慢性低O2高CO2對大鼠認知功能與CREB表達的影響

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【摘要】目的:探討慢性低O2高CO2誘導(dǎo)大鼠空間學(xué)習(xí)記憶改變及其可能機制。方法:將清潔級雄性SD大鼠隨機分為對照組(C組，n=18)，低O2高CO22周組（2HH組，n=20）和低O2高CO24周組（4HH組，n=20）。Morris水迷宮觀察動物空間學(xué)習(xí)記憶的變化，采用RT-PCR法觀察大鼠海馬及皮層區(qū)環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)單元結(jié)合蛋白(cAmpresponseelementbindingprotein，CREB)mRNA的表達情況。結(jié)果:與C組比較，模型組大鼠尋找障臺的平均逃避潛伏期延長：2HH組(38.59±8.35)s，4HH組(60.59±17.28)s；游泳總距離增加：2HH組（9893.4±1958.2）mm，4HH組（18077.6±6878.9）mm。模型組大鼠海馬區(qū)CREBmRNA的表達較NC組相比均有減少，其中4HH組減少了43.1%(P0.01)。結(jié)論:慢性低O2高CO2可導(dǎo)致大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力下降，并可能與海馬區(qū)的CREBmRNA表達下調(diào)有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】慢性低O2高CO2學(xué)習(xí)記憶CREB

Abstract:Objective:Toexploretheeffectofchronichypoxichypercapniaonthealterationoflearning-memoryandthepossiblemechanism.Methods:MaleSDratswererandomlydividedintothreegroups:controlgroup(C,n=18),2-week(2HH,n=18),and4-week(4HH,n=20)group.RatsinspatialreferencetasklearningwereassessedbytheMorriswatermaze.TheexpressionofCREBmRNAwasdeterminedwithhybridizationinsitu.Results:ComparedwithNCgroup,ratsexposedtochronichypoxichypercapniadisplayedsignificantimpairmentintheirperformanceassessedbytwomeasures:meanescapelatencies(2HH:38.59±8.35s，4HH:60.59±17.28s)andswimpathdistances(2HH：9893.45±1958.16mm，4HH：18077.57±6878.85mm).TheexpressionofCREBmRNAinthehippocampusinthemodelgroupswaslowerthanthoseintheNCgroup,especially,decreasedby21.4%in4HH(P0.01).Conclusion:ChronichypoxichypercapniacanaffecttheexpressionofCREBmRNAwhichmaybethefactorscontributingtolearning-memoryimpairment.

Keywords:chronichypoxichypercapnia;learning-memory;CREB

慢性阻塞性肺?。╟hronicobstructivepulmonarydisease，COPD）急性期并發(fā)肺性腦病已被大家所認識和重視，但COPD患者慢性腦功能的損害卻未引起人們足夠的關(guān)注。由于COPD是多因素誘發(fā)的臨床綜合征,其發(fā)病機制復(fù)雜,使得動物模型模擬COPD的病理變化和臨床特征十分困難。雖然國外已有研究表明，大多數(shù)COPD患者伴有明顯的認知功能障礙[1]，但也僅限于臨床研究，動物實驗研究較少。已知慢性低O2高CO2是該疾病發(fā)生發(fā)展過程中重要的病理生理環(huán)節(jié)。本實驗采用慢性低O2高CO2性肺動脈高壓模型觀察大鼠空間學(xué)習(xí)記憶的變化，并檢測海馬區(qū)的CREBmRNA的表達，報道如下。

1材料和方法

1.1主要材料常壓低02高CO2艙（溫州醫(yī)學(xué)院肺心病研究室制），CYESIl型O2、CO2氣體測定儀（上海市嘉定學(xué)聯(lián)儀表廠），Medlab生物信號采集處理系統(tǒng)（南京美易科技有限公司），Morris水迷宮及視頻分析軟件（上海吉量生物軟件有限公司），梯度PCR儀（Effendorf公司），RT-PCR試劑盒（Fermentas公司）。

1.2動物分組及模型制備[2]將SD大鼠58只，體重180～220g，隨機分為3組：即正常對照組(C組，n=18)，低O2高CO22周組（2HH組，n=20），低O2高CO24周組（4HH組，n=20）。將模型組大鼠置于常壓低O2高CO2艙內(nèi)，通過N2調(diào)節(jié)艙內(nèi)O2濃度，維持O2濃度在9%～11%，CO2濃度為5.5%～6.5%，每天8h，每周6d。動物飼養(yǎng)到規(guī)定時間后，用戊巴比妥鈉(35mg/kg)腹腔麻醉，右心導(dǎo)管法測定平均肺動脈壓(mPAP)、平均頸動脈（mCAP）。

1.3Morris水迷宮行為學(xué)檢測Morris水迷宮由一直徑130cm，高50cm的圓形水池組成，水深30cm。將水池分成4個象限,將站臺固定置于第2象限中央，浸沒于水下2cm，水溫（25±1）℃。水池周圍貼有豐富的參照線索供大鼠用來定位平臺。迷宮上方裝有攝像頭，大鼠行程可被記錄下來。

各組大鼠稱量體重后，行Morris水迷宮實驗。實驗共進行5d，每天訓(xùn)練分上下午兩次。大鼠按順序從4個等分水池的點放入池中,放時使大鼠面向池壁,記錄大鼠從入水到找到并爬上平臺的時間。每次在平臺上休息30s再行下一次檢測,如果在120s內(nèi)大鼠仍未能找到平臺,則將其引導(dǎo)到平臺,潛伏期記為120s。各統(tǒng)計數(shù)據(jù)由上海吉量軟件自動分析生成。學(xué)習(xí)記憶成績用兩個參數(shù)反映：平均逃避潛伏期（meanescapelatency）和游泳總距離即找到平臺游泳的軌跡(swimpathdistance)。

1.4反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)CREB引物根據(jù)Genebank資料，利用primer5.0引物設(shè)計軟件確定最優(yōu)引物，然后經(jīng)Blast匹對，由上海生工生物有限公司合成。CREB引物：上游為5’－TCAGCCGGGTACTACCATTC-3’；下游為5’－TCTCTTGCTGCTTCCCTGTT-3’。擴增產(chǎn)物片斷長252bp。以GAPDH為內(nèi)參照，引物序列:上游為5’－TGCCACTCAGAAGACTGTGG-3’；下游為5’-CAACGGATACATTGGGGGTA－3’。擴增產(chǎn)物片斷長182bp。

取大鼠海馬腦組織勻漿后，提取1μlRNA樣品，采用紫外分光光度法測定RNA純度，以O(shè)D260/OD280的比值表示，要求比值在1.8～2.0之間。取2μgRNA，采用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶,按20μl體系，42℃，逆轉(zhuǎn)錄1h。多聚酶反應(yīng)總體系為20μl（包含GAPDH引物），所有引物退火溫度為59℃，擴增30個循環(huán)，脂糖電泳，溴乙啶染色、紫外燈照相、凝膠圖像掃描。以CREBmRNA與內(nèi)參GAPDHmRNA灰度值比值（CREB/GAPDH）反應(yīng)CREBmRNA表達水平。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理方法全部數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS11.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)均以（±s）表示，經(jīng)正態(tài)性檢驗后，多組間比較采用方差分析，用HomogeneityofVariancesTest進行方差齊性檢驗，方差齊者用LSD檢驗，方差不齊者用Dennett’sT3檢驗。

2結(jié)果

2.1低O2高CO2對大鼠mPAP、mCAP的影響慢性低O2高CO2各組mPAP均高于正常對照組（P均0.01），隨著時間的延長，mPAP在慢性低O2高CO22w時達最高，各組間mCAP無顯著性差異（P0.05），（見表1）。

2.2低O2高CO2對各組大鼠空間學(xué)習(xí)記憶的影響與正常對照組比較，慢性低O2高CO2各暴露組在Morris水迷宮中空間學(xué)習(xí)記憶能力下降：平均逃避潛伏期延長和游泳總距離增加。其中，以4HH組最明顯，P0.01。

2.3RT-PCR法檢測各組大鼠海馬及皮層區(qū)CREB表達的變化正常對照組大鼠離體海馬及皮層區(qū)CREBmRNA表達水平較高，與內(nèi)參GAPDH基因水平灰度值比值（CREB/GAPDH）分別為（4.84±0.84）、（2.74±0.62）。低O2高CO2各組CREBmRNA表達水平減低，與對照組相比較，其中4HH組表達減少了43.1%(P0.01)。（見表3、圖1-2）。

3討論

不同動物模型用于研究低O2對學(xué)習(xí)記憶的影響，主要有單純低壓低O2和間斷低O2動物模型。經(jīng)過模擬不同海拔高度的2h和6h低壓低O2處理，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)動物在Morris水迷宮中的空間參考和工作記憶，空間記憶的受損，其受損程度與模擬的海拔高度有關(guān)，海拔越高越嚴重[3]。另有實驗設(shè)計的一種間歇性低O2(10%O2和21%O290s鐘交替供應(yīng))連續(xù)處理成年大鼠7d后，大鼠在水迷宮中的空間學(xué)習(xí)能力受到嚴重損害[4]。我們的研究也發(fā)現(xiàn)：大鼠在Morris水迷宮中尋找障臺的平均逃避潛伏期延長和游泳總距離增加，并隨暴露時間的延長，其空間學(xué)習(xí)能力影響越明顯。但是，也有少數(shù)資料顯示一定條件的低O2可以促進動物學(xué)習(xí)記憶和增強運動能力[5]。這種矛盾結(jié)果可能與各實驗采用的低O2程度和持續(xù)時間不同有關(guān)。在本實驗中，由于疊加了高CO2因素，可能對學(xué)習(xí)記憶的損害更加明顯。

慢性低O2高CO2可能通過改變動物的一些生理變化而影響學(xué)習(xí)記憶能力，如睡眠結(jié)構(gòu)的紊亂、體重、腦血流的變化等。為排除上述影響因素，本實驗在Morris水迷宮作業(yè)前對各組大鼠稱重，發(fā)現(xiàn)無顯著性差異。模型動物的mCAP無明顯變化，說明其體循環(huán)壓較穩(wěn)定，也間接提示腦血供基本正常。

CREB是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，其調(diào)節(jié)啟動子中具有CRE基因轉(zhuǎn)錄。cAMP或鈣濃度的升高等多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可啟動CREB的磷酸化及其活化作用。這種核轉(zhuǎn)錄因子具有調(diào)節(jié)包括學(xué)習(xí)記憶在內(nèi)的廣泛的生物學(xué)功能，是細胞內(nèi)多種信號通路的一種關(guān)鍵成分。CREB屬于轉(zhuǎn)錄因子bZIP超家族的一員。轉(zhuǎn)錄活化域主要是激酶誘導(dǎo)性結(jié)構(gòu)域KID域(P框)。KID域內(nèi)包含多種蛋白激酶的磷酸化識別位點，例如PKA和CaMK磷酸化識別位點Ser133，及CKⅡ的識別位點Ser133和Ser129。KID磷酸化是CREB活化的關(guān)鍵條件，被認為在轉(zhuǎn)錄的起始過程至關(guān)重要,活化后的CREB通過一系列機制啟動靶基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄，繼而調(diào)節(jié)腦的突觸結(jié)構(gòu)和功能的變化[6]。

長期記憶形成過程不但需要新蛋白質(zhì)合成而且也需要新基因的轉(zhuǎn)錄，而構(gòu)成長期記憶電生理基礎(chǔ)的突觸的LTP也同樣需要這兩個過程。在識別參與學(xué)習(xí)記憶和可塑性分子的研究中,發(fā)現(xiàn)軟體動物海兔可顯示出一種稱為長時程易化的類似記憶的敏化行為，而且表明這種長時程易化需要cAMP-CREB通路的活動，從而提出了首個關(guān)于學(xué)習(xí)記憶的活動依賴性基因表達的機制[7]。

現(xiàn)今越來越多的實驗證據(jù)表明,CREB參與學(xué)習(xí)記憶的過程，且發(fā)揮了重要作用。無論在可塑性形成過程的皮質(zhì)神經(jīng)元，還是在長時程增強刺激和記憶訓(xùn)練任務(wù)反應(yīng)中的海馬神經(jīng)元均可檢測到明顯的CREB磷酸化和CRE報告基因的表達[8]。向大鼠海馬區(qū)注入CREB的反義寡核苷酸導(dǎo)致其在Morris水迷宮中的空間學(xué)習(xí)缺陷[9]。Gozal等[10]研究表明在單純間斷低O2環(huán)境下，成年大鼠較幼年大鼠空間學(xué)習(xí)障礙更加明顯，同時磷酸化的CREB表達水平更低?？梢?，CREB表達水平與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)，能在一定程度上反映動物的學(xué)習(xí)記憶能力。

本研究結(jié)果顯示，慢性低O2高CO2肺動脈高壓大鼠海馬及皮層區(qū)CREB表達水平減低，以4HH組海馬最顯著。結(jié)合Morris水迷宮結(jié)果的變化，提示CREB可能是慢性低O2高CO2導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶障礙的神經(jīng)生物學(xué)機制之一。雖然，在本研究中，我們未能直接測定磷酸化CREB蛋白表達水平變化，但采用RT-PCR技術(shù)結(jié)合灰度值的變化對總CREB表達作了相對半定量分析，它的變化在一定程度上也反映了磷酸化CREB表達量的變化。

短暫的單純低O2/缺血損傷可誘導(dǎo)磷酸化的CREB快速增高，并促使CRE的轉(zhuǎn)錄，然而，這種低氧誘導(dǎo)的磷酸化的CREB升高是暫時性的；若持續(xù)低O2或缺血，磷酸化的CREB水平將下降，核活性降低[11]。在本實驗中，雖然未涉及細胞信號傳導(dǎo)通路的研究，但我們推測低O2高CO2的程度和持續(xù)時間可能是CREB磷酸化的信號激活途徑的重要決定因素。

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