhí)枮?00510107833.9）。這一現(xiàn)象提示,這些序列特點(diǎn)與組織類型無關(guān),它們可能在不同的組織中發(fā)揮著相似的作用。根據(jù)上述發(fā)現(xiàn),作為與北京大學(xué)邱曉彥教授的合作項(xiàng)目,本研究的主要目的是制備這種保守的κ鏈可變區(qū)抗體。我們根據(jù)其特有Vκ4—1/Jκ3氨基酸序列,對比胚系基因可變區(qū)序列,綜合考慮氨基酸組成、疏水性、抗原性、表面暴露性等因素,利用生物信息學(xué)方法分析預(yù)測了Vκ4—1/Jκ3型Igκ兩個(gè)較為特異的B細(xì)胞識別表位,設(shè)計(jì)并合成三個(gè)短肽AL13（序列ASINCKSSQRVSL）、QF20（QAEDVAVYYCQQYYDTPVTF）,AL13B（TQSPDSLVVSLGERASINCKSSQRVSLG,即AL13的延長序列）。同時(shí)獲得由邱曉彥教授課題組提供的原核表達(dá)Vκ4—1/Jκ3型Igκ純化融合蛋白（GST-V_κ4-1-J_κ3）。本實(shí)驗(yàn)分別以合成肽AL13、QF20交聯(lián)載體免疫家兔獲得單表位特異性多克隆抗體;分別以合成肽AL13B-KLH、原核蛋白GST-V_κ4-1-J_κ3免疫小鼠獲得系列單克隆抗體抗。再通ELISA、WesternBlot、流式細(xì)胞術(shù)等方法鑒定了抗體的效價(jià)和特異性,為后續(xù)研究提供了有效工具。第一章Vκ4-1-Jκ3型IgκV區(qū)特異性單表位多抗的制備及鑒定將合成肽AL13、QF20分別與載體蛋白交聯(lián)制備免疫原,免疫新西蘭大白兔獲得相應(yīng)抗血清,經(jīng)ELISA檢測其抗體滴度分別為0.3×10^-5和0.6×10^-5。運(yùn)用親和層析方法對兔血清進(jìn)行純化,得到anti-AL13和anti-QF20單表位特異性多抗。ELISA結(jié)果顯示,所得抗體與合成肽特異性結(jié)合,但不與正常人IgG反應(yīng)。為了進(jìn)一步證明所得抗體的特異性,以原核表達(dá)蛋白GST-Vκ4-1-Jκ3（39kD）和V5-51-Vκ4-1-Jκ3-pRA（34kD）作為抗原進(jìn)行WesternBlot檢測,結(jié)果顯示anti-AL13和anti-QF20都能夠正確識別含Vκ4-1-Jκ3序列的原核表達(dá)蛋白,在預(yù)期位置上都有明確的條帶出現(xiàn),但基本不與商品化的人IgG的輕鏈結(jié)合;用anti-AL13檢測HT-29細(xì)胞中內(nèi)源性Igκ的表達(dá),結(jié)果顯示anti-AL13的陽性信號主要在HT-29細(xì)胞不可溶成分中（僅少量的存在于可溶性組分中）,這種與經(jīng)典Ig分子完全不同的細(xì)胞內(nèi)定位,提示其可能具有不同于經(jīng)典Ig分子的生物學(xué)活性。第二章Vκ4-1-Jκ3型IgκV區(qū)特異性單克隆抗體的制備及鑒定以合成肽AL13B-KLH作為免疫原免疫Balb/c小鼠,取其脾細(xì)胞與NS-1細(xì)胞融合制備雜交瘤,經(jīng)合成肽和原核表達(dá)蛋白（GST-Vκ4-1-Jκ3）篩選和三次克隆化,并從制備的腹水中純化單克隆抗體,篩選后共獲得3株（6G5、3H9.2、5D3）穩(wěn)定分泌針對Vκ4-1-Jκ3型Igκ的抗體的雜交瘤細(xì)胞;同時(shí)以原核重組蛋白（GST-Vκ4-1-Jκ3）作為免疫原免疫Balb/c小鼠,取其脾細(xì)胞與NS-1細(xì)胞進(jìn)行融合,經(jīng)篩選、克隆化后獲得1株（4E9）穩(wěn)定分泌針對Vκ4-1-Jκ3型Igκ的抗體的雜交瘤細(xì)胞。這4株單抗的亞類分別為IgG1、IgG1、IgG1和IgG2b。將腹水單抗經(jīng)辛酸—硫酸銨沉淀法純化,并用改良過碘酸鈉法對4株抗體標(biāo)記了辣根過氧化物酶。ELISA鑒定結(jié)果顯示所得單抗均與合成肽及原核表達(dá)蛋白（GST-Vκ4-1-Jκ3）發(fā)生特異性結(jié)合。對合成肽AL13B-KLH來源的3株單抗的近一步ELISA鑒定結(jié)果顯示:這3株單抗與常用的載體蛋白KLH、BC、BSA、OVA均無交叉反應(yīng),同時(shí)與商品化的人IgG、羊IgG、兔IgG、鼠IgG均不反應(yīng);用流式細(xì)胞術(shù)鑒定上述單抗可與以人結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29和人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549的細(xì)胞內(nèi)蛋白發(fā)生明顯的特異性結(jié)合,驗(yàn)證了Vκ4-1-Jκ3型Igκ的胞內(nèi)表達(dá);與人末梢血淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞均有高比例的結(jié)合。鑒于人與小鼠Igκ的同源性高達(dá)70%,我們對靶抗原序列與小鼠IgκV區(qū)進(jìn)行了比對,用流式細(xì)胞術(shù)證明上述4株單抗可與小鼠腫瘤細(xì)胞系的胞內(nèi)蛋白有明顯結(jié)合;與小鼠脾細(xì)胞的部分細(xì)胞膜結(jié)合。用上述4株單抗鑒定人和小鼠細(xì)胞的Vκ4-1-Jκ3型Igκ表達(dá)譜工作仍在進(jìn)行中。第三章抗藍(lán)載體單克隆抗體的制備及特性鑒定該部分是作為碩士研究生進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室初期進(jìn)行免疫學(xué)技能訓(xùn)練時(shí)完成的一項(xiàng)工作,并得以發(fā)表。藍(lán)載體（BlueCarrier,BC）是從軟體動物Concholepasconcholepas中分離出的血藍(lán)蛋白,是鑰孔戚血藍(lán)素（Keyholelimpethemocyanin,KLH）的一種類似物。BC的溶解性與均一性明顯優(yōu)于KLH,作為合成肽以及半抗原免疫時(shí)的載體蛋白已被成功用于多克隆抗體以及單克隆抗體的