人卵丘顆粒細(xì)胞和壁層顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)方法比較

何文;呂杰;李濤;文艷飛;韓嬋林;蔡柳洪【摘要】AIM:Toestablishaneffectivemethodforpurificationandcultureofhumancumuluscells(CCs)invitro,andtocomparethecharacteristicsbetweenCCsandmuralgranulosacells(MGCs).METHODS:Follicularfluidandcumuluscomplexfromthepatientsundergoingintracytoplasmicsperminjectionwerecollected.CCsweremechanicallycutfromcumuluscomplexandthendirectlyinoculatedonaPetridish,andMGCswereobtainedfromfollicularfluidthroughdensitygradientcentrifugation.Theexpressionoffolliclestimulatinghormonereceptor(FSHR)wasdeterminedbyimmunofluorescence.ThecellgrowthcurvesweremeasuredbyCCK-8assay.ThesecretionofestrogenwasdetectedbyELISA.RESULTS:Afterincubatedfor24h,theadherenceofCCswasobserved.CCsandMGCshadsimilargrowthcharacteristicsandFSHRexpression.ThesimilarcellgrowthcurveswereobservedbyCCK-8assayandtheresultsofELISAshowedthattheyhadcomparablesecretionofestrogen.CONCLUSION:DirectcultureofCCsmechanicallycuttingfromcumuluscomplexisaneffectivemethod.CCshadsimilargrowthcharacteristics,growthcurvesandsecretionofestro-gentoMGCsculturedinvitroandcouldbeasubstitutivesourceofgranulosacellsubsets.%目的:建立有效分離、提純及培養(yǎng)人卵丘顆粒細(xì)胞的方法，并與人壁層顆粒細(xì)胞的體外培養(yǎng)相比較.方法:收集卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射取卵時(shí)的卵泡液和直接機(jī)械分離卵母細(xì)胞所得的卵丘顆粒細(xì)胞復(fù)合物,直接將卵丘顆粒細(xì)胞復(fù)合物接種于培養(yǎng)皿中培養(yǎng).用密度梯度離心法分離卵泡液中的人壁層顆粒細(xì)胞.用免疫熒光法檢測(cè)卵泡刺激素受體(folliclestimulatinghormonereceptor,FSHR)的表達(dá);用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn);用ELISA檢測(cè)這2種顆粒細(xì)胞分泌雌激素的能力.結(jié)果:直接法所得人卵丘顆粒細(xì)胞培養(yǎng)24h后可貼壁，體外培養(yǎng)生長(zhǎng)狀態(tài)與人壁層顆粒細(xì)胞相似;免疫熒光檢測(cè)顯示兩者均表達(dá)FSHR;CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，兩者體外培養(yǎng)生長(zhǎng)曲線(xiàn)相似;ELISA結(jié)果顯示兩者分泌雌激素能力相當(dāng).結(jié)論:利用機(jī)械切割獲得人卵子周?chē)亚痤w粒細(xì)胞復(fù)合物直接培養(yǎng)的方法操作簡(jiǎn)單,獲得的人卵丘顆粒細(xì)胞具有與人壁層顆粒細(xì)胞相似的生長(zhǎng)狀態(tài)、生長(zhǎng)曲線(xiàn)以及雌激素分泌能力，可作為人顆粒細(xì)胞亞群體外培養(yǎng)方法的補(bǔ)充.【期刊名稱(chēng)】《中國(guó)病理生理雜志》【年(卷)，期】2018(034)002【總頁(yè)數(shù)】5頁(yè)(P380-384)【關(guān)鍵詞】人卵丘顆粒細(xì)胞;人壁層顆粒細(xì)胞;細(xì)胞分離;體外培養(yǎng);卵泡刺激素受體【作者】何文;呂杰;李濤;文艷飛;韓嬋林;蔡柳洪【作者單位】中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院生殖中心廣東廣州510630;中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院生殖中心廣東廣州510630;中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院生殖中心廣東廣州I510630;江門(mén)市中心醫(yī)院，中山大學(xué)附屬江門(mén)醫(yī)院生殖中心廣東江門(mén)529030;中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院生殖中心廣東廣州510630;中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院生殖中心廣東廣州510630【正文語(yǔ)種】中文【中圖分類(lèi)】R363;R711卵巢顆粒細(xì)胞是組成卵泡最大的細(xì)胞群，是女性生殖過(guò)程中發(fā)揮重要作用的一類(lèi)細(xì)胞。顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞之間存在廣泛的信息交流，二者形成功能上的統(tǒng)一體。研究表明，顆粒細(xì)胞的質(zhì)量下降或凋亡增多會(huì)影響激素和細(xì)胞因子的分泌，甚至影響卵母細(xì)胞的發(fā)育以及后續(xù)的胚胎質(zhì)量［1-2］。當(dāng)卵泡竇腔形成后，顆粒細(xì)胞分化可為卵丘顆粒細(xì)胞(cumuluscells，CCs)和壁層顆粒細(xì)胞(muralgranulosacells，MGCs)，這2種顆粒細(xì)胞在卵泡生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮著不同的作用［3-4］。MGCs是承擔(dān)卵巢分泌激素和細(xì)胞因子的主要功能細(xì)胞，主要通過(guò)旁分泌和自分泌的形式調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞發(fā)育過(guò)程［5］；CCs附著于卵母細(xì)胞，與卵母細(xì)胞形成一個(gè)結(jié)構(gòu)功能緊密的合胞體，通過(guò)復(fù)雜的細(xì)胞間鏈接機(jī)制參與影響卵泡發(fā)育［6］。人卵巢顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)模型的建立，不僅可運(yùn)用于女性生殖內(nèi)分泌和輔助生殖技術(shù)的研究，而且可應(yīng)用于女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的生理及藥物毒性等的研究。由于MGCs的原代培養(yǎng)樣本較易獲取，因此關(guān)于人MGCs體外建系的文獻(xiàn)報(bào)道較多，但由于提取CCs需要的樣本來(lái)源較難獲得和所需樣本量大等因素限制，因此關(guān)于人CCs體外建系的研究甚少。本實(shí)驗(yàn)依托中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院生殖中心充足的臨床樣本，選取進(jìn)行卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射(intracytoplasmicsperminjection,ICSI)技術(shù)治療的患者，用機(jī)械切割所得卵丘顆粒細(xì)胞復(fù)合物培養(yǎng)人CCs，并與人MGCs體外培養(yǎng)進(jìn)行對(duì)比，比較2種顆粒細(xì)胞建系的操作特點(diǎn)及細(xì)胞體外培養(yǎng)的生物學(xué)特性，旨在建立人CCs體外培養(yǎng)體系，作為人顆粒細(xì)胞亞群的補(bǔ)充。材料和方法1材料人淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll-PaquePLUS)、DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清(fetalbovineserum，F(xiàn)BS).W/鏈霉素、L-谷氨肽胺(GlutaMAXTM-I)、非必需氨基酸(nonessentialaminoacids，NEAA)、0.25%胰酶和PBS緩沖液均購(gòu)于Invitrogen;抗人卵泡刺激素受體（folliclestimulatinghormonereceptor,FSHR）抗體購(gòu)于R&DSystems；MOPS緩沖液購(gòu)于Vitrolife；驢抗小鼠熒光II抗購(gòu)于Abcam；TritonX-100、Tris-HCl和Tween-20購(gòu)于Amresco；4%多聚甲醛和正常山羊血清封閉液購(gòu)于BOSTER；Hoechst33342購(gòu)于碧云天；CCK-8試劑盒購(gòu)于Dojindo；雌激素檢測(cè)ELISA試劑盒購(gòu)于Elabscience。收集2016年11月~2017年4月于中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院生殖中心行ICSI治療的患者樣本共30例。所有患者均年齡介于25-35歲，基礎(chǔ)性激素水平在正常范圍內(nèi)，月經(jīng)第3天竇卵泡數(shù)在7-20個(gè)之間，均采用經(jīng)典黃體期長(zhǎng)方案超排卵，獲卵數(shù)＞20個(gè)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程所涉及卵泡液和卵丘顆粒細(xì)胞復(fù)合物均為患者治療過(guò)程中的醫(yī)療廢物，所有樣本均獲得患者的知情同意，項(xiàng)目的實(shí)施獲得中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。2方法2.1人卵丘顆粒細(xì)胞的分離、提純及培養(yǎng)對(duì)ICSI超排卵患者收集取卵后，常規(guī)進(jìn)行卵母細(xì)胞-卵丘顆粒細(xì)胞復(fù)合物機(jī)械切割處理，所得的卵丘顆粒細(xì)胞復(fù)合物（要求每次收集ICSI樣本獲卵數(shù)＞20個(gè)）用顆粒細(xì)胞培養(yǎng)基（含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基）于培養(yǎng)皿中洗滌2次，以去除撿卵過(guò)程中的MOPS液和沖洗液中的礦物油，然后用1.5mL顆粒細(xì)胞培養(yǎng)基接種于12孔板中，置于37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后全量換液1次，之后每48h全量換液1次，光學(xué)顯微鏡觀察顆粒細(xì)胞形態(tài)。2.2人壁層顆粒細(xì)胞的分離、提純及培養(yǎng)收集ICSI超排卵患者取卵術(shù)采集的卵泡液（不含卵母細(xì)胞及卵丘顆粒細(xì)胞復(fù)合物），采用密度梯度離心法分離[7],具體操作為：300xg離心10min，棄上清，用2mLPBS液重懸，加入2mL胰酶，37C消化10min后加入1mL顆粒細(xì)胞培養(yǎng)基終止消化;后300xg離心30min,棄上清，加入2mLPBS液重懸，小心加入2mLFicoll液面上，400xg離心20min。離心后顆粒細(xì)胞位于上層混合液和下層Ficoll液交界液面處，用移液管輕柔吸取，加入3mLPBS液，300xg離心3min后棄上清，用顆粒細(xì)胞培養(yǎng)液重懸沉淀，接種6孔板,置于37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24h后全量換液1次，之后每48h全量換液1次，光學(xué)顯微鏡觀察顆粒細(xì)胞形態(tài)。2.3細(xì)胞鑒定分別取培養(yǎng)至第3代的2種顆粒細(xì)胞，接種于12孔板中，培養(yǎng)至融合度60%時(shí)用PBS清洗2次，4%多聚甲醛4C固定20min,PBS沖洗3次每次5min,用含0.1%TritonX-100的BSA液破膜并封閉1h,PBS沖洗3次，每次5min，用細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)FSHR抗體表達(dá)情況，細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)紅染為陽(yáng)性;Hoechst33342檢測(cè)細(xì)胞核，胞核表現(xiàn)為藍(lán)染。2.4細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)的檢測(cè)取2種顆粒細(xì)胞培養(yǎng)至融合度70%~80%時(shí)傳代，吸去培養(yǎng)液，PBS清洗1遍，胰酶消化，計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度為1X109/L,接種于6孔板，置于37C、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每48h全量換液1次。取第3代的2種顆粒細(xì)胞，以5X106/L密度接種于96孔板中，置于37C、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后全量換液1次，之后每48h全量換液1次。于培養(yǎng)第1、3、5、7、9和11天時(shí)點(diǎn)每孔添加10pLCCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3h后使用酶標(biāo)儀測(cè)量各孔在450mm波長(zhǎng)處的吸光度(A)。2.5雌激素檢測(cè)取第3代的2種顆粒細(xì)胞，以1X109/L的密度接種于6孔板中，24h后全量換液1次，每48h全量換液1次，收集培養(yǎng)第1、3、5、7、9和11天的細(xì)胞培養(yǎng)液，-80C儲(chǔ)存，用ELISA方法檢測(cè)培養(yǎng)基中雌激素含量。3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean士SD)表示，獨(dú)立樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的組間比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果12種顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)的形態(tài)學(xué)觀察人CCs原代提取于撿卵時(shí)進(jìn)行卵母細(xì)胞ICSI前處理，用細(xì)針切割卵母細(xì)胞周?chē)亚痤w粒細(xì)胞復(fù)合體而得，幾乎沒(méi)有紅細(xì)胞殘留，24h后培養(yǎng)基中復(fù)合體內(nèi)顆粒細(xì)胞大部分貼壁生長(zhǎng)，培養(yǎng)24h后換液將剩余漂浮復(fù)合體團(tuán)塊洗去，顯微鏡下觀察到顆粒細(xì)胞生長(zhǎng)分散，細(xì)胞伸展充分，見(jiàn)圖1A；人MGCs原代提取培養(yǎng)24h后大部分貼壁生長(zhǎng)，但仍有較多數(shù)量紅細(xì)胞混雜，見(jiàn)圖1B，紅細(xì)胞并未對(duì)顆粒細(xì)胞貼壁產(chǎn)生明顯影響，培養(yǎng)24h后全量換液可去除大部分殘留紅細(xì)胞。Figure1.Therepresentativeimagesofinvitroculturedhumancumuluscellsandhumanmuralgranulosacells(x200).A:humancumuluscellsafter24hofincubation;B:humanmuralgranulosacellsafter24hofincubation.a:humancumuluscells;b:humanmuralgranulosacells;c:remainingerythrocytes.Thescalebar=50pm.圖1體外培養(yǎng)的人卵丘顆粒細(xì)胞和人壁層顆粒細(xì)胞2種顆粒細(xì)胞貼壁后外觀相似，均呈梭形或多突狀，胞核大、圓，核仁明顯，細(xì)胞質(zhì)顆粒豐富、均勻，細(xì)胞間偽足連接緊密。體外培養(yǎng)這2種細(xì)胞在第3~7天分裂能力達(dá)到峰值，第7~9天進(jìn)入生長(zhǎng)平臺(tái)期，隨后出現(xiàn)退化現(xiàn)象，懸浮細(xì)胞增多，細(xì)胞出現(xiàn)類(lèi)成纖維細(xì)胞形態(tài)改變。2免疫熒光鑒定顆粒細(xì)胞對(duì)2種顆粒細(xì)胞進(jìn)性免疫熒光方法檢測(cè)FSHR表達(dá)，結(jié)果顯示，胞質(zhì)呈紅色，說(shuō)明FSHR表達(dá)陽(yáng)性，陽(yáng)性率達(dá)90%以上，表明2種來(lái)源所得細(xì)胞均為顆粒細(xì)胞，見(jiàn)圖2。Figure2.Immunofluorescencestainingofhumancumuluscellsandhumanmuralgranulosacells(x400).Thescalebar=20pm.圖2人卵丘顆粒細(xì)胞和人壁層顆粒細(xì)胞的免疫熒光觀察3細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)比較CCK-8法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)第1天，2種顆粒細(xì)胞貼壁數(shù)量相當(dāng)；培養(yǎng)第3、5及7天，人CCs數(shù)量均較人MGCs多；第9及11天結(jié)果顯示，CCs開(kāi)始出現(xiàn)細(xì)胞凋亡而MGCs進(jìn)入生長(zhǎng)平臺(tái)期。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示2種顆粒細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線(xiàn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖3。4雌激素分泌能力比較Figure3.Thegrowthcurvesofhumancumuluscellsandhumanmuralgranulosacells.Mean±SD.n=10.圖3人卵丘顆粒細(xì)胞和人壁層顆粒細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)ELISA方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，MGCs分泌雌激素稍多于CCs[(3.17±0.33)nmol/Lvs(2.95±0.14)nmol/L],但統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示2種顆粒細(xì)胞分泌雌激素量的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)圖4。Figure4.Estrogencontentsintheculturemediaofhumancumuluscellsandhumanmuralgranulosacells.Mean±SD.n=10.圖4人卵丘顆粒細(xì)胞和人壁層顆粒細(xì)胞培養(yǎng)液雌激素含量討論卵巢顆粒細(xì)胞是卵母細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育內(nèi)環(huán)境的重要組成部分，其體外培養(yǎng)模型的建立對(duì)研究多能干細(xì)胞分化具有重要意義，如在生殖系細(xì)胞發(fā)生的熱點(diǎn)研究中，將干細(xì)胞與MGCs共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)MGCs能促進(jìn)干細(xì)胞向雌性生殖細(xì)胞進(jìn)一步分化[8-10]。此外，MGCs的體外模型有助于研究其與卵母細(xì)胞的互相調(diào)節(jié)機(jī)制，并且可以為卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞共培養(yǎng)及多能干細(xì)胞與顆粒細(xì)胞共培養(yǎng)的研究提供不同的顆粒細(xì)胞亞類(lèi)來(lái)源［11-13］。不過(guò)，上述研究的開(kāi)展大部分取用壁層顆粒細(xì)胞作為研究對(duì)象，CCs作為顆粒細(xì)胞亞群之一，與卵母細(xì)胞處于同一微環(huán)境中，其所起到的作用與MGCs不同［14］，因此需要建立CCs培養(yǎng)體系，為研究卵母細(xì)胞發(fā)生和干細(xì)胞共培養(yǎng)等研究提供不同的顆粒細(xì)胞亞群。細(xì)胞建系的關(guān)鍵在于原代顆粒細(xì)胞的分離和提純方法，本實(shí)驗(yàn)采用直接培養(yǎng)法對(duì)CCs進(jìn)行原代提取，比傳統(tǒng)密度梯度離心法分離MGCs更為簡(jiǎn)單方便［15］。直接法無(wú)需消化及離心操作，有研究指出［16］，CCs生長(zhǎng)發(fā)育受卵母細(xì)胞分泌因子的調(diào)控，脫離了卵母細(xì)胞的單獨(dú)CCs不適宜長(zhǎng)期體外培養(yǎng)，不過(guò)該項(xiàng)研究基于山羊模型，因此所得結(jié)論可能不適用于人CCs的體外培養(yǎng)。此外，有國(guó)內(nèi)學(xué)者認(rèn)為［17］，卵丘顆粒細(xì)胞復(fù)合物中的黏液團(tuán)會(huì)影響顆粒細(xì)胞的提純及生長(zhǎng)活性。與卵母細(xì)胞體夕卜受精操作中對(duì)卵母細(xì)胞-卵丘顆粒細(xì)胞復(fù)合物的處理比較而言，ICSI操作機(jī)械切割卵丘顆粒細(xì)胞復(fù)合物的體積更大，剝除的顆粒細(xì)胞更多，本實(shí)驗(yàn)選取ICSI促排獲卵超過(guò)20個(gè)的患者作為原代提取樣本，所收集的卵丘顆粒細(xì)胞復(fù)合物量較多。本研究結(jié)果顯示，雖然黏液團(tuán)未經(jīng)消化，但CCs在培養(yǎng)24h后可從黏液團(tuán)中爬向皿底并貼壁，后續(xù)生長(zhǎng)的顆粒細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)與MGCs相似，未見(jiàn)明顯異常。CCs樣本收集前經(jīng)過(guò)MOPS液沖洗2次，基本不含血細(xì)胞影響，培養(yǎng)24h后可除去絕大部分黏液團(tuán)塊，此法可保證細(xì)胞純度的同時(shí)，操作簡(jiǎn)單。本實(shí)驗(yàn)原代樣本取自ICSI促排獲卵超過(guò)20個(gè)的患者，若種皿時(shí)選取6孔板及更大面積培養(yǎng)皿，CCs24h后貼壁密度低，會(huì)導(dǎo)致后續(xù)的生長(zhǎng)受到影響。本實(shí)驗(yàn)提示，如果12孑L板中每孔原代樣本量少20個(gè)卵丘顆粒細(xì)胞復(fù)合物，會(huì)因?yàn)橘N壁的顆粒細(xì)胞密度過(guò)低，導(dǎo)致接下來(lái)的生長(zhǎng)受到影響。但由于沒(méi)有對(duì)黏液團(tuán)塊進(jìn)行消化處理，無(wú)法提供定量種皿的細(xì)胞數(shù)，是本實(shí)驗(yàn)的不足之處。本實(shí)驗(yàn)研究顯示，CCs的體外培養(yǎng)生長(zhǎng)特點(diǎn)和雌激素分泌功能和MGCs相似。目前，有關(guān)人顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)所用培養(yǎng)基的選擇文獻(xiàn)報(bào)道不一[18-20],本實(shí)驗(yàn)綜合當(dāng)前研究報(bào)道，選擇含體積分?jǐn)?shù)為10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基作為MGCs及CCs培養(yǎng)基，且未在培養(yǎng)基中添加卵泡液。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CCs體外生長(zhǎng)情況良好，伸展性佳，具有和MGCs相當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)能力，因此提示本實(shí)驗(yàn)選用的培養(yǎng)基適用于CCs的體外培養(yǎng)；FSHR抗體免疫熒光結(jié)果表明，從卵丘顆粒細(xì)胞復(fù)合物中分離所得細(xì)胞為顆粒細(xì)胞[21]；ELISA檢測(cè)雌激素結(jié)果提示，分離所得CCs分泌雌激素能力和MGCs相似，提示我們CCs在體外培養(yǎng)后同樣具有雌激素分泌功能。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)建立了一種有效的分離、提取和培養(yǎng)人CCs的方法，且操作簡(jiǎn)便，并通過(guò)與經(jīng)典的人MGCs體外培養(yǎng)方法比較，結(jié)果顯示，人CCs具有良好的體外生長(zhǎng)能力以及雌激素分泌功能，為有關(guān)顆粒細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)、卵母細(xì)胞-顆粒細(xì)胞共培養(yǎng)和誘導(dǎo)干細(xì)胞-顆粒細(xì)胞共培養(yǎng)等研究提供了不同的顆粒細(xì)胞亞群。[參考文獻(xiàn)]BaoB,GarverickHA.Expressionofsteroidogenicenzymeandgonadotropinreceptorgenesinbovinefolliclesduringovarianfollicularwaves:areview[J].JAnimSci,1998,76(7):1903-1921.WebbR,CampbellBK,GarverickHA,etal.Molecularmechanismsregulatingfollicularrecruitmentandselection[J].JReprodFertilSuppl,1999,54(54):33-48.EppigJJ.Oocytecontrolofovarianfolliculardevelopmentandfunctioninmammals[J].Reproduction,2001,122(6):829-838.HavelockJC,RaineyWE,CarrBR.Ovariangranulosacelllines[J].MolCellEndocrinol,2004,228(1-2):67-78.MatzukMM,BurnsKH,ViveirosMM,etal.Intercellularcommunicationinthemammalianovary:oocytescarrytheconversation[J].Science,2002,296(5576):2178-2180.GilchristRB,LaneM,ThompsonJG.Oocyte-secretedfactors:regulatorsofcumuluscellfunctionandoocytequality[J].HumReprodUpdate,2008,14(2):159-177.ChenSU,ChenRJ,ShiehJY,etal.Humanchorionicgonadotropinup-regulatesexpressionofmyeloidcellleukemia-1proteininhumangranulosa-luteincells:implicationofcorpusluteumrescueandovarianhyperstimulationsyndrome[J].JClinEndocrinolMetab,2010,95(8):3982-3992.QingT,ShiY,QinH,etal.Inductionofoocyte-likecellsfrommouseembryonicstemcellsbyco-culturewithovariangranulosacells[J].Differentiation,2007,75(10):902-911.ChenHF,JanPS,KuoHC,etal.GranulosacellsandretinoicacidcotreatmentenrichpotentialgermcellsfrommanuallyselectedOct4-EGFPexpressinghumanembryonicstemcells[J].ReprodBiomedOnline,2014,29(3):319-332.張武文，黃麗麗，莊亞玲，等.巨噬細(xì)胞集落刺激因子及其受體mRNA在人卵泡顆粒細(xì)胞和胎盤(pán)及子宮內(nèi)膜中的表達(dá)[J].中國(guó)病理生理雜志,2007,23(9):1850-1852.Sela-AbramovichS,EdryI,GalianiD,etal.Disruptionofgapjunctionalcommunicationwithintheovarianfollicleinducesoocytematuration[J].Endocrinology,2006,147(5):2280-2286.文艷飛，蔡柳洪，何文，等.卵巢早衰患者來(lái)源的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的建系、鑒定及誘導(dǎo)分化[J].中國(guó)病理生理雜志,2016,32(1):140-145.VanderhydenBC,ArmstrongDT.Roleofcumuluscellsandserumontheinvitromaturation,fertilization,andsubsequentdevelopmentofratoocytes[J].BiolReprod,1989,40(4):720-728.MaaloufWE,LeeJH,CampbellKH.Effectsofcaffeine,cumuluscellremovalandagingonpolyspermyandembryodevelopmentoninvitromaturedandfertilizedovineoocytes[J].Theriogenology,2009,71(7):10