醫(yī)學(xué)標(biāo)書范文3

PAGE0PAGE1河南省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目申請書姓名：JiangDongbao項(xiàng)目名稱：FGFR4表達(dá)對結(jié)直腸癌細(xì)胞株生物學(xué)行為的影響及作用機(jī)制的研究單位：鄭州大學(xué)聯(lián)系電話：填報(bào)說明請根據(jù)自己的專業(yè)及研究方向，針對某具體臨床問題，結(jié)合所學(xué)習(xí)臨床科研方法的一種或幾種寫出一份科研設(shè)計(jì)。完成后，文件以個(gè)人姓名命名，發(fā)至：1736601711@?？己顺煽円涝O(shè)計(jì)書優(yōu)略評定。截至日期2013年11月8日。一、項(xiàng)目的立項(xiàng)依據(jù)和意義（說明國內(nèi)外相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)發(fā)展水平和趨勢等）結(jié)直腸癌（colorectalcancer，CRC）是起源于結(jié)直腸黏膜上皮的惡性腫瘤，是臨床最常見的惡性腫瘤之一。我國每年結(jié)直腸癌新發(fā)病例超過25萬，死亡病例約14萬，新發(fā)與死亡病例均占全世界同期結(jié)直腸癌病例的20%[1]。局部進(jìn)展期結(jié)直腸癌5年癌癥相關(guān)生存率為70%，而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的晚期結(jié)直腸癌5年生存率僅為12%，且生活質(zhì)量低。目前結(jié)直腸癌新輔助化療、輔助化療、姑息化療方案很多，如ECF、DCF、奧沙利鉑+氟尿嘧啶、順鉑+氟尿嘧啶等，但其最核心的藥物是氟尿嘧啶，在此基礎(chǔ)上聯(lián)合其他化療藥物。近年來，靶向藥物在結(jié)直腸癌治療領(lǐng)域的研究和應(yīng)用成為一大熱點(diǎn)，作用于EGFR的愛必妥、作用于VEGF的貝伐單抗、針對Her-2的赫賽汀等已進(jìn)入胃癌治療的臨床實(shí)驗(yàn)中。成纖維生長因子受體（FGFRs）是一個(gè)多基因家族,屬免疫球蛋白基因超家族成員,是分布在多種細(xì)胞上的膜蛋白，F(xiàn)GFR家族成員有FGFR1、FGFR2、FGFR3以及FGFR4。它們的特點(diǎn)是在胞膜外含有3個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域，一個(gè)疏水的跨膜結(jié)構(gòu)，胞漿內(nèi)含有兩個(gè)呈串聯(lián)結(jié)構(gòu)的酪氨酸激酶功能區(qū)。FGFR1～3在體內(nèi)是廣泛分布的,而FGFR4主要在發(fā)育早期大量表達(dá),而且主要分布在視網(wǎng)膜和腎臟。編碼FGFR4蛋白的FGFR4基因位于5號染色體，5q35.1-qter，基因編號為2264。FGFR4蛋白是一類具有自身磷酸化活性的跨膜酪氨酸激酶受體中的一種,在胚胎發(fā)育、組織修復(fù)和血管形成等進(jìn)程中起著十分重要的作用[2,3]。但FGFR4在惡性腫瘤中的研究相對較少，Pubmed檢索該分子在胃癌中的研究僅見幾篇報(bào)道，而且研究尚不深入。但有學(xué)者認(rèn)為，F(xiàn)GFR家族是在惡性腫瘤診治方面是一個(gè)新興的領(lǐng)域，有廣闊的應(yīng)用前景[4]。FGFR4在常見的惡性腫瘤如乳腺癌、胰腺癌、橫紋肌肉瘤及腎細(xì)胞癌中均呈高表達(dá)[5-7]。MeijerD等報(bào)道FGFR4表達(dá)是復(fù)發(fā)性乳腺癌患者的獨(dú)立的預(yù)后因素[8]；Milano等研究亦認(rèn)為FGFR4可以預(yù)測三苯氧胺治療乳腺癌的療效[9]。Gowardhan等[10]研究報(bào)道，與良性增生相比，F(xiàn)GFR4在前列腺癌中的表達(dá)顯著上調(diào)；FGFR4的表達(dá)與Gleason評分相關(guān)；生存分析顯示，F(xiàn)GFR4過表達(dá)與較差的預(yù)后相關(guān)，無病生存期縮短。HoHK等對57對肝細(xì)胞肝癌組織及對應(yīng)的正常組織進(jìn)行realtimePCR定量檢測FGFR4在mRNA水平的表達(dá)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，F(xiàn)GFR4的表達(dá)與患者的主要臨床病理資料無相關(guān)性，可能是由于樣本量較小[11]。Streit等[12]通過免疫組化技術(shù)對137例惡性黑色素瘤組織標(biāo)本進(jìn)行FGFR4蛋白水平表達(dá)進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，F(xiàn)GFR4在惡性黑色素瘤組織標(biāo)本中的表達(dá)率為45%，F(xiàn)GFR4的表達(dá)與腫瘤臨床分期、微潰瘍形成、原發(fā)灶的數(shù)目、總生存期及無病生存期均有明顯相關(guān)性，作者認(rèn)為FGFR4蛋白的表達(dá)可作為惡性黑色素瘤進(jìn)展的潛在指標(biāo)。自2002年，Bange等[13]發(fā)現(xiàn)了FGFR4Gly388Arg這一胚系多態(tài)性后，該SNP現(xiàn)已成為了一個(gè)研究的熱點(diǎn)。該SNP是位于FGFR4第9外顯子388密碼子上，堿基G轉(zhuǎn)變?yōu)锳，導(dǎo)致了FGFR4的氨基酸序列發(fā)生了變化，即388位氨基酸由甘氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榫彼幔撐稽c(diǎn)位于FGFR4的高度保守序列中。1.實(shí)施方案（1）設(shè)計(jì)4個(gè)FGFR4RNAi靶點(diǎn)構(gòu)建到慢病毒載體，進(jìn)而小量包裝秤病毒顆粒。然后感染SW620和HCT116結(jié)直腸癌，通過定量PCR和Westernblot法檢測FGFR4在mRNA和蛋白水平的表達(dá)，篩選出干擾效果最佳的siRNA，進(jìn)行大量包裝，形成FGFR4siRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株，F(xiàn)GFR4持續(xù)低表達(dá)；構(gòu)建FGFR4過表達(dá)慢病毒載體，進(jìn)而包裝成病毒顆粒,然后感染結(jié)直腸癌細(xì)胞株，形成FGFR4過表達(dá)細(xì)胞株，F(xiàn)GFR4持續(xù)高表達(dá)，以備后續(xù)功能實(shí)驗(yàn)。2.對FGFR4siRNA穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株和FGFR4過表達(dá)細(xì)胞株，分別以各自未行處理的細(xì)胞株作為對照，進(jìn)行一系列的體外功能實(shí)驗(yàn)，以評價(jià)FGFR4的上調(diào)和下調(diào)對結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，包括增殖實(shí)驗(yàn)、克隆實(shí)驗(yàn)、侵襲實(shí)驗(yàn)、凋亡實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞周期的變化；同時(shí)在分子水平進(jìn)行Westernblot檢測，以顯示不同處理后，細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡及細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)的變化，如MMP-2、p27、CyclinD1及Bcl-xl等。3.分別將FGFR4siRNA穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株、FGFR4過表達(dá)細(xì)胞株和相應(yīng)的未處理的結(jié)直腸癌細(xì)胞株皮下注射至裸小鼠（nu/nu）背部,構(gòu)建成裸小鼠結(jié)直腸癌模型。接種6-8周后，觀測不同處理組成瘤體積、大小等增殖指標(biāo)的變化；對裸小鼠結(jié)直腸癌組織行免疫組化檢測，以了解不同處理組腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性相關(guān)分子表達(dá)的變化。2．研究方法和研究手段：1.標(biāo)本來源：結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116、SW620、DLD1、SW116、LS47等均購自上海中科院細(xì)胞所或ATCC，按說明書培養(yǎng)，利用DMEM培養(yǎng)基、Gibico美洲胎牛血清、100IU/ml青霉素及100ug/ml鏈霉素等培養(yǎng)細(xì)胞。BALB/c（nu-nu）裸小鼠擬購自中國科學(xué)院上海藥物研究所，合格證編號：滬動(dòng)合證字122號；日齡：28-32天；體重16-20；飼養(yǎng)于SPF級環(huán)境中。用于FGFR4RNAi和過表達(dá)實(shí)驗(yàn)的慢病毒載體擬購自上?；鶆P公司。2．利用軟件設(shè)計(jì)3-4個(gè)FGFR4RNAi靶點(diǎn)，構(gòu)建到慢病毒載體上，進(jìn)而包裝成病毒顆粒，然后感染FGFR4高表達(dá)的結(jié)直腸癌細(xì)胞株，經(jīng)RT-PCR和Westernblot驗(yàn)證干擾效率，制備成FGFR4RNAi穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。同樣，運(yùn)用慢病毒載體構(gòu)建FGFR4過表達(dá)結(jié)直腸癌細(xì)胞株。3.利用流式細(xì)胞儀、CCK-8及侵襲小室等對FGFR4RNAi穩(wěn)轉(zhuǎn)株和FGFR4過表達(dá)細(xì)胞株進(jìn)行體外功能實(shí)驗(yàn)，包括增殖實(shí)驗(yàn)、克隆實(shí)驗(yàn)、侵襲實(shí)驗(yàn)、凋亡實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞周期的變化；同時(shí)在分子水平進(jìn)行Westernblot檢測結(jié)直腸癌生物特性相關(guān)分子表達(dá)的變化。4．將FGFR4RNAi穩(wěn)轉(zhuǎn)株、FGFR4過表達(dá)細(xì)胞株及相應(yīng)的未感染細(xì)胞株分別皮下注射入裸小鼠背部，構(gòu)建成裸鼠結(jié)直腸癌模型，進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。觀測成瘤體積等細(xì)胞增殖指標(biāo)，利用免疫組化技術(shù)檢測FGFR4不同表達(dá)的裸鼠結(jié)直腸癌模型相關(guān)分子表達(dá)的變化。3.技術(shù)路線見圖一有效靶點(diǎn)大量包裝有效靶點(diǎn)大量包裝設(shè)計(jì)4個(gè)FGFR4基因RNAi靶點(diǎn)構(gòu)建到慢病毒載體載體小量包裝慢病毒顆粒感染HCT116、SW620結(jié)直腸癌細(xì)胞株FGFR4mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)干擾效率滿意FGFR4基因過表達(dá)慢病毒載體構(gòu)建過表達(dá)載體小量包裝慢病毒顆粒感染結(jié)直腸癌細(xì)胞株FGFR4mRNA和蛋白的表達(dá)qPCR和WesternBlotFGFR4過表達(dá)滿意基因功能研究成瘤的體積、大小等增值指標(biāo)的評價(jià)腫瘤組織MMP-2、p27、CyclinD1、BCL-xl表達(dá)的變化MMP-2、p27、CyclinD1、BCL-xl表達(dá)的變化增值、侵襲、凋亡、細(xì)胞周期變化等試驗(yàn)InvivoInvitro裸鼠結(jié)直腸癌模型的構(gòu)建圖一4.技術(shù)關(guān)鍵本課題關(guān)鍵技術(shù)在于FGFR4RNAi慢病毒載體的構(gòu)建及FGFR4RNAi穩(wěn)轉(zhuǎn)結(jié)直腸癌細(xì)胞株的建立；FGFR4過表達(dá)慢病毒載體的構(gòu)建及FGFR4過表達(dá)結(jié)直腸癌細(xì)胞株的建立；FGFR4不同表達(dá)的裸小鼠結(jié)直腸癌模型的構(gòu)建；一系列體外功能實(shí)驗(yàn)、體內(nèi)功能實(shí)驗(yàn)及相關(guān)分子檢測，探討FGFR4在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用三、實(shí)施本項(xiàng)目已具備的條件（說明已具備的試驗(yàn)手段、技術(shù)力量、前期科研基礎(chǔ)情況）（1）本課題申請人可獨(dú)立進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)操作主要包括：新鮮標(biāo)本DNA和RNA的抽提和測定；RT-PCR及realtimePCR的操作和結(jié)果分析；免疫組化技術(shù)的操作和結(jié)果分析；細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)；蛋白抽提、濃度測定、westernblot檢測靶分子蛋白表達(dá)及結(jié)果分析；siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)及轉(zhuǎn)染效率測定；CCK-8法檢測細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。流式細(xì)胞術(shù)的檢測，細(xì)胞免疫熒光技術(shù)在實(shí)驗(yàn)室老師協(xié)助下完成。（2).慢病毒構(gòu)建RNAi載體及過表達(dá)載體，是一些非常成熟的技術(shù)，F(xiàn)GFR4RNAi穩(wěn)轉(zhuǎn)株和FGFR4過表達(dá)細(xì)胞株的建立可請上海吉?jiǎng)P公司協(xié)助完成，而該公司為專業(yè)從事介導(dǎo)靶分子上調(diào)和下調(diào)病毒載體的制備和包裝，已和前期研究所在實(shí)驗(yàn)室有過多次成功合作先例；而構(gòu)建裸小鼠腫瘤模型亦是一項(xiàng)常用的研究技術(shù)，可請相關(guān)老師指導(dǎo)完成。（3）本課題在葉延偉老師的帶領(lǐng)下進(jìn)行，葉老師在復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院攻讀腫瘤學(xué)博士學(xué)位，期間在復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中心進(jìn)行了為期1年的博士課題實(shí)驗(yàn)部分的研究，獨(dú)立完成了一系列實(shí)驗(yàn)操作，實(shí)驗(yàn)結(jié)果已經(jīng)發(fā)表。碩博連讀期間以第一作者發(fā)表SCI論著5篇，最高IF為5.131分，累計(jì)IF達(dá)18分，分別發(fā)表于Cancer、Cancerletters、Annalsofsurgicaloncology、Journalofsurgicaloncology、digestivesurgery；此外，以共同作者發(fā)表國內(nèi)外論著10余篇。鄭州大學(xué)附屬第一醫(yī)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室韓超老師給予實(shí)驗(yàn)技術(shù)方面的幫助，韓老師是鄭州大學(xué)的在職博士，實(shí)驗(yàn)技術(shù)精湛，經(jīng)驗(yàn)豐富。（4）.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)設(shè)備齊全，各個(gè)實(shí)驗(yàn)領(lǐng)域均有專業(yè)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)員，為該研究順利實(shí)施提供了很好的平臺(tái)。四、項(xiàng)目的預(yù)期經(jīng)濟(jì)、社會(huì)和環(huán)境效益FGFR4在結(jié)直腸癌中的研究很少，而且不夠深入。本課題利用慢病毒載體構(gòu)建FGFR4RNAi穩(wěn)轉(zhuǎn)結(jié)直腸癌細(xì)胞株和FGFR4過表達(dá)細(xì)胞株，分別下調(diào)和上調(diào)FGFR4分子的表達(dá)，進(jìn)行一系列的體內(nèi)和體外功能實(shí)驗(yàn)，從而更全面、多角度地闡述FGFR4在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用，為結(jié)直腸癌新的治療靶點(diǎn)的篩選提供一些依據(jù)，目前國內(nèi)外文獻(xiàn)尚未見相關(guān)報(bào)道。五、項(xiàng)目實(shí)施的計(jì)劃進(jìn)度1.2016年1月-2016年6月：1）結(jié)直腸癌細(xì)胞株的培養(yǎng),包括HCT116、SW620及其他常見結(jié)直腸癌細(xì)胞株；篩選出FGFR4高表達(dá)和低表達(dá)結(jié)直腸癌細(xì)胞株。2）FGFR4RNAi慢病毒載體的構(gòu)建與包裝,結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW620、HCT116的感染,qPCR和westernblot反復(fù)檢測FGFR4RNAi慢病毒感染的效率，制備FGFR4RNAi穩(wěn)轉(zhuǎn)結(jié)直腸癌細(xì)胞株。3）FGFR4過表達(dá)慢病毒載體的構(gòu)建與包裝，慢病毒顆粒感染FGFR4低表達(dá)結(jié)直腸癌細(xì)胞株，制備FGFR4過表達(dá)結(jié)直腸癌細(xì)胞株。2.2016年7月-2016年12月：1）以FGFRRNAi穩(wěn)轉(zhuǎn)結(jié)直腸癌細(xì)胞株、FGFR4過表達(dá)結(jié)直腸癌細(xì)胞株和各自的未感染細(xì)胞株為研究對象，進(jìn)行一系列的體外功能實(shí)驗(yàn)。2）利用CCK-8法進(jìn)行增殖實(shí)驗(yàn)，克隆實(shí)驗(yàn)，transwell小室行侵襲實(shí)驗(yàn)，劃痕實(shí)驗(yàn)，流式細(xì)胞儀檢測早期凋亡和細(xì)胞株其分布的變化。3）利用Westernblot法檢測不同細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡及細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)的變化，包括MMP-2、p27、CyclinD1及Bcl-xl等。3.2017年1月-2017年6月1）將FGFRRNAi穩(wěn)轉(zhuǎn)結(jié)直腸癌細(xì)胞株、FGFR4過表達(dá)結(jié)直腸癌細(xì)胞株和各自的未感染細(xì)胞株行裸小鼠皮下注射，構(gòu)建FGFR4不同表達(dá)的裸小鼠結(jié)直腸癌模型。2）行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，測定成瘤體積、大小等細(xì)胞增殖的指標(biāo)；免疫組化檢測FGFR4不同表達(dá)的裸鼠結(jié)直腸癌標(biāo)本的細(xì)胞生物學(xué)特性相關(guān)蛋白表達(dá)的變化。3）將體內(nèi)體外功能實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以SCI論文形式撰寫，向Cancerresearch（IF8.234）或Oncogene（IF7.414）等雜志投稿。六、經(jīng)費(fèi)概算（1）試劑、藥品耗材費(fèi)試劑名稱規(guī)格數(shù)量（支）單元（元）金額（元）胎牛血清500ml5360018000MTT250mg5100500EDTA100g250100DMEM10*1L56003000胰蛋白酶1:250530150熒光二抗羊抗鼠IgG(進(jìn)口)100ul215003000熒光二抗羊抗兔IgG（進(jìn)口）100ul215003000LV3-FGFR4-homo-497200ul55002500LV3-FGFR4-homo-1679200ul55002500LV3-FGFR4-homo-1750200ul55002500LV3-FGFR4-homo-2074200ul55002500β-actin單克隆抗體20ul2250500SDS上樣緩沖液(還原,5x)10ml2100200合計(jì)384502.試劑，動(dòng)物耗材費(fèi)

名稱規(guī)格數(shù)量單價(jià)（元）金額（元）BALB/c（nu-nu）裸小鼠501005000細(xì)胞培養(yǎng)瓶25T20包1002000細(xì)胞培養(yǎng)板96孔100個(gè)121200細(xì)胞培養(yǎng)板24孔5箱8004000