代謝型谷氨酸受體4亞型高通量藥物篩選模型的建

代謝型谷氨酸受體4亞型高通量藥物篩選模型的建代謝型谷氨酸受體4亞型(mGluR4)高通量藥物選擇模型的建立張婭玲1,2,白艷秋1,21中國科學(xué)院北京基因組研究所,北京101300

2中國科學(xué)院研究生院,北京100039摘要:為發(fā)覺代謝型谷氨酸受體4亞型(mGluR4)的調(diào)劑劑,通過熒光檢測胞內(nèi)鈣濃度的方法,建立一個基于細胞功能性檢測的高通量選擇(HTS)系統(tǒng)。將人mGluR4基因轉(zhuǎn)染穩(wěn)固表達G15蛋白的人胚腎細胞(HEK-293),用Zeocin選擇獲得穩(wěn)固表達mGluR4的細胞株,并通過鈣流檢測試驗證實該細胞系的生物學(xué)功能。優(yōu)化了實驗系統(tǒng)中熒光染料的孵育時刻,溶劑二甲基亞砜(DMSO)耐受性,以及溶劑氫氧化鈉(NaOH)耐受性,建立了可靠穩(wěn)固的選擇系統(tǒng)。鈣流檢測試驗數(shù)據(jù)表明,mGluR4細胞系對其興奮劑的活性程度排序是:L-(+)-2-Amino-4-phosphonobutyricacid(L-AP4)>L-Serine-O-phosphate(L-SOP)>L-Glutamicacid(L-Glu);拮抗劑是:(RS)--Methylserine-O-phosphate(MSOP)>(RS)--Methyl-4-phosphonophenylglycine(MPPG)。在96和384細胞微孔培養(yǎng)板中,得到該選擇系統(tǒng)Z’因子分別是0.80和0.65。結(jié)果表明,該穩(wěn)固細胞系擁有一個穩(wěn)固的檢測系統(tǒng),適合于mGluR4興奮劑/拮抗劑的選擇。關(guān)鍵詞:代謝型谷氨酸受體4亞型(mGluR4),高通量選擇(HTS),G15,興奮劑/拮抗劑Developmentofafunctionalcell-basedHTSassayforthe

identificationmGluR4modulatorsYalingZhang1,2,andYanqiuBai1,21BeijingInstituteofGenomics,ChineseAcademyofSciences,Beijing101300,China2GraduateUniversityoftheChineseAcademyofSciences,Beijing100039,ChinaAbstract:Toidentifymetabotropicglutamatereceptor4(mGluR4)modulatorsbyCa2+influxassay,wedevelopedthefunctionalcell-basedhighthroughput-screening(HTS)assay.ThehumanmGluR4cDNAwastransfectedintoHEK-293stablyexpressingpromiscuousG-protein(G15)cells.RecombinantstablemGluR4celllinewasselectedunderZeocinandvalidatedbyCa2+influxassay.TheassaywasoptimizedonloadingtimeofFluoCalciumIndicator,Dimethylsulfoxide(DMSO)toleranceandsodiumhydroxide(NaOH)toleranceusingagonist(L-Glutamicacid(L-Glu))ofmGluR4.TherankorderoftheagonistpotencyforthestablehumanmGluR4celllinewasL-(+)-2-Amino-4-phosphonobutyricacid(L-AP4)>L-Serine-O-phosphate(L-SOP)>L-Glu,andoftheantagonistpotencywas(RS)--Methylserine-O-phosphate(MSOP)>(RS)--Methyl-4-phosphonophenylglycine(MPPG).Z’factorvalueofthecelllinein96-and384-wellplateformatwas0.80and0.65.OurdataindicateasuccessfuldevelopmentoffunctionalhumanmGluR4recombinantstablecelllinethatwassuitableforhighthroughputscreeningtoidentifymGluR4agonist/antagonist.Keywords:metabotropicglutamatereceptor4(mGluR4),highthroughputscreening(HTS),G15,agonist/antagonist谷氨酸是公認的最重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)之一,其在眾多的中樞神經(jīng)功能方面發(fā)揮著重要的作用,例如:經(jīng)歷的獵取與學(xué)習(xí),癲癇、中風(fēng)等功能紊亂,神經(jīng)退行性疾病等[1]。L-谷氨酸通過與谷氨酸受體相結(jié)合發(fā)揮其生理作用[2,3]。谷氨酸受體分為2類:離子型谷氨酸受體(Ionotropicreceptors)和代謝型谷氨酸受體(Metabotropicreceptors)。離子型谷氨酸受體(iGluRs)包括3個亞型:IV_甲基-D-門冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)、紅藻氨酸(Kainicacid)和使君子氨酸受體(-amino-3-hydroxy-5·methyl-4.isoxazolepropionate,AMPA),該類受體被激活后能促使離子通道開放,從而陽離子如Na+、Ca2+等進入細胞內(nèi);代謝型谷氨酸受體(mGluRs)包括mGluR1-8共8個受體亞型,為G蛋白偶聯(lián)受體家族成員[4],有7個跨膜結(jié)構(gòu),通過介導(dǎo)第二信使來調(diào)劑受體生理功能[5]。按照代謝型谷氨酸受體氨基酸系列同源性、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制和藥理學(xué)特性,將其分為3組:第1組包括mGluR1和mGluR5,能被3,5-DHPG選擇性的激活,它們被激活后,使PLC活化,促使PI水解產(chǎn)生IP3和DAG,增強iGluRs專門介導(dǎo)的神經(jīng)興奮毒性;第2組包括mGluR2和mGluR3,其在重組系統(tǒng)中負調(diào)控腺苷酸環(huán)化酶(AC),LY379268是其選擇性的興奮劑;第3組由mGluR4、mGluR6、mGluR7和mGluR8組成,其同樣是負調(diào)控AC,能夠被L-AP4激活[4,5]。這些受體被激活后,能夠調(diào)劑谷氨酸神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞。神經(jīng)遞質(zhì)傳遞的專門將會引起眾多的疾病。因此,這些受體差不多成為藥物研發(fā)的重要靶點,開發(fā)與此類受體特異性作用的藥物刻不容緩,而建立快速、方便、經(jīng)濟的選擇平臺能夠大大加快此類新藥的選擇與開發(fā)。代謝型谷氨酸受體4亞型(mGluR4)集中分布于小腦顆粒細胞中,在嗅覺組織中也發(fā)覺mGluR4特異性的表達[5]。發(fā)覺并開發(fā)mGluR4特異性的調(diào)劑劑,能夠促進眾多的與其有關(guān)的疾病治療。大規(guī)模的藥物開發(fā)必不可少的要應(yīng)用高通量選擇(Highthroughputscreening,HTS)平臺,如此不僅能夠節(jié)約人力、物力,又能夠大大縮短藥物研發(fā)前期所消耗的時刻。先前的研究報道已有基于細胞水平的功能性檢測方法用于選擇mGluR4調(diào)劑劑[610],例如:GomezaJ等用鼠mGluR4基因和G-蛋白(G15、G16、Gq/I)瞬時共轉(zhuǎn)染人胚腎細胞(HEK-293)后用于mGluR4的研究[10];KowalD等用人mGluR4基因和Gqi穩(wěn)固共轉(zhuǎn)染倉鼠卵巢細胞(CHO-K1)并用于mGluR4的有關(guān)研究[7]。在本研究中,用人mGluR4重組質(zhì)粒(HumanmGluR4-pcDNA4/TO)轉(zhuǎn)染穩(wěn)固表達G15的HEK-293細胞株,通過抗生素的選擇得到重組細胞株,并應(yīng)用鈣流檢測試驗進行進一步的確定及試驗條件的優(yōu)化。結(jié)果表明,一個基于重組細胞水平的功能性檢測、適用于鑒定mGluR4興奮劑/拮抗劑的HTS平臺被成功建立。1材料和方法1.1試劑和儀器穩(wěn)固表達G15的人胚腎細胞(HEK-293/G15)由本實驗室儲存;DMEM(Dulbecco’sModifiedEagleMediumpowder,highglucose,GibcoBRL);Glutamine-freeDMEM(Dulbecco’sModifiedEagleMedium,highglucose,1X,-L-Glutamine,Gibco);FBS(FetalBovineSerum,Hyclone);dFBS(DialyzedFetalBovineSerum,Hyclone);選擇性抗生素Zeocin(Invitrogen);Trypsin(Invitrogen);MatriGel?Matrix(BDBioscience);轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000(Invitrogen);熒光染料Fluo-3/AM(MolecularProbes);Probenecid(Sigma);L-Glutamicacid(L-Glu,Sigma);L-AP4(L-(+)-2-Amino-4-phosphonobutyricacid),L-SOP(L-Serine-O-phosphate),MPPG((RS)--Methyl-4-phosphonophenylglycine)和MSOP((RS)--Methylserine-O-phosphate)從Tocris購買。1.2質(zhì)粒構(gòu)建通過基因合成獲得人源mGluR4的cDNA,同時通過NotI+XbaI亞克隆到真核生物表達載體pcDNA4/To上。所得到的表達質(zhì)粒命名為mGluR4-pcDNA4/To.1.3穩(wěn)固表達mGluR4細胞系構(gòu)建穩(wěn)固表達G15蛋白的人胚腎細胞(HEK-293/G15)培養(yǎng)在含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中,置于37oC,5%CO2溫箱中培養(yǎng)。將HEK-293/G15接種于6孔細胞培養(yǎng)板中,待細胞生長到50%~70%匯合率時用于轉(zhuǎn)染。使用LipofectamineTM2000將人源mGluR4-pcDNA4/TO質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK-293/G15細胞(轉(zhuǎn)染操作參照試劑盒講明書進行),HEK-293/G15細胞作為陰性對比。轉(zhuǎn)染24h之后,將細胞以1:5和1:10的比例傳代于100mm培養(yǎng)皿中。細胞貼壁生長24h之后,加入120g/mLZeocin進行抗生素選擇。每3d換一次加有120g/mLZeocin的新奇培養(yǎng)基,連續(xù)選擇2周。當(dāng)陰性對比細胞(沒有轉(zhuǎn)染的HEK-293/G15)在抗生素作用下完全死亡之后,選擇單細胞克隆團于96孔細胞培養(yǎng)板中(Corningcostar)進行擴大培養(yǎng)。按照興奮劑作用于細胞后引起胞內(nèi)鈣流變化的原理進行陽性細胞克隆的選擇。選擇具有明顯鈣流信號變化的細胞克隆(設(shè)定為P0代)傳代培養(yǎng),并進行進一步的功能驗證。當(dāng)細胞生長到90%匯合率的時候即進行傳代培養(yǎng),以1:8到1:10的比例傳代培養(yǎng)于含有5mL新奇培養(yǎng)基(加有60g/mLZeocin)的60mm細胞培養(yǎng)皿中。1.4鈣流檢測試驗方法鈣流檢測方法是通過使用儀器FlexStation(Moleculardevices)檢測熒光染料Fluo-3/AM標(biāo)記的鈣流變化,在FlexStation熒光成像分析系統(tǒng)中,激發(fā)波長為485nm,發(fā)射波長為525nm。細胞以2×104/well的密度接種于MatriGel?Matrix預(yù)先包被的96孔黑壁透亮底板中(Cloningcostar),過夜培養(yǎng)于37oC、5%CO2溫箱。第2天,小心吸棄孔中全部培養(yǎng)基,每孔細胞加入100L含有5%dFBS的glutamine-freeDMEM,在37oC、5%CO2溫箱培養(yǎng)12~24h。進行鈣流檢測試驗時,小心吸棄細胞培養(yǎng)基,每孔細胞中加入100L含有1mmol/LProbenecid,1×Quencher和4mol/LFluo-3/AM的1×HBSSbuffer(1.26mmol/LCaCl2,0.49mmol/LMgCl2,0.41mmol/LMgSO4,5.33mmol/LKCl,0.44mmol/LKH2PO4,137.93mmol/LNaCl,0.34mmol/LNa2HPO4,5.56mmol/LD-Glucose,20mmol/LHEPES,4.17mmol/LNaHCO3,pH7.4),將細胞置于37oC避光孵育90min。興奮劑(L-Glu,L-AP4或L-SOP)配制成5×測試濃度,以25L/s的速度將25L的化合物加入到細胞中,在加入化合物16s之后采集鈣流數(shù)據(jù)直至120s以上。檢測拮抗劑活性時,將興奮劑L-Glu和拮抗劑分別配制成10×測試濃度,并將其等體積混合成5×測試濃度,以25L/s的速度將25L的化合物加入到細胞中,在加入化合物16s之后采集鈣流數(shù)據(jù)直至120s以上。1.5數(shù)據(jù)分析化合物劑量依靠關(guān)系使用軟件GraphPadPrism5進行非線性曲線擬合分析。本實驗中的數(shù)據(jù)差不多上通過2次重復(fù)實驗所獲得的平均值,同時檢測平均標(biāo)準(zhǔn)偏差(±SEM)。Z’因子用下面公式運算:Z’=13×(|SDsignal|+|SDbackground|)/(|Meansignal||Meanbackground|)2結(jié)果2.1陽性克隆選擇將人mGluR4重組質(zhì)粒(mGluR4-pcDNA4/TO)轉(zhuǎn)染穩(wěn)固表達G15的HEK-293細胞株,通過抗生素的選擇共得到68個重組細胞株。用500mol/LL-Glu激活mGluR4,從而引發(fā)內(nèi)鈣動員,進而檢測鈣信號。其中,檢測到32個克隆有明顯的鈣信號,但母細胞系HEK-293/G15胞內(nèi)鈣離子水平?jīng)]有變化。最終選擇了1個信號較強的克隆作為待定細胞株,命名為mGluR4/HEK-293/G15,進行擴大及傳代培養(yǎng),進一步考察其特異性及穩(wěn)固性,同時優(yōu)化其用于HTS時的選擇條件。2.2選擇條件的優(yōu)化某檢測方法是否適用于HTS,具有嚴(yán)格的評判標(biāo)準(zhǔn),例如:好的信躁比值,高靈敏度以及一致性[11]。為了評估在檢測系統(tǒng)中產(chǎn)生的信號的動力學(xué)效應(yīng),諸如熒光染料的孵育時刻,溶劑DMSO和NaOH的耐受性等鈣流檢測參數(shù)都被做了優(yōu)化。鈣熒光染料(Fluo-3/AM)的孵育時刻是阻礙鈣流檢測系統(tǒng)信躁比值的因素之一。為了在mGluR4/HEK-293/G15細胞株得到高的信躁比,本研究第一優(yōu)化了鈣熒光染料的孵育時刻。鈣熒光染料孵育時刻越長,就能得到越高的鈣流信號(數(shù)據(jù)沒有顯示)。在以下的試驗當(dāng)中,鈣熒光染料的時刻被選定為90min。為了評估由通用溶劑DMSO和NaOH引起的非特異性本底,DMSO和NaOH耐受性通過鈣流檢測試驗被測定。試驗結(jié)果表明,當(dāng)DMSO和NaOH終濃度分別達到0.5%(圖1A)和0.2%(圖1B)時,關(guān)于在mGluR4/HEK-293/G15細胞株上進行鈣流檢測試驗沒有明顯的阻礙。因此,在后續(xù)試驗中,DMSO和NaOH的終濃度分別被選定為0.5%和0.2%。圖1DMSO(A)和NaOH(B)耐受性檢測Fig.1DMSO(A)andNaOH(B)tolerancedetection.AssayswereperformedinduplicateandmonitoredwithFlexStationplatereader.2.3mGluR4/HEK-293/G15細胞株功能性檢測在以上優(yōu)化后的實驗條件下,分別用不同濃度的mGluR4興奮劑(L-Glu、L-AP4和L-SOP)和拮抗劑(MSOP和MPPG)作用于mGluR4/HEK-293/G15細胞株,檢測細胞內(nèi)鈣離子濃度的變化,以證實mGluR4選擇模型的功能活性。第一,通過胞內(nèi)鈣流檢測試驗,得到3種興奮劑(L-Glu、L-AP4和L-SOP)的劑量依靠效應(yīng)曲線。結(jié)果表明,這3個興奮劑的半數(shù)有效刺激濃度(EC50)均與文獻報道相符(表1)。L-AP4是最強的興奮劑,其EC50為0.27mol/L(圖2);L-SOP和L-Glu次之,EC50分別為2.85mol/L和12.04mol/L(圖2)。圖2興奮劑對mGluR4細胞的劑量效應(yīng)Fig.2DoseresponseofagonistonmGluR4cellline.AssayswereperformedinduplicateandmonitoredwithFlexStationplatereader.Datapointsrepresentmeans±SEM.EC50valuewasdeterminedusingGraphPadPrism5software.另外,通過鈣流檢測方法,本研究測試了2個拮抗劑MSOP和MPPG。用10mol/L的刺激劑L-Glu刺激細胞內(nèi)鈣的開釋,同時用不同濃度的拮抗劑抑制此胞內(nèi)鈣的開釋,從而得到拮抗劑的劑量依靠曲線(圖3),并與文獻報道相符(表1)。MSOP和MPPG的半數(shù)有效抑制濃度(IC50)分別是32.83mol/L和59.90mol/L(圖3)。2.4mGluR4/HEK-293/G15細胞株穩(wěn)固性考察眾所周知,有效性、特異性、可溶解性、穩(wěn)固性、毒性以及化合物和靶體之間的作用機制關(guān)于基于細胞水平的檢測方法至關(guān)重要。一旦靶體選定,穩(wěn)固表達該靶體的細胞系就要被構(gòu)建同時在傳代培養(yǎng)時不被丟失。為了考察該mGluR4/HEK-293/G15細胞株的穩(wěn)固性,mGluR4/HEK-293/G15細胞在60g/mLZeocin的條件下培養(yǎng)至20代以上,凍存1代、5代、10代和20代細胞。之后同時檢測L-Glu或MSOP在這幾代的mGluR4細胞上的作用。如圖4所示,興奮劑L-Glu的EC50(圖4A,3.51mol/L~8.82mol/L)和拮抗劑MSOP的IC50(圖4B,19.30mol/L~37.19mol/L)在不同代數(shù)細胞之間基本保持一致(表2)。由此可見,該mGluR4/HEK-293/G15細胞株是穩(wěn)固的。表1mGluR4興奮劑和拮抗劑作用活性總結(jié)(單位:mol/L)TableSEQTable.\*ARABIC1PotencyofagonistandantagonistofmGluR4(mol/L)CategoryCompoundnameReportedOurdataReferenceEC50IC50EC50IC50AgonistL-Glu5~38/12.04/12,13,14,15L-AP40.3/0.27/16L-SOP2.7/2.85/8,12,13,16,17AntagonistMSOP/11.44/32.8318MPPG/110/59.9013圖3拮抗劑對mGluR4細胞的劑量效應(yīng)Fig.3DoseresponseofantagonistonmGluR4cellline.AgonistL-Glu(10mol/L)wasusedtoinduceacalciuminflux.ForMPPG,finalconcentrationofNaOHis0.2%.AssayswereperformedinduplicateandmonitoredwithFlexStationplatereader.Datapointsrepresentmeans±SEM.IC50valuewasdeterminedusingGraphPadPrism5software.表2mGluR4興奮劑L-Glu和拮抗劑MSOP作用于不同代細胞之間的活性總結(jié)(單位:mol/L)Table2PotencyofL-GluandMSOPatdifferentpassagesofcells(mol/L)PotencyP1P5P10P20L-GluEC503.515.454.578.82MSOPIC5037.1928.6719.3024.182.5Z’因子評估高質(zhì)量的檢測系統(tǒng)以及強有力的數(shù)據(jù)分析為鑒定真正有活性的化合物提供了保證。Z’因子是一種被大眾所廣泛同意的既簡便又有用的檢測系統(tǒng)評判參數(shù)[19,20]。Z’因子的大小介于–∞和1之間。當(dāng)0.5＜Z’＜1時,意味著此檢測系統(tǒng)是一個有效的系統(tǒng);當(dāng)0＜Z’＜0.5時,意味著此檢測系統(tǒng)差不多可行;當(dāng)Z’=0時,意味著此檢測系統(tǒng)模棱兩可;當(dāng)Z’＜0時,意味著此檢測系統(tǒng)全然不可行[20]。在此次試驗當(dāng)中,圖4mGluR4細胞株穩(wěn)固性檢測Fig.4StabilityofmGluR4cellline.Doseresponsecurvesofagonist-L-Glu(A)andantagonist-MSOP(B)forpassages1,5,10and20wereshowed.AgonistL-Glu(10mol/L)wasusedtoinduceacalciuminflux.Thecellwastesteduptopassage20.AssayswereperformedinduplicateandmonitoredwithFlexStationplatereader.Datapointsrepresentmeans±SEM.EC50andIC50valueweredeterminedusingGraphPadPrism5software.圖5Z’因子檢測Fig.5Z’factordetermination.mGluR4/HEK-293/G15celllinewasstimulatedwith100mol/LL-Glu(positive)andassaybuffer(negative).AssaysweremonitoredwithFlexStationplatereader.(A)96-wellplateformat.(B)384-wellplateformat.不僅檢測了用96-孔板進行鈣流檢測試驗時的Z’因子(圖5A),同時也用384-孔板進行了檢測(圖5B)。用300mol/L的L-Glu刺激mGluR4并引發(fā)鈣動員,用緩沖液作用于該細胞系以得到試驗背景,之后所得到的Z’因子分別為0.80和0.65,由此講明該mGluR4檢測系統(tǒng)適用于HTS。2.6模擬選擇進行HTS時,成千上萬的化合物都會用數(shù)塊96或384-孔板進行HTS選擇。本研究模擬了在96-孔板上的選擇過程。用上述建立好的mGluR4鈣流檢測方法選擇74種已知化合物(包括小分子化合物及具有活性的多肽)?；衔镉肈MSO進行配制,其終濃度是10mol/L,DMSO終濃度是0.5%,以滿足HTS的要求。模擬選擇結(jié)果顯示,在該96-孔板不同位置所設(shè)置的陽性對比(300、100、30和10mol/LL-Glu)及陰性對比(緩沖液)都檢測到了相應(yīng)的鈣信號(圖6)。從中也得到了一些關(guān)于該mGluR4有活性的化合物。總之,該模擬選擇結(jié)果顯示,mGluR4檢測方法適用于HTS以鑒定mGluR4的活性化合物。圖6模擬選擇Fig.6Spikingtest.ThetestwasperformedandmonitoredwithFlexStationIIplatereader.Scatterplotofspikingdatatestofthepositivecontrolandcompoundwereshowed.Positive:300mol/LL-Glu;Negative:assaybufferwith0.5%DMSO.3討論mGluR4是結(jié)合于Gi類的G蛋白,目前對Gi偶聯(lián)的G蛋白偶聯(lián)受體能夠通過同位素結(jié)合試驗,cAMP定量試驗、報告基因系統(tǒng)、熒光檢測鈣流等方法進行檢測。與其他檢測方法相比,通過熒光檢測胞內(nèi)鈣水平變化的方法來選擇GPCR的興奮劑/拮抗劑靈敏度高、耗時短、使用范疇更廣泛、操作更簡便。在本研究中,選擇HEK-293/G15作為表達人源mGluR4的母細胞。這是因為HEK-293細胞差不多被證明專門適合于異源表達GPCRs,HEK-293細胞容易生長形成單層細胞,具有專門強的生長活性和較強的貼壁能力。更重要的是,Gi類的G蛋白不能引起細胞內(nèi)的鈣流變化;而HEK-293/G15細胞中的G15能夠?qū)GluR4偶聯(lián)到PLC通路上,繼而能夠通過檢測鈣流的變化來間接反應(yīng)mGluR4的作用。由圖2能夠看出,在興奮劑L-AP4的作用下,mGluR4/HEK-293/G15細胞產(chǎn)生了內(nèi)部鈣流變化,同時呈劑量依靠關(guān)系,EC50大約為0.27mol/L,而母細胞HEK-293/G15卻沒有類似明顯的胞內(nèi)鈣流的變化。通過人源mGluR4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK-293/G15細胞,建立了人源mGluR4穩(wěn)固表達的細胞系。第一,使用興奮劑L-Glu對mGluR4/HEK-293/G15鈣流檢測試驗時的一些系統(tǒng)檢測因子,包括鈣熒光染料的孵育時刻,DMSO耐受性和NaOH耐受性進行了優(yōu)化。其次,使用mGluR4特異性的興奮劑/拮抗劑對mGluR4/HEK-293/G15進行了驗證。結(jié)果顯示,那個重組細胞系適用于發(fā)覺mGluR4的興奮劑/拮抗劑。更重要的是,本研究對該檢測系統(tǒng)進行了統(tǒng)計學(xué)意義上的評估。在96及384-孔板上所得到的Z’因子均大于0.5,這強有力地證明mGluR4細胞系適用于HTS。最后,74個化合物在96-孔板上通過模擬選擇,所有的陽性及陰性對比都得到了確信的結(jié)果,這些講明該mGluR4檢測系統(tǒng)能夠?qū)ｉT靈敏的用于HTS,從而鑒定mGluR4活性化合物。綜上所述,本研究第一次用HEK-293/G15母細胞建立了一個穩(wěn)固高表達人源mGluR4的重組細胞系:mGluR4/HEK-293/G15。那個細胞系不僅適用于細胞功能性研究,而且適用于結(jié)合試驗中的膜蛋白的提取,增強了配體特異性的結(jié)合。本研究所建立的mGluR4的重組細胞系是一個靈活的、穩(wěn)固的、有效的、適用于HTS體系,能夠用于藥理學(xué)分析、功能性研究以及選擇mGluR4的興奮劑/拮抗劑。REFERENCESTanabeY,MasuM,IshiiT,etal.Afamilyofmetabotropicglutamatereceptors.Neuron,1992,8:169179.YangZQ.AgonistsandantagonistsforgroupIIImetabotropicglutamatereceptor6,7and8.CurrTopMedChem,2005,5:913918.KewJN,KempJA.Ionotropicandmetabotropicglutamatereceptorstructureandpharmacology.Psychopharmacology(Berl),2005,179(1):429.MathiesenJM,SvendsenN,Br?uner-OsborneH,etal.Positiveallostericmodulationofthehumanmetabotropicglutamatereceptor4(hmGluR4)bySIB-1893andMPEP.BrJPharmacol,2003,138:10261030.FerragutiF,ShigemotoR.Metabotropicglutamatereceptors.CellTissueRes,2006,326(2):483504.RosemondE,WangM,YaoY,etal.MolecularbasisforthedifferentialagonistaffinitiesofgroupIIImetabotropicglutamatereceptors.MolPharmacol,2004,66:834842.KowalD,NawoschikS,OchalskiR,etal.Functionalcalciumcouplingwiththehumanmetabotropicglutamatereceptorsubtypes2and4bystableco-expressionwithacalciumpathwayfacilitatingG-proteinchimerainChinesehamsterovarycells.BiochemPharmacol,2003,66(5):785790.TanabeY,NomuraA,MasuM,etal.Signaltransduction,pharmacologicalproperties,andexpressionpatternsoftworatmetabotropicglutamatereceptors,mGluR3andmGluR4.JNeurosci,1993,13(4):13721378.Brabet,I,ParmentierML,deColleC,etal.ComparativeeffectofL-CCG-I,DCG-IVandgamma-carboxy-L-glutamateonallclonedmetabotropicglutamatereceptorsubtypes.Neuropharmacology,1998,37:10431051.GomezaJ,MaryS,BrabetI,etal.CouplingofmGIuR2andmGIuR4toGa15,Ga16andchimericGaq/iproteins:characterizationofnewantagonists.MolPharmacol,1996,50:923930.KunapuliP,RansomR,MurphyKL,etal.Developmentofanintactcellreportergenebeta-lactamaseassayforGprotein-coupledreceptorsforhigh-throughputscreening.AnalBiochem,20