發(fā)酵工藝原理課件

生物工程概述基因工程基因工程是通過DNA重組技術(shù),對生物材料進(jìn)行改良,構(gòu)建出新型的微生物菌株、培育出新的動(dòng)植物品種,使其具有優(yōu)良的符合人們意愿的性狀，或獲得所需要的產(chǎn)物。

稀少珍貴的蛋白質(zhì)藥物1982年，美國食品與藥物管理局批準(zhǔn)了首例基因工程產(chǎn)品—人胰島素投放市場——它標(biāo)志了基因工程產(chǎn)品正式進(jìn)入到商業(yè)化階段。人生長激素、表皮生長因子、腫瘤壞死因子、a-干擾素、纖維素酶、抗血友病因子、紅細(xì)胞生成素、尿激酶原、白細(xì)胞介素-2、集落刺激因子、乙肝疫苗等等

畜牧業(yè)中的應(yīng)用動(dòng)物疫苗、生長激素等例：動(dòng)物乳腺反應(yīng)器

種植業(yè)中的應(yīng)用用攜帶外源基因的農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化植物原生質(zhì)體，使外源DNA與植物染色體DNA整合，通過原生質(zhì)體的培養(yǎng)分化成愈傷組織，最后發(fā)育成具有新性狀的完整植株—轉(zhuǎn)基因植物

種植業(yè)中的應(yīng)用抗化學(xué)除草劑基因轉(zhuǎn)基因西紅柿蛋白質(zhì)工程：通過對蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的合理設(shè)計(jì)，利用基因工程的手段生產(chǎn)出具有更高生物活性或獨(dú)特性質(zhì)的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)工程的主要步驟通常包括：（1）從生物體中分離純化目的蛋白；（2）測定其氨基酸序列；（3）借助核磁共振和X射線晶體衍射等手段，盡可能地了解蛋白質(zhì)的二維重組和三維晶體結(jié)構(gòu);（4）設(shè)計(jì)各種處理?xiàng)l件，了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化，包括折疊與去折疊等對其活性與功能的影響；（5）設(shè)計(jì)編碼該蛋白的基因改造方案，如點(diǎn)突變；（6）分離、純化新蛋白，功能檢測后投入實(shí)際使用。高等植物細(xì)胞培養(yǎng)高等植物細(xì)胞具有全能性。從高等植物的幼胚、根、莖、葉、花和果實(shí)等不同器官的組織中分離的單個(gè)細(xì)胞，經(jīng)過特殊培養(yǎng)形成愈傷組織，并可進(jìn)一步誘導(dǎo)生成完整的植株。高等植物細(xì)胞培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞重構(gòu)技術(shù)細(xì)胞重組是把不同種類的細(xì)胞的部件重新組合裝配。細(xì)胞融合是將不同種類的兩種細(xì)胞經(jīng)過特殊處理后放在一起，在某些促融因子作用下發(fā)生融合，形成雜種細(xì)胞。原生質(zhì)體融合現(xiàn)代發(fā)酵工程主要指利用利用微生物、動(dòng)植物細(xì)胞和基因工程菌在在人工生物反應(yīng)器（發(fā)酵罐）中培養(yǎng)而獲得產(chǎn)物的工業(yè)過程?，F(xiàn)代發(fā)酵工程是生物代謝、微生物生長動(dòng)力學(xué)、大型發(fā)酵罐或生物反應(yīng)器研制、化工原理等密切結(jié)合和應(yīng)用的結(jié)果。

發(fā)酵工程離子交換的應(yīng)用蒸發(fā)和結(jié)晶技術(shù)的應(yīng)用過濾膜技術(shù)色層分離技術(shù)應(yīng)用生物技術(shù)的基本內(nèi)容（幾大領(lǐng)域）：基因工程：用“剪刀+糨糊”創(chuàng)造新物種的工程。細(xì)胞工程：微觀水平的嫁接技術(shù)酶工程：讓工廠高效、安靜、美麗如畫的工程。發(fā)酵工程：把微生物或細(xì)胞造就成無數(shù)微型工廠，將神話變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)的橋梁。蛋白質(zhì)工程：巧奪天工的技術(shù)。第二節(jié)發(fā)酵工程概述一.什么叫發(fā)酵二．發(fā)酵工程的發(fā)展史三.發(fā)酵工業(yè)的特點(diǎn)四.發(fā)酵工業(yè)的范圍

一、發(fā)酵的定義（fermentation)1、傳統(tǒng)發(fā)酵2、生化和生理學(xué)意義的發(fā)酵3、工業(yè)上的發(fā)酵1、傳統(tǒng)發(fā)酵

fervere”

發(fā)泡最初發(fā)酵是用來描述酵母菌作用于果汁或麥芽汁產(chǎn)生氣泡的現(xiàn)象，或者是指酒的生產(chǎn)過程。2、生化和生理學(xué)意義的發(fā)酵指微生物在無氧條件下，分解各種有機(jī)物質(zhì)產(chǎn)生能量的一種方式，或者更嚴(yán)格地說，發(fā)酵是以有機(jī)物作為電子受體的氧化還原產(chǎn)能反應(yīng)。如葡萄糖在無氧條件下被微生物利用產(chǎn)生酒精并放出CO2。3、工業(yè)上的發(fā)酵

利用微生物、植物、動(dòng)物，在合適的條件下，經(jīng)特定的代謝途徑轉(zhuǎn)變成所需產(chǎn)物的過程。包括：1.厭氧培養(yǎng)的生產(chǎn)過程，如酒精，乳酸等。2.通氣（有氧）培養(yǎng)的生產(chǎn)過程，如抗生素、氨基酸、酶制劑等。發(fā)酵的分類

1.

按獲取能量的方式分——好氧發(fā)酵，厭氧發(fā)酵2.

按產(chǎn)物類型分——初級代謝物發(fā)酵，次級代謝物發(fā)酵；食品發(fā)酵，有機(jī)酸發(fā)酵，氨基酸發(fā)酵，維生素發(fā)酵，抗生素發(fā)酵……3.

按操作類型分——自然發(fā)酵，純種發(fā)酵，混種發(fā)酵；分批發(fā)酵，半連續(xù)發(fā)酵，連續(xù)發(fā)酵；固態(tài)發(fā)酵，液態(tài)發(fā)酵4.按發(fā)酵生物類型分——細(xì)菌發(fā)酵，真菌發(fā)酵，基因工程菌發(fā)酵，動(dòng)植物細(xì)胞發(fā)酵

SOLID-STATEFERMENTATIONPRODUCTION二．發(fā)酵工程的發(fā)展史

1．發(fā)酵現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)與利用2.小生命體的發(fā)現(xiàn)3.發(fā)酵本質(zhì)的闡明4.純粹培養(yǎng)技術(shù)的開發(fā)5.發(fā)酵中酶催化反應(yīng)的發(fā)現(xiàn)6.大規(guī)模液體沉沒發(fā)酵技術(shù)的開發(fā)7.現(xiàn)代生物技術(shù)的應(yīng)用

三、發(fā)酵工業(yè)的特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)1.產(chǎn)物結(jié)構(gòu)復(fù)雜性和特異性：手性或光學(xué)活性2.過程安全性：水相、常溫、常壓、中性、不燃不爆3.主要原料可再生性：陽光和土地4.原料可替換性5.反應(yīng)自控性6.設(shè)備通用性7.副產(chǎn)物可綜合利用性8.生產(chǎn)能力可提高性：突變與基因擴(kuò)贈(zèng)9.產(chǎn)物類型可塑性：突變與轉(zhuǎn)基因缺點(diǎn)1.副產(chǎn)物多，分離精制困難2.反應(yīng)速度慢3.原料轉(zhuǎn)化率低4.反應(yīng)濃度低5.生產(chǎn)穩(wěn)定性差6.設(shè)備龐大，輔助設(shè)備多，投資大7.廢水、廢渣排放量大，處理費(fèi)用高8.生產(chǎn)過程容易受到其他微生物的污染9.通氣、攪拌、冷卻等能耗大四、發(fā)酵工業(yè)的范圍1．發(fā)酵食品工業(yè)(FermentedFoods)

：醬油，食醋，豆瓣醬，酸菜，活性酵母，活性乳酸菌，面包，酸奶，奶酪，醬豆腐，納豆、白酒，黃酒，米酒，葡萄酒，啤酒，果酒。2．有機(jī)酸發(fā)酵工業(yè)OrganicAcids

：醋酸，乳酸，檸檬酸，葡萄糖酸，蘋果酸，衣康酸，琥珀酸，丙酮酸，反丁烯二酸等。3．氨基酸發(fā)酵工業(yè)AminoAcids

：谷氨酸，賴氨酸，色氨酸，蘇氨酸，精氨酸，酪氨酸，異亮氨酸，丙氨酸，苯丙氨酸等。

四、發(fā)酵工業(yè)的范圍4．低聚糖與多糖發(fā)酵工業(yè)oligosaccharidesandpolysaccharides：低聚果糖，香菇多糖，云芝多糖，葡聚糖，黃原膠等。5．核苷酸發(fā)酵工業(yè)Nucleotides

：肌苷酸（IMP），鳥苷酸（GMP），黃苷酸（XMP）。6．藥物發(fā)酵工業(yè)Pharmaceutical：抗生素:青霉素，頭孢菌素，鏈霉素，紅霉素，四環(huán)素，制霉菌素，絲裂霉素等。基因工程制藥工業(yè)：促紅細(xì)胞生成素（EPO），集落刺激因子（CSF），表皮生長因子（EGF），人生長激素，干擾素，白介素，各種疫苗，單克隆抗體等。藥理活性物質(zhì)發(fā)酵工業(yè)：免疫抑制劑，免疫激活劑，糖苷酶抑制劑，脂酶抑制劑，類固醇激素等四、發(fā)酵工業(yè)的范圍四、發(fā)酵工業(yè)的范圍7．維生素發(fā)酵工業(yè)vitamin：維生素C，維生素B2，維生素B12等。8．酶制劑發(fā)酵工業(yè)Enzymes

：淀粉酶、蛋白酶、脂酶、青霉素?；?、葡萄糖氧化酶、海因酶等。9.發(fā)酵飼料工業(yè)Feedstuff

：干酵母、單細(xì)胞蛋白、酵素菌、益生菌、青貯飼料、抗生素和維生素飼料添加劑等。10生物肥料與農(nóng)藥工業(yè)：

biofertilizerandbiologicalpesticide細(xì)菌肥料、赤霉素、除草菌素、蘇云金桿菌、白僵菌、綠僵菌、殺稻瘟菌素、有效霉素、春日霉素等。11.溶劑發(fā)酵工業(yè)：Solvent酒精、甘油、乙醇、丙酮、丁醇溶劑等。12..水的生物處理工業(yè)及環(huán)保：EnvironmentalApplication(WasteTreatment)活性污泥、沼氣發(fā)酵、有毒物質(zhì)降解等。

四、發(fā)酵工業(yè)的范圍WTO帶來的機(jī)遇和挑戰(zhàn)發(fā)酵工業(yè)的產(chǎn)業(yè)特點(diǎn)：1、技術(shù)中等復(fù)雜而又相對成熟（不屬于高端技術(shù)）2、勞動(dòng)中等密集、資源消耗較大，污染大。

所以從國際產(chǎn)業(yè)分工格局的趨勢看，理應(yīng)由發(fā)達(dá)國家轉(zhuǎn)移到優(yōu)秀的發(fā)展中國家來。而中國是發(fā)展最快的發(fā)展中國家，有很好的產(chǎn)業(yè)基礎(chǔ)和人力資源，進(jìn)入WTO之后，中國可以更直接地參與國際產(chǎn)業(yè)分工，所以應(yīng)當(dāng)成為世界發(fā)酵第一大國和第一強(qiáng)國。

WTO帶來的機(jī)遇和挑戰(zhàn)發(fā)酵產(chǎn)業(yè)在我省區(qū)域經(jīng)濟(jì)中是最具特色的，石家莊是全國發(fā)酵工業(yè)的中心，是醫(yī)藥原料抗生素、維生素的生產(chǎn)基地?！八幎肌钡奶岢鲆馕吨仪f市可能成為中國發(fā)酵產(chǎn)業(yè)的第一大市和第一強(qiáng)市。天時(shí)和地利都已齊備。菌種篩選搖瓶試驗(yàn)發(fā)酵罐中試由實(shí)驗(yàn)室研究到產(chǎn)業(yè)化的過程發(fā)酵生產(chǎn)發(fā)酵工程的基本技術(shù)過程Theessentialcomponentsofafermentor發(fā)酵的主體設(shè)備發(fā)酵工程生產(chǎn)產(chǎn)品的流程圖《發(fā)酵工程工藝原理》課程的內(nèi)容緒論培養(yǎng)基生產(chǎn)菌種的選育滅菌與無菌空氣的制備生產(chǎn)菌種的制備發(fā)酵動(dòng)力學(xué)發(fā)酵工藝過程控制染菌的防治主要參考書：

《發(fā)酵工藝原理》中國醫(yī)藥科技出版社《新編生物工藝學(xué)》華東化工大學(xué)出版社《生物化學(xué)工程》上?？茖W(xué)技術(shù)出版社《微生物工程工藝原理》華南理工大學(xué)出版社《現(xiàn)代生物技術(shù)概論》北京師范大學(xué)出版社《微生物工程》科學(xué)出版社

《發(fā)酵工業(yè)概論》中國輕工業(yè)出版社

主要專業(yè)期刊微生物學(xué)報(bào)微生物學(xué)通報(bào)食品與發(fā)酵工業(yè)工業(yè)微生物生物工程學(xué)報(bào)生物工程進(jìn)展食品與生物技術(shù)生物技術(shù)通報(bào)醫(yī)藥生物技術(shù)

專業(yè)站點(diǎn)生物引擎：美國化學(xué)網(wǎng)數(shù)據(jù)庫群：

/databases美國國立醫(yī)學(xué)圖書館Pubmed數(shù)據(jù)庫/PubMed中國生物工程網(wǎng)：生物橋：生物論壇：中國發(fā)明專利技術(shù)信息網(wǎng)：

歐洲專利條約組織：

中國數(shù)字圖書館：5/一、發(fā)酵過程檢測控制的主要的參數(shù)

1、物理參數(shù)檢測參數(shù)檢測方法

單位

影響溫度鉑電阻

熱敏電阻

℃

μqPc*罐壓(0.20.5×105Pa)隔膜傳感器壓敏電阻Pa保持正壓，防止染菌O2及CO2

的溶解度攪拌轉(zhuǎn)數(shù)頻率計(jì)數(shù)器

r/minKla發(fā)酵液的均勻性

攪拌功率(2-4KW/m3)功率計(jì)KwKla空氣流量浮子流量計(jì)

孔板差壓計(jì)

m3

h-1vvmKla粘度旋轉(zhuǎn)粘度計(jì)

Pa

sKla濁度濁度計(jì)%反映單細(xì)胞的生長

料液的流量蠕動(dòng)泵

荷重傳感器量筒L

h-1

S發(fā)酵過程檢測控制的主要的參數(shù)

2、化學(xué)參數(shù)檢測參數(shù)檢測方法

單位

影響及作用PH復(fù)合玻璃電極

菌體和產(chǎn)物合成速度酶促反應(yīng)的方向基質(zhì)濃度產(chǎn)物濃度HPLC離子選擇電極生物傳感器取樣g

L-1

μqP發(fā)酵周期的長短氧化還原電位氧化還原電位電極mV生長和生化活性溶氧濃度覆膜氧電極

%qo2氣相O2含量

順磁氧分析儀

Pa反映OUR和Kla氣相CO2含量

紅外氣體分析儀

%反映OUR和Kla發(fā)酵過程檢測控制的主要的參數(shù)

3、生物參數(shù)檢測參數(shù)檢測方法

單位

影響菌絲形態(tài)攝像顯微鏡取樣鏡檢

反映菌體發(fā)育階段和正常與否菌體濃度取樣：干重、濁度、活菌計(jì)數(shù)、離心沉降g

L-1

影響菌體的生化反應(yīng)KlaμqPqSqo2(OUR)CER(Co2釋放速率)RQ(呼吸商:CER/OUR)YxsYps

Kla等

發(fā)酵過程檢測控制的主要的參數(shù)

4、間接狀態(tài)參數(shù)二、控制方式

一般檢控系統(tǒng)包括3個(gè)部分。

1．測定元件：如溫度計(jì)、壓力表、電流計(jì)、pH計(jì)直接測定發(fā)酵過程的各種參數(shù)，并輸出相應(yīng)信號(hào)。

2．控制部分：其功能主要是將測定元件測出的各種參數(shù)信號(hào)與預(yù)先確定值進(jìn)行比較，并且輸出信號(hào)指令執(zhí)行元件進(jìn)行調(diào)整控制。3．執(zhí)行元件：它接受控制部分的指令開啟、或關(guān)閉有關(guān)閥門、泵、開關(guān)等調(diào)節(jié)控制機(jī)構(gòu)，使有關(guān)參數(shù)達(dá)到預(yù)定位置。手動(dòng)控制和自動(dòng)控制發(fā)酵控制FermentationControl

SampleAnalysispHDOSugarAmmoniaPhosphateSulphateProductsPrecursorsContaminationPressureprobeLevelprobepHprobeTemp.probeDOprobeAntifoamAcid/BaseCoolingAir/agitationSugar/OilfeedPenicillinFermentationProfile變化曲線第一節(jié)溫度的影響及控制一、溫度對發(fā)酵的影響：影響各種酶促反應(yīng)的速度酶活溫度發(fā)酵溫度升高，生長代謝加快，生產(chǎn)期提前。發(fā)酵溫度太高，菌體容易衰老，發(fā)酵周期縮短。改變發(fā)酵液的物理性質(zhì)：溫度影響基質(zhì)和氧的吸收速度影響飽和溶氧濃度改變菌體代謝產(chǎn)物的合成方向例：溫度小于30℃，合成金霉素的能力強(qiáng)溫度等于35℃，只合成四環(huán)素二、影響發(fā)酵溫度變化的因素：

發(fā)酵熱（KJ/m3h）發(fā)酵熱=生物熱+攪拌熱-蒸發(fā)熱-顯熱-輻射熱生物熱：產(chǎn)生菌在生長繁殖過程中，釋放的大量熱量。影響生物熱的因素：與菌種遺傳特性有關(guān)與菌齡有關(guān)：對數(shù)生長期生物熱最大。與營養(yǎng)基質(zhì)有關(guān)與產(chǎn)量有關(guān)攪拌熱：由于攪拌器的轉(zhuǎn)動(dòng)引起液體的摩擦產(chǎn)生的熱量。蒸發(fā)熱：發(fā)酵液蒸發(fā)水分帶走的熱量。攪拌熱=P3600/V顯熱：發(fā)酵排氣散發(fā)帶走的熱量。輻射熱：由于罐內(nèi)外的溫差，輻射帶走的熱量。三、最適發(fā)酵溫度的選擇選擇既適合菌體生長又適合代謝產(chǎn)物合成的溫度可實(shí)行變溫控制：在生長階段選擇適合菌體生長的溫度，在產(chǎn)物合成階段，選擇適合代謝產(chǎn)物合成的溫度。確定最適發(fā)酵溫度還應(yīng)參考其它發(fā)酵條件：在較差通氣條件下，降低發(fā)酵溫度對發(fā)酵有利培養(yǎng)基成分較易被利用或較稀薄時(shí)，降低發(fā)酵溫度有利四、發(fā)酵溫度的控制在發(fā)酵罐上安裝夾套和蛇罐，通過循環(huán)冷卻水控制。冷卻介質(zhì)：深井水或冷凍水控制方式：手動(dòng)控制或自動(dòng)控制溫度計(jì)溫度控制器調(diào)節(jié)閥第二節(jié)pH的影響及控制一、pH對發(fā)酵的影響：影響菌體生長代謝的酶活性影響代謝產(chǎn)物的合成方向影響菌體原生質(zhì)膜電荷的改變，引起膜對離子的滲透作用，影響了營養(yǎng)物的吸收和代謝產(chǎn)物的分泌。pHGrowth2-3pHunitspH的變化決定于所用的生產(chǎn)菌：培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的代謝引起pH的變化：培養(yǎng)基pH在發(fā)酵過程中能被菌體代謝所改變。若陰離子氮源被利用后產(chǎn)生NH3

，則pH上升；有機(jī)酸的積累，使pH下降。一般來說，高碳源培養(yǎng)基傾向于向酸性pH轉(zhuǎn)移，高氮源培養(yǎng)基傾向于向堿性pH轉(zhuǎn)移，這都跟碳氮比直接有關(guān)。生理酸性物質(zhì)和生理堿性物質(zhì)的消耗二、影響發(fā)酵pH變化的因素：根據(jù)不同菌種的生理特性，確定不同的最適pH同一菌種根據(jù)不同階段，生長期采用最適生長的pH，在產(chǎn)物采用最適產(chǎn)物合成的pH。三、最適pH的選擇四、pH的控制采用合適的培養(yǎng)基配比C：N合適生理酸性物質(zhì)和生理堿性物質(zhì)比例合適添加緩沖物質(zhì)：碳酸鈣和磷酸鹽在發(fā)酵過程中直接補(bǔ)加酸或堿過去流加硫酸或氫氧化鈉，現(xiàn)采用補(bǔ)加氨水、尿素、硫酸銨在發(fā)酵過程中調(diào)節(jié)補(bǔ)糖速度控制pH幾種具體情況的調(diào)節(jié)方法當(dāng)pH低，氨基氮含量低時(shí)當(dāng)pH高，氨基氮含量低時(shí)當(dāng)pH高，氨基氮含量高時(shí)當(dāng)pH由于多加了削沫劑而下降時(shí)pH的控制系統(tǒng)pH電極設(shè)定控制器調(diào)節(jié)閥6.5pHUncontrolledControlled經(jīng)消毒的pH電極裝入發(fā)酵罐內(nèi)定時(shí)直接測定培養(yǎng)基的pH，同時(shí)還可以與控制儀表連結(jié)，通過回路系統(tǒng)控制閥門或泵進(jìn)行pH調(diào)節(jié)。菌體濃度的增加速度（生長速度）與微生物的種類和自身的遺傳特性有關(guān)第三節(jié)菌體生長速度和菌體濃度的影響及控制影響菌體濃度的因素菌體濃度的增加速度（生長速度）與營養(yǎng)基質(zhì)的種類和濃度有關(guān)（μ正比于S）當(dāng)存在基質(zhì)抑制作用時(shí)或造成高滲透壓時(shí)，高濃度營養(yǎng)基質(zhì)引起生長速率下降。菌體濃度的增加速度（生長速度）受環(huán)境條件的影響最適菌體濃度的確定優(yōu)化控制的目標(biāo)：在最短的時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生最大量的產(chǎn)物。(dP/dtMAX)dP/dt

=qPXqP=f〔X，μ，qO2

qSCL〕以青霉素發(fā)酵為例qP/qPmμ

/μm1.0-1.0青霉素發(fā)酵的qP與μ的關(guān)系μCμ＞μCqP可維持在qPmaxμ＜μCqP隨μ減小而減小要保證生產(chǎn)菌獲得最大的比生產(chǎn)速率，就必須維持較大的比生長速率。但是，過高的比生長速率造成過高的菌體濃度，造成不利影響：過高的比生長速率和過高的菌體濃度造成的不利影響：1、μ過高，S消耗過快，有限的營養(yǎng)基質(zhì)只能用于生長，而不足于產(chǎn)物合成。2、有毒中間產(chǎn)物的快速積累，會(huì)改變菌體的代謝途徑，抑制產(chǎn)物合成。3、X過高，增加OUR，且發(fā)酵液粘度增大，減小OTR。CL減小，抑制菌體生長和產(chǎn)物合成。最適X？最適μ為等于或稍大于μC青霉素發(fā)酵的qP、OUR、OTR與X的關(guān)系1.0-X

/Xm1.0OURqP/qPmOTRdp/dtXCOUR=OTR時(shí)的菌體濃度為最適菌體濃度，

在發(fā)酵過程中，控制目標(biāo)為保持穩(wěn)定的臨界菌體濃度和臨界比生長速率，以維持呼吸臨界溶氧濃度為前提的耗氧速率與供氧速率的平衡，從而使產(chǎn)物合成速率和比速率達(dá)到最大值。

生長速度和菌體濃度的控制方法確定基礎(chǔ)培養(yǎng)基的適當(dāng)配比，防止培養(yǎng)基過于豐富或過于稀薄。通過調(diào)節(jié)中間補(bǔ)料的速度和量來控制。第四節(jié)營養(yǎng)基質(zhì)的影響及控制

一、碳源種類：葡萄糖優(yōu)點(diǎn)：吸收快，利用快，能迅速參加代謝合成菌體和產(chǎn)生能量缺點(diǎn)：有些品種產(chǎn)生分解產(chǎn)物阻遏效應(yīng)。一）、碳源種類的影響及控制迅速利用的碳源緩慢利用的碳源種類：淀粉、乳糖、蔗糖、麥芽糖、玉米油優(yōu)點(diǎn)：不易產(chǎn)生分解產(chǎn)物阻遏效應(yīng)。有利于延長次級代謝產(chǎn)物的分泌期缺點(diǎn)：溶解度低，發(fā)酵液粘度大。

發(fā)酵工業(yè)中常采用含迅速利用的碳源和緩慢利用的碳源的混合碳源。迅速利用的碳源滿足菌體生長的消耗，緩慢利用的碳源，滿足產(chǎn)物合成，可延長合成期，提高產(chǎn)量，并可解除葡萄糖效應(yīng)。碳源種類的控制二）、碳源濃度的影響S過小μ＜μCqP隨μ減小而減小S過大μ＞＞μCX＞＞XCOUR增大CL＜CLCqP減小粘度增大Kla減小產(chǎn)生分解產(chǎn)物阻遏作用的碳源濃度過大，會(huì)抑制產(chǎn)物合成。三）、碳源濃度的控制在發(fā)酵過程中，補(bǔ)加糖類控制碳源濃度補(bǔ)料的類型：1、流加2、少量多次的加入3、多量少次的加入殘?zhí)橇縫H值QcX粘度溶氧尾氣中O2和CO2的含量發(fā)酵液的總體積補(bǔ)糖的依據(jù)：根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，以最高產(chǎn)量的罐批的加糖率為指標(biāo)，并依據(jù)菌體濃度、一定時(shí)間內(nèi)的糖比消耗速率和殘?zhí)堑燃右孕拚?。例：青霉素發(fā)酵開始補(bǔ)糖在殘?zhí)墙抵?.5%,pH開始回升時(shí)補(bǔ)糖。補(bǔ)糖量以最高罐批經(jīng)驗(yàn)量為參考。每小時(shí)前期0—40h中期40—90h后期90以后加糖量0.08%-0.15%0.15%-0.18%0.15%-0.18%補(bǔ)糖量的控制：

經(jīng)驗(yàn)法：補(bǔ)糖量的控制：

動(dòng)力學(xué)方法依據(jù)μ、qP、qC等動(dòng)力學(xué)參數(shù)

之間的關(guān)系，計(jì)算加糖量以次級代謝產(chǎn)物為例：μ、qP、qC之間的關(guān)系：X

μqpqCS控制原則：以維持臨界生長限制基質(zhì)濃度、臨界菌體濃度和臨界比生長速率為指標(biāo)的基質(zhì)流加速率與消耗速率的平衡。具體方法：1、求X0測定XOTROURXXCOUROTRX02、求μ、qp在發(fā)酵過程中，測定每小時(shí)菌體干重X和產(chǎn)物P計(jì)算每小時(shí)μ、qpμ=△X/△tXqp=△P/△tX3、確定適宜的μ—μ0qPμμC確定μ0等于或稍大于μC可使qP達(dá)到qPmax4、確定適宜的qC

qC0=m+μ0/Yxs+qPmax/Yps5、根據(jù)物料平衡計(jì)算加糖速率每小時(shí)加糖量=qC0X0v–發(fā)酵液的殘?zhí)橇垦a(bǔ)料液的含糖量qC=m+μ/Yxs+qP/Yps補(bǔ)糖的控制把計(jì)算的加糖量，輸入計(jì)算機(jī)，由計(jì)算機(jī)控制加料裝置精確控制加入的糖量。二、氮源的影響和控制

一）氮源的種類影響種類：氨水、銨鹽和玉米漿優(yōu)點(diǎn)：易被菌體利用，明顯促進(jìn)菌體生長缺點(diǎn)：對于有些品種高濃度的銨離子抑制產(chǎn)物合成迅速利用的氮源緩慢利用的氮源種類：黃豆餅粉、花生餅粉、和棉子餅粉優(yōu)點(diǎn)：利用緩慢，有利于延長次級代謝產(chǎn)物的分泌期。防止早衰。缺點(diǎn)：溶解度低，發(fā)酵液粘度大。

發(fā)酵工業(yè)中常采用含迅速利用的氮源和緩慢利用的氮源的混合氮源。迅速利用的氮源促進(jìn)菌體生長繁殖，緩慢利用的碳源，滿足產(chǎn)物合成，可延長合成期，延緩自溶期。二）氮源種類的控制三）氮源濃度的影響控制補(bǔ)氮的依據(jù)：殘氮量、pH值、菌體量氮源濃度對菌體生長和產(chǎn)物合成的量與方向都有影響。氮源濃度的控制：控制基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的配比。通過補(bǔ)加氮源。補(bǔ)氮量的控制：經(jīng)驗(yàn)法：依據(jù)使pH升高0.1而通入氨水的量來計(jì)算。依據(jù)殘氮量和工藝控制殘氮量來計(jì)算。例：土霉素發(fā)酵50m3發(fā)酵罐使pH升高0.1通氨量為10升。使氨基氮上升0.004%-0.005%。動(dòng)力學(xué)方法；通過qN、μ、qP，計(jì)算每小時(shí)的補(bǔ)氮量。磷酸鹽能明顯促進(jìn)產(chǎn)生菌的生長。（0.32-300mM）對于次級代謝產(chǎn)物，高濃度的磷酸鹽能抑制產(chǎn)物合成。（10mM以下）三、磷酸鹽的影響和控制

一）磷酸鹽源的影響二）磷酸鹽濃度的控制一般在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中采用適宜濃度。對于初級代謝產(chǎn)物，磷酸鹽濃度采用足量。對于次級代謝產(chǎn)物，磷酸鹽濃度采用生長亞適量。一般磷酸鹽采用單消，防止發(fā)生沉淀反應(yīng)使溶磷量達(dá)不到最適量。要控制有機(jī)氮源中的磷含量，以防溶磷量超過最適量。當(dāng)菌體生長緩慢時(shí)，可適當(dāng)補(bǔ)加適量的磷，促進(jìn)菌體生長。一、泡沫對發(fā)酵的影響泡沫的持久存在影響著微生物對氧的吸收，妨礙二氧化碳的排除，因而破壞其生理代謝的正常進(jìn)行，不利于發(fā)酵；使發(fā)酵液的裝料系數(shù)減少。由于泡沫大量生成，致使培養(yǎng)液的容量一般只能等于種子罐容量的一半左右，大大影響了設(shè)備的利用率。大量的泡沫易造成逃液。增加污染雜菌的機(jī)會(huì)。造成巨大損失。第五節(jié)泡沫的影響及其控制二、泡沫的控制方法減少培養(yǎng)基中易起泡的成分減少培養(yǎng)基中粘度大的成分適當(dāng)減少通氣量及攪拌轉(zhuǎn)速采用機(jī)械消泡（罐內(nèi)裝置和罐外裝置）采用削沫劑消泡工業(yè)上常用的消泡劑天然油脂類

玉米油、豆油、棉籽油、魚油等高碳醇類

十八醇、乙二醇聚合物聚醚類

聚氧丙烯甘油、聚氧乙烯丙烯甘油硅酮類

聚二甲基硅氧烷泡沫的檢測和控制最簡單的檢測是定時(shí)在發(fā)酵罐視孔上觀察泡沫產(chǎn)生情況，發(fā)現(xiàn)泡沫持續(xù)上升時(shí)，開啟消泡劑貯罐的閥門，流加少量消泡劑，使泡沫消失即可。也可在罐內(nèi)頂部裝液位儀與控制儀表連結(jié)，用以控制消泡貯率閥門的開啟。當(dāng)泡沫上升接觸探頭頂端時(shí)產(chǎn)生的信號(hào)，通過控制裝置，指令打開泵開關(guān)或閥門，自動(dòng)加入消泡劑，泡沫消失，信號(hào)也隨之消失，閥門關(guān)閉。消泡劑使用的注意事項(xiàng)：不能用量過大細(xì)密地?cái)U(kuò)散到泡沫效果好加入土溫-80具有增效作用多種消泡劑并用

溶氧(DO)是需氧微生物生長所必需。在發(fā)酵過程中有多方面的限制因素，而溶氧往往是最易成為控制因素。

在28℃氧在發(fā)酵液中的100％的空氣飽和濃度只有0.25mmol.L-1左右，比糖的溶解度小7000倍。在對數(shù)生長期即使發(fā)酵液中的溶氧能達(dá)到100％空氣飽和度，若此時(shí)中止供氧，發(fā)酵液中溶氧可在幾分鐘之內(nèi)便耗竭，使溶氧成為限制因素。第六節(jié)氧的供需及對發(fā)酵的影響第一節(jié)微生物對氧的需求一、描述微生物需氧的物理量比耗氧速度或呼吸強(qiáng)度（QO2）：單位時(shí)間內(nèi)單位體積重量的細(xì)胞所消耗的氧氣，mmolO2·g菌-1·h-1

攝氧率(r)：單位時(shí)間內(nèi)單位體積的發(fā)酵液所需要的氧量。mmolO2·L-1·h-1

。r=QO2.X二、溶解氧濃度對菌體生長和產(chǎn)物形成的影響CCrQO2CLCCr:

臨界溶氧濃度,指不影響呼吸所允許的最低溶氧濃度。一般對于微生物：CCr:

＝1～15%飽和濃度例：酵母4.6*10-3mmol.L-1,1.8%

產(chǎn)黃青霉2.2*10-2mmol.L-1,8.8%定義：氧飽和度＝發(fā)酵液中氧的濃度/臨界溶氧溶度所以對于微生物生長，只要控制發(fā)酵過程中氧飽和度>1.問題：一般微生物的臨界溶氧濃度很小，是不是發(fā)酵過程中氧很容易滿足。例：以微生物的攝氧率0.052mmolO2·L-1·S-1

計(jì)，

0.25/0.052=4.8秒注意：由于產(chǎn)物的形成和菌體最適的生長條件，常常不一樣：

頭孢菌素卷須霉素生長5%(相對于飽和濃度）13%產(chǎn)物>13%>8%三、影響需氧的因素r=QO2.X

菌體濃度QO2

遺傳因素

菌齡

營養(yǎng)的成分與濃度

有害物質(zhì)的積累

培養(yǎng)條件第二節(jié)反應(yīng)器中氧的傳遞一、發(fā)酵液中氧的傳遞方程CCiPPi氣膜液膜N：傳氧速率kmol/m2.hkg:氣膜傳質(zhì)系數(shù)kmol/m2.h.atmKl:液膜傳質(zhì)系數(shù)m/hC*＝P/H,與氣相中氧分壓相平衡的液體中氧的濃度Kl:以氧濃度為推動(dòng)力的總傳遞系數(shù)(m/h)再令：單位體積的液體中所具有的氧的傳遞面積為a(m2/m3)Nv：體積傳氧速率kmol/m3.hKla:以(C*-C)為推動(dòng)力的體積溶氧系數(shù)h-1二、發(fā)酵液中氧的平衡發(fā)酵液中供氧和需氧始終處于一個(gè)動(dòng)態(tài)的平衡中傳遞：消耗：r=QO2.X氧的平衡最終反映在發(fā)酵液中氧的濃度上面三、供氧的調(diào)節(jié)C有一定的工藝要求，所以可以通過Kla和C*來調(diào)節(jié)其中C*＝P/HNvHPKla第六章氧的供需及對發(fā)酵的影響調(diào)節(jié)Kla是最常用的方法，kla反映了設(shè)備的供氧能力，一般來講大罐比小罐要好。

45升1噸10噸攪拌速度250rpm120120供氧速率7.610.720.1第三節(jié)影響Kla的因素

Kla反映了設(shè)備的供氧能力，發(fā)酵常用的設(shè)備為搖瓶與發(fā)酵罐。一、影響搖瓶kla的因素為裝液量和搖瓶機(jī)的種類搖瓶機(jī)往復(fù)，頻率80-120分/次，振幅8cm旋轉(zhuǎn)，偏心距25、12,轉(zhuǎn)述250rpm裝液量，一般取1/10左右：

250ml15-25ml500ml30ml750ml80ml例：

500ml搖瓶中生產(chǎn)蛋白酶，考察裝液量對酶活的影響裝液量30ml60ml90ml120ml

酶活力71373425392二、影響發(fā)酵罐中Kla的因素已知在通風(fēng)發(fā)酵罐中，全擋板條件下：Kla=K[(P/V)α(vs)β(ηapp)-w]P/V—

單位體積發(fā)酵液實(shí)際消耗的功率（指通氣條件下）。（KW/m3

）Vs—

空氣的直線速度（m/h），截面積一定，反映的空氣的體積流量（m3/h)（vvmm3/m3min)ηapp—發(fā)酵液的粘度（kgs/m2)α、β、w—指數(shù)，與攪拌器和空氣分布器的形式有關(guān)K—經(jīng)驗(yàn)常數(shù)1、理論上分析KLand通氣量提高攪拌，調(diào)節(jié)kla的效果顯著例某一產(chǎn)品的發(fā)酵

dnp0/vc產(chǎn)量

4501801.6220%49784502802.1240%55645501802.6160%8455例黑曲霉生產(chǎn)糖化酶

n230230270

通氣比1:0.81:1.21:0.8

產(chǎn)量181224162846提高d、n顯著提高C,提高了產(chǎn)量提高N,比提高Q有效2、實(shí)際上：對于轉(zhuǎn)速的調(diào)節(jié)有時(shí)是有限度的通風(fēng)的增加也是有限的蒸發(fā)量大中間揮發(fā)性代謝產(chǎn)物帶走例：紅曲霉生產(chǎn)色素用于食品工業(yè)，靜止培養(yǎng)改為通氣培養(yǎng)，比色法測定產(chǎn)量：通氣靜止1.42.03.16.819.5OD0.280.78.315.614.36.2提高下降所以這些因素的存在，發(fā)酵設(shè)備的供養(yǎng)是有限的3、小型發(fā)酵罐和大型發(fā)酵罐調(diào)節(jié)kla的特點(diǎn)

小型發(fā)酵罐，轉(zhuǎn)速可調(diào)

大型發(fā)酵罐，轉(zhuǎn)速往往不可調(diào)

大型反應(yīng)器的合理設(shè)計(jì)

對現(xiàn)有設(shè)備一定要注意工藝配套4、影響Kla的其它因素空氣分布器液體的粘度傳質(zhì)介質(zhì)溶氧濃度的變化及其控制一、典型的分批發(fā)酵中氧濃度的變化規(guī)律（一定Kla下）：rXQCL一般有一個(gè)低谷，在對數(shù)生長的末期二、發(fā)酵過程中溶氧的控制1、溶氧控制的策略微生物反應(yīng):

XS→P+Xπ=a+bμ菌體生長期：酶系統(tǒng)Ⅰ酶系統(tǒng)Ⅱ關(guān)鍵因子開始的細(xì)胞生長好后的細(xì)胞產(chǎn)物合成產(chǎn)物形成期：底物產(chǎn)物酶系統(tǒng)Ⅱ

反應(yīng)動(dòng)力學(xué)問題

發(fā)酵過程的控制一般策略：前期有利于菌體生長，中后期有利用產(chǎn)物的合成溶氧控制的一般策略：前期大于臨溶氧濃度，中后期滿足產(chǎn)物的形成。2、溶氧控制的實(shí)例GAXDO谷氨酸發(fā)酵：要求：氧飽和度>1控制：0-12小時(shí)小通風(fēng)

12小時(shí)后增加通風(fēng)原因：0-12小時(shí)菌體量較小，采用小通風(fēng)12

一般認(rèn)為，發(fā)酵初期較大的通風(fēng)和攪拌而產(chǎn)生過大的剪切力，對菌體的生長有時(shí)會(huì)產(chǎn)生不利的影響，所以有時(shí)發(fā)酵初期采用小通風(fēng)，停攪拌，不但有利于降低能耗，而且在工藝上也是必須的。但是通氣增大的時(shí)間一定要把握好。例：生產(chǎn)肌苷酸：通氣量不變17.15mg/ml24小時(shí)增加22.55mg/ml30小時(shí)增加18.25mg/ml36小時(shí)增加12.34mg/ml例：某廠青霉素發(fā)酵的工藝研究*三、發(fā)酵過程中溶氧濃度監(jiān)控的意義1、考察工藝控制是否滿足要求2、其它異常情況的表征染菌、噬菌體、設(shè)備和操作故障3、間接控制的措施第一節(jié)微生物的特性及工業(yè)微生物的要求一、微生物的特性

有些微生物能在厭氧的條件下生長

有些微生物能夠利用簡單的有機(jī)物和無機(jī)物滿足自身的生長

有些微生物能進(jìn)行復(fù)雜的代謝

有些微生物能利用較復(fù)雜的化合物

有些微生物能在極端的環(huán)境下生長二：工業(yè)化菌種的要求

能夠利用廉價(jià)的原料，簡單的培養(yǎng)基，大量高效地合成產(chǎn)物

有關(guān)合成產(chǎn)物的途徑盡可能地簡單，或者說菌種改造的可操作性要強(qiáng)

遺傳性能要相對穩(wěn)定

不易感染它種微生物或噬菌體

產(chǎn)生菌及其產(chǎn)物的毒性必須考慮（在分類學(xué)上最好與致病菌無關(guān)）

生產(chǎn)特性要符合工藝要求放線菌（鏈霉素四環(huán)素；紅霉素等）真菌（青霉素、頭孢等）一些產(chǎn)芽孢的細(xì)菌植物或動(dòng)物來源一、抗生素生產(chǎn)有關(guān)的微生物抗生素是次級代謝產(chǎn)物，需要生物體進(jìn)行復(fù)雜的代謝，目前發(fā)現(xiàn)的生物來源如下：第二節(jié)已工業(yè)化產(chǎn)品生產(chǎn)菌的介紹二、氨基酸生產(chǎn)有關(guān)的微生物代謝控制發(fā)酵：用人工誘變的方法，有意識(shí)地改變微生物的代謝途徑，最大限度地積累產(chǎn)物，這種發(fā)酵形象地稱為代謝控制發(fā)酵，最早在氨基酸發(fā)酵中得到成功應(yīng)用。50,60年代以氨基酸發(fā)酵為代表的代謝控制發(fā)酵，是發(fā)酵工業(yè)發(fā)展歷史上的一個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)：HD:高絲氨酸脫氫酶黃色短桿菌中賴氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸和異亮氨酸的合成調(diào)節(jié)機(jī)制

HT:高絲氨酸轉(zhuǎn)乙酰酶AK:天冬氨酸激酶氨基酸生產(chǎn)菌的要求：代謝途徑比較清楚，代謝途徑比較簡單谷氨酸發(fā)酵的菌種：其它氨基酸生產(chǎn)菌：棒桿菌屬，短桿菌屬、節(jié)桿菌屬或小桿菌屬的棒型細(xì)菌常規(guī)菌種一般也是以谷氨酸生產(chǎn)菌選育而成；工程菌，大腸桿菌，枯草芽孢桿菌三、食品酶制劑生產(chǎn)有關(guān)的微生物開發(fā)一個(gè)新酶，都要經(jīng)過一系列研究的毒理試驗(yàn)。關(guān)于食品用酶，美國需要得到FDA的批準(zhǔn)。目前已同意使用的僅僅少數(shù)微生物能用于生產(chǎn)食品用酶。α—淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢桿菌和地衣牙孢桿菌三、常用的基因表達(dá)系統(tǒng)(一)原核生物：大腸桿菌(1977年Boyer)、枯草牙胞桿菌沙門氏菌

生長迅速、蛋白產(chǎn)量高;

表達(dá)蛋白的純化、分離及分析快速；

外源基因的導(dǎo)入相對容易；

已建立了整套表達(dá)理論及技術(shù).(二)真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)

酵母(既是微生物又是真核細(xì)胞)

生長迅速，營養(yǎng)要求不高，易培養(yǎng)；

安全性好；

比哺乳動(dòng)物細(xì)胞操作簡單；

具有一定的修飾蛋白的能力。

中國倉鼠卵巢細(xì)胞（CHO細(xì)胞）表達(dá)系統(tǒng)

具有準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)錄后修飾功能；

具有產(chǎn)物胞外分越功能，便于下游產(chǎn)物分離純化；

具有重組基因的高效擴(kuò)增和表達(dá)能力；

具有貼壁生長特性，也可進(jìn)行懸浮生長；

CHO很少分泌自身的內(nèi)源蛋白。微生物（包括動(dòng)、植物細(xì)胞）幾乎可以生產(chǎn)我們所需的一切產(chǎn)品，但是涉及到工業(yè)化生產(chǎn)對于某一種特定的產(chǎn)品，只有特定的微生物才具有大量表達(dá)的潛力。問題：生產(chǎn)抗生素的微生物能不能用于生產(chǎn)氨基酸？禮來(Elililly),花了10年的時(shí)間從40萬株微生物中，發(fā)現(xiàn)了三種有潛力的新抗生素。例：第三節(jié)自然界中有目的微生物分離的原則一、菌種分離的一般過程土樣的采取→預(yù)處理→培養(yǎng)→菌落的選擇→產(chǎn)品的鑒定如何使樣品中所含微生物的可能性大如何在后續(xù)的操作中使這種可能性實(shí)現(xiàn)目的：高效地獲取一株高產(chǎn)目的產(chǎn)物的微生物問題：二、采樣時(shí)要注意的問題

氣候、水分、空氣

來源要廣

結(jié)合產(chǎn)品的特點(diǎn)

標(biāo)簽：地點(diǎn)、時(shí)間、氣候等富集的三種方案：

定向培養(yǎng):采用特定的有利于目的微生物富集的條件，進(jìn)行培養(yǎng)。三、目的微生物富集的一些基本方法富集的目的：讓目的微生物在種群中占優(yōu)勢，使篩選變得可能。

當(dāng)不可能采用定向培養(yǎng)時(shí)，則可設(shè)計(jì)在一個(gè)分類學(xué)中考慮，

不能提供任何有助于篩選產(chǎn)生菌的信息，這時(shí)只能通過隨機(jī)分離的辦法定向培養(yǎng)的方法物理方法：加熱、膜過濾等，表2-2（P31）但主要是通過培養(yǎng)的方法定向培養(yǎng)的富集方法1、底物2、pH條件3、培養(yǎng)時(shí)間4、培養(yǎng)溫度等一切能提高目的微生物相對生長速度的手段，培養(yǎng)（固體、液體；分批連續(xù)）后使目的微生物在種群中占優(yōu)勢。四、菌落的選出

從產(chǎn)物角度出發(fā)在培養(yǎng)時(shí)以產(chǎn)物的形成有目的的設(shè)計(jì)培養(yǎng)基利用簡單、快速的鑒定方法，如抗生素（P35）

從形態(tài)的角度

菌落的外觀形態(tài)，是微生物的一個(gè)重要表征。如多糖產(chǎn)生菌在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上生長，從具有粘液性的菌落外觀上就可以初步識(shí)別。實(shí)例：堿性纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選（國家七五攻關(guān)項(xiàng)目）采樣（造紙廠）→80度30分鐘處理文獻(xiàn):產(chǎn)生菌為中性牙孢桿菌，嗜堿牙孢桿菌、放線菌及霉菌0.0075%曲利本藍(lán)＋1%CMC（羧甲基纖維素），pH10.5培養(yǎng)3～4天，選擇有凹陷圈的菌落從285個(gè)土樣中獲得62株26株為組成型36株為誘導(dǎo)型↓例：醛肟水解酶的篩選

--Journalofbiotechnology94(2002),65-72培養(yǎng)基中含0.05%ofZ-PAOx

每隔2-3天移去一半培養(yǎng)物，補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基不斷分析樣品，2-3個(gè)月后Z-PAOx降低后，稀釋分離條菌落五、目的微生物富集方法的研究進(jìn)展

分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)手段，在微生物鑒別及特定目標(biāo)產(chǎn)物的篩選方面發(fā)揮了著越來越重要的作用。如:16SRNA同源性分析，基因序列分析及DNA/DNA雜交技術(shù)等

目前土壤中能夠培養(yǎng)的微生物不到總數(shù)的1%。微生物的多樣性及資源的開發(fā)仍然是今后若干年的研究重點(diǎn)。

2002,陳文新（科學(xué)院院士）

Incontrasttothistraditionalapproach,modernmolecularbiologytechniquesallowforDNAlibraryexpressionscreening,whichalsoenablesaccesstoenzymesof`nonculturable'organisms.Bythisstrategy,forinstance,thecompanyDiversa(SanDiego,CA,USA)identised120uniqueesterases/lipasesfromonly16%ofthetotalDNAobtainedfromanalkalinesoilsample.FEMSMicrobiologyReviews26(2002)73～81第四節(jié)菌株選育、分子改造目的

提高生產(chǎn)能力

提高產(chǎn)品質(zhì)量

開發(fā)新產(chǎn)品

解決生產(chǎn)實(shí)際問題

防止菌種退化方法基因突變：自然選育、誘變育種基因重組：雜交、原生質(zhì)體融合、基因工程基因的直接進(jìn)化：點(diǎn)突變、易錯(cuò)PCR、同序法DNAShuffling等自然狀態(tài)下，堿基對發(fā)生自然突變的機(jī)率為10-8～10-9自然突變有兩種情況：一種是我們生產(chǎn)上所不希望看到的，表現(xiàn)為菌株的衰退和生產(chǎn)質(zhì)量的下降，這種突變成為負(fù)突變。另一種是我們生產(chǎn)上希望看到的，對生產(chǎn)有利，這種突變成為正突變。一、自然選育自然選育在工業(yè)生產(chǎn)上的意義自然選育雖然突變率很低，但卻是工廠保證穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)的重要措施。回復(fù)突變：高產(chǎn)菌株在傳代的過程中，由于自然突變導(dǎo)致高產(chǎn)性狀的丟失，生產(chǎn)性能下降，這種情況我們稱為回復(fù)突變問題：高產(chǎn)菌株是正突變高，還是負(fù)突變高？自然選育操作步驟：一般習(xí)慣上將自然選育稱為菌種的分離純化。單細(xì)胞(孢子)懸液的制備平板分離挑選單菌落(注意形態(tài)的觀察)發(fā)酵試驗(yàn)二、誘變育種用各種物理、化學(xué)的因素人工誘發(fā)基因突變進(jìn)行的篩選，稱為誘變育種誘變劑：能夠提高生物體突變頻率的物質(zhì)稱為誘變劑誘變劑物理在：紫外，快中子化學(xué)：硫酸二乙酯，亞硝基胍{（二）、誘變劑處理過程中幾個(gè)有關(guān)的問題

化學(xué)誘變劑使用過程的安全性誘變劑量的選擇誘變劑的選擇出發(fā)菌株的選擇（一）、誘變劑的作用原理（略）壓硝酸：0.07MNa2HPO4亞硝基胍：1MNaOH（三）、誘變育種的一般步驟(p83)（四）、篩選的方法

隨機(jī)篩選

形態(tài)

理性化篩選從產(chǎn)物形成的生理生化途徑著手，進(jìn)行有的放矢的篩選。如結(jié)構(gòu)類似物抗性、營養(yǎng)缺陷型等，篩選而產(chǎn)生的這些特性，稱為遺傳標(biāo)記。結(jié)構(gòu)類似物：在化學(xué)和空間結(jié)構(gòu)上和代謝的中間物（終產(chǎn)物）相似，因而在代謝調(diào)節(jié)方面可以代替代謝中間物（終產(chǎn)物）的功能，但細(xì)胞不能以其作為自身的營養(yǎng)物質(zhì)。HD:高絲氨酸脫氫酶黃色短桿菌中賴氨酸的合成調(diào)節(jié)機(jī)制

HT:高絲氨酸轉(zhuǎn)乙酰酶AK:天冬氨酸激酶結(jié)構(gòu)類似物抗性：Lys的類似物AEC,Thr的類似物AHV營養(yǎng)缺陷型：如Thr缺陷型黃色短桿菌F9-50的誘變譜系BervibacteriumflavumAs1.495(leu-)lys.HCl2.1g/lF6-16(leu-,Thr-)20.8g/lF9-50(leu-,Thr-,AECr)33.5g/l三、基因的直接進(jìn)化(directedevolution)

突變基因突變庫的建立篩選基因突變庫的篩選基因復(fù)制與遺傳步驟：

在分子水平上，對目標(biāo)基因直接處理，然后通過高通量的篩選方法，提高目標(biāo)蛋白的性能。主要應(yīng)用：酶學(xué)性能的提高:pH

溫度

有機(jī)溶劑生理環(huán)境→工業(yè)催化環(huán)境

底物專一性脂酶拆分2-甲基癸酸硝基苯酯例：PLAPLA光學(xué)拆分選擇性(%)231577581905次錯(cuò)位PCR2次定點(diǎn)突變Reetz(1997)Liebeton(2000)第二章菌種的來源定點(diǎn)突變錯(cuò)位PCRDNAShuffling:指DNA分子的體外重組，是基因在分子水平上進(jìn)行有性重組(SexualRecombination)。XXXX

XXXX

XXX

XXXX

XXXXXXX

XXX

XXXX

XXXXXXXX

XXX

XXXX

XXXX

XXX

XXXXXXXXXXXXXXXX

FragmentReassembleSelectbestwithDNAseIfragmentsrecombinantsRepeatformultiplecyclesDNAshuffling項(xiàng)目進(jìn)化速度進(jìn)化對象進(jìn)化周期影響對象突變效率常規(guī)定向進(jìn)化緩慢進(jìn)化整個(gè)基因組多年完整基因組低DNAShuffling快速進(jìn)化特定基因/操縱子/病毒幾天部分基因組高DNAShuffling與常規(guī)定向進(jìn)化的比較類型示例特性活性增加倍數(shù)潛在應(yīng)用領(lǐng)域抗體人源抗體親和性400生物制藥酶天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶催化特異性10，000生物制藥β-內(nèi)酰胺酶抗生素抗性32，000抗生素枯草桿菌蛋白酶E耐熱性65℃耐熱時(shí)間17200工業(yè)酶細(xì)胞因子人類干擾素抗病毒285，000基因治療腫瘤抑制因子P5337℃半衰期12基因治療代謝途徑砷酸鹽代謝途徑砷酸鹽解毒40生物制藥汞代謝途徑汞解毒12生物制藥部分DNAShuffling技術(shù)的研究成果滅菌：指用化學(xué)或物理的方法殺滅或去除物料及設(shè)備中所有生命物質(zhì)的技術(shù)或工藝過程。

第一節(jié)滅菌的原理及方法一幾種常見的滅菌方法1化學(xué)物質(zhì)滅菌原理：藥物與微生物細(xì)胞中的成分反應(yīng)，使蛋白質(zhì)變性酶失活。常用的滅菌劑:使用范圍：器皿、雙手和實(shí)驗(yàn)室、無菌室的環(huán)境滅菌，不能用于培養(yǎng)基滅菌

常用的滅菌劑化學(xué)物質(zhì)名稱有效濃度化學(xué)物質(zhì)名稱有效濃度新潔爾滅(苯扎溴銨)0.25%甲醛37%杜滅芬0.25%戊二醛2%高錳酸鉀0.1%-0.25%苯酚0.1%-0.15%漂白粉5%過氧乙酸0.02%-0.2%酒精75%焦碳酸二乙酯0.01%-0.1%煤酚皂（來蘇爾）1%—5%

*2.

輻射滅菌原理：利用高能量的電磁輻射與菌體核酸的光化學(xué)反應(yīng)造成菌體死亡。

常用：紫外線、X射線和γ射線。

使用范圍：用于室內(nèi)空氣及器皿表面滅菌

3．干熱滅菌

原理：利用高溫對微生物有氧化、蛋白質(zhì)變性和電解質(zhì)濃縮作用而殺滅微生物。常用方法：灼燒和電熱箱加熱，140-180℃1-2小時(shí)使用范圍：玻璃及金屬用具及沙土管滅菌4．濕熱滅菌

原理：蒸汽冷凝放出大量潛熱，具有穿透力，且在高溫有水分條件下，蛋白質(zhì)易變性。常用方法：水煮常壓滅菌：100℃飽和蒸汽滅菌：一般121℃，30分鐘使用范圍：培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備滅菌。

5．過濾除菌

原理：利用微生物不能透過濾膜除菌。方法:0.01~0.45

m孔徑濾膜，使用范圍：用于壓縮空氣、酶溶液及其他不耐熱化合物溶液除菌。

二.濕熱滅菌原理

1.生物熱死動(dòng)力學(xué)（對數(shù)殘存定律）

dN/dt=-KN

N：菌體個(gè)數(shù)（個(gè)）

t:滅菌時(shí)間（min）k：反應(yīng)速度常數(shù)（min-1）dN/dt:菌受熱死亡速率(個(gè)/min)LnN/N0=-KtN=N0e-Kt以菌的殘留數(shù)LnN/N0的對數(shù)與時(shí)間t作圖，得出一條直線，其斜率為-K（P222圖14-1）

如何通過實(shí)驗(yàn)根據(jù)對數(shù)殘存定律確定某一溫度,某一微生物的K？1).K與菌種的特性有關(guān)相同溫度下，微生物越耐熱，k值越小。相同溫度下，微生物越不耐熱，k值越大。

2.反應(yīng)速率常數(shù)K

2).K與滅菌溫度有關(guān)K=Ae–E

/RT（阿累尼烏斯方程）LnK=LnA-E/RTA：比例常數(shù)R：氣體常數(shù)(J/molK)T：絕對溫度(K)△E：殺死細(xì)菌所需的活化能（J/mol）121℃118℃115℃110℃105℃

第二節(jié)培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備的滅菌工藝

一．培養(yǎng)基滅菌時(shí)間的選擇t=1/k*Ln(N0/N)

其中K：一般耐熱的細(xì)菌芽孢的K值

N0：細(xì)菌及芽孢數(shù)之和

N：10-3二.培養(yǎng)基滅菌溫度的選擇

選擇即能達(dá)到滅菌要求，

又保證營養(yǎng)成分不被破壞的溫度1.培養(yǎng)基營養(yǎng)成分破壞動(dòng)力學(xué)方程-dC/dt=K’C-dC/dt:營養(yǎng)物降解速度mol/LhC:營養(yǎng)物濃度mol/LK’:

營養(yǎng)物降解反應(yīng)速度常數(shù)1/st：時(shí)間(S)Ln(C/C0)=-K'tK’=

A’e-E’/RT

LnK’=LnA’-E’/RTA’：比例常數(shù)R：氣體常數(shù)(J/molK)T：絕對溫度(K)E’：營養(yǎng)物破壞所需的活化能（J/mol）2.根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果滅菌活化能大于培養(yǎng)基破壞活化能E＞E’P225表14-113.滅菌反應(yīng)

營養(yǎng)物破壞反應(yīng)

T1 LnK1=LnA-E/RT1 LnK1’=LnA’-E’/RT1T2LnK2=LnA-E/RT2 LnK2’=LnA’-E’/RT2Ln(K2/K1)=E/R(1/T1-1/T2)Ln(K2’/K1’)=E’/R(1/T1-1/T2)Ln(K2/K1)=ELn(K2’/K1’)E’Ln(K2/K1)＞Ln(K2’/K1’)K2/K1＞K2’/K1’

當(dāng)溫度升高時(shí)微生物死亡速度常數(shù)比營養(yǎng)物質(zhì)降解速度常數(shù)變化得大4．達(dá)到相同滅菌效果，T越高，K越大，所需t越短，采用高溫短時(shí)（HTST）滅菌效果好

三影響滅菌效果的因素微生物種類：不同的微生物k值不同。初始菌量：在保持N值不變的前提下，t與初始菌量N0的對數(shù)成正比。培養(yǎng)基成份：油脂、蛋白質(zhì)增加微生物的耐熱性。傳熱與混合狀況：影響受熱均勻度。培養(yǎng)基中固體顆粒的存在影響熱穿透。蒸汽中空氣的存在降低蒸汽分壓和滅菌溫度。pH：酸性pH下可加快微生物熱死速率

四.培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備的滅菌方法

（一）實(shí)驗(yàn)室種子培養(yǎng)基滅菌方法使用高壓蒸汽滅菌鍋

手提式滅菌鍋。容量小。立式或臥式滅菌鍋。容量較大，一般能裝幾十瓶或幾百瓶。滅菌柜。要和蒸汽鍋爐配套，用于大量種瓶培養(yǎng)基的滅菌，一次能裝幾百至幾千瓶(袋)。四.培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備的滅菌方法

（二）分批滅菌(batchsterilization)1．定義：將配制好的培養(yǎng)基輸入發(fā)酵罐中，用蒸汽加熱，使培養(yǎng)基和設(shè)備同時(shí)滅菌的一種滅菌方式。2．操作過程：空罐準(zhǔn)備：清洗、檢修和檢測。升溫：把培養(yǎng)基加熱到滅菌所需的溫度。保溫維持：在滅菌溫度下保持滅菌所需時(shí)間。冷卻保壓：把培養(yǎng)基的溫度降低到接種的溫度。溫度隨滅菌時(shí)間的變化三路進(jìn)汽：直接蒸汽從通風(fēng)、取樣和出料口進(jìn)入罐內(nèi)直接加熱，直到所規(guī)定的溫度，并維持一定的時(shí)間。這就是所謂的“三路進(jìn)氣”。

*四路出汽：直接蒸汽從排氣、接種、進(jìn)料和消沫劑管排氣分批滅菌設(shè)備示意圖

三）連續(xù)滅菌(continuoussterilization)1．定義：將培養(yǎng)基通過專門設(shè)計(jì)的滅菌器，進(jìn)行連續(xù)流動(dòng)滅菌后，進(jìn)入預(yù)先滅過菌的發(fā)酵罐中的滅菌方式。

2．流程：

1)由熱交換器組成的滅菌系統(tǒng)

2)蒸汽直接噴射型的連續(xù)滅菌系統(tǒng)

3）由連消塔、維持罐和噴淋冷卻組成的滅菌系統(tǒng)

由熱交換器組成的滅菌系統(tǒng)工藝流程圖溫度隨時(shí)間的變化蒸汽直接噴射型的連續(xù)滅菌系統(tǒng)溫度隨滅菌時(shí)間的變化由連消塔、維持罐和噴淋冷卻組成的滅菌系統(tǒng)三）連續(xù)滅菌與分批滅菌的比較與選擇分批滅菌優(yōu)點(diǎn)：1．不需附加設(shè)備2．

蒸汽利用率高3．

節(jié)約勞動(dòng)力

缺點(diǎn)1．

培養(yǎng)基質(zhì)量比較差2．

罐的利用率低3.冷卻水用量大連續(xù)滅菌優(yōu)點(diǎn)：1采用高溫快速滅菌法2．可以把培養(yǎng)基按其性質(zhì)分開滅菌3．有利于自動(dòng)控制4．節(jié)省冷卻水缺點(diǎn)1．

投資費(fèi)用高2．

對物料要求高3．

蒸汽用量大選擇原則：

1．

培養(yǎng)基成份（易降解成分、液化情況等）

2．

設(shè)備狀況（冷卻面積、傳動(dòng)裝置等）

3.動(dòng)力條件四、高溫對培養(yǎng)基成分的有害影響及其防止

消除高溫有害影響的措施（1）采用特殊加熱滅菌法(連續(xù)滅菌方法）（2）對易破壞的含糖培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌時(shí)，應(yīng)先將糖液與其他成分分別滅菌后再合并；（3）對含Ca2+或Fe3+的培養(yǎng)基與磷酸鹽先作分別滅菌，然后再混合，就不易形成磷酸鹽沉淀；（4）對含有在高溫下易破壞成分的培養(yǎng)基（如含糖組合培養(yǎng)基）可進(jìn)行低壓滅菌

第三節(jié)空氣除菌一、無菌空氣的要求1.空氣中的微生物空氣中的微生物種類以細(xì)菌和細(xì)菌芽孢較多，也有酵母，霉菌孢子和病毒。這些微生物大小不一，一般附著在空氣中的灰塵上或霧滴上，空氣中微生物的含量一般為103~104個(gè)／米3。灰塵粒子的平均大小約0.6μm左右，所以空氣除菌主要是去除空氣中的微粒(0.6-1μm）第三節(jié)空氣除菌一、無菌空氣的要求無菌空氣的標(biāo)準(zhǔn)百分?jǐn)?shù)：99.99％美國聯(lián)邦宇航局等級標(biāo)準(zhǔn)：100級（直徑小于0.5微米粒子數(shù)少于3.5個(gè)/L）溫度：25℃—40℃濕度：30%—45%

1.

纖維或顆粒介質(zhì)填充床過濾器：棉花、玻璃纖維、腈綸、滌綸、維尼綸或活性炭等

2.折疊式硼硅酸超細(xì)纖維過濾器：超細(xì)玻璃纖維

3.燒結(jié)金屬、陶瓷過濾器

二介質(zhì)除菌：原理：過濾介質(zhì)填充到過濾器中，空氣流過時(shí)借助慣性碰撞、阻截、擴(kuò)散、靜電吸附、沉降等作用將塵埃微生物截留在介質(zhì)中，達(dá)到除菌的目的。主要設(shè)備：填充床過濾器發(fā)酵生產(chǎn)中制備無菌空氣的大致過程

空氣介質(zhì)除菌流程高空取氣管是遠(yuǎn)離地面幾十米的管子。一般而言，地面附近空氣中所含的微生物和灰塵等均比高空空氣中含的多，據(jù)資料介紹，每升高10米，空氣中雜菌可降低一個(gè)數(shù)量級，因此從高空取氣要比從低空取氣有利得多。兩級分離、冷卻、加熱的空氣除菌流程

１——粗過濾器２——壓縮機(jī)３——貯罐４——冷卻器

５——絲網(wǎng)分離器６——過濾器

高效前置過濾除菌流程

１——高效前置過濾器２——壓縮機(jī)３——貯罐４——冷卻器

５——絲網(wǎng)分離器６——加熱器７——過濾器

第一節(jié)染菌的檢查與判斷

一、雜菌污染的檢查

培養(yǎng)基（1）細(xì)菌培養(yǎng)基營養(yǎng)肉湯：glucose10g,peptone5g,beefextract5g,NaCl5g,distilledwater1000ml,pH7.2~7.4。酚紅肉湯：營養(yǎng)肉湯+1%phenolred3ml。營養(yǎng)瓊脂：glucose5g,peptone10g,beefextract3g,NaCl5g,agar15~20g,distilledwater1000ml,pH7.2~7.4。2）酵母培養(yǎng)基

薩氏培養(yǎng)基（Sabouraud’sagar）：glucose40g,peptone10g,agar15~20g,distilledwater1000ml,pH5.6。（3）霉菌培養(yǎng)基察氏培養(yǎng)基（Czapek’sagar）：sucrose30g,NaNO33g,K2HPO41g,MgSO4

7H2O0.5g,KCl0.5g,agar15~20g,distilledwater1000ml,pH6.6。無菌檢查的流程：取樣接入試管或斜面培養(yǎng)（細(xì)菌32~37℃，1~2天；真菌25~28℃，1~3天）肉眼檢查鏡檢二、通過異常現(xiàn)象判斷溶解氧水平異常變化顯示染菌發(fā)酵時(shí)間溶氧濃度正常發(fā)酵污染噬菌體發(fā)酵時(shí)間溶氧濃度正常發(fā)酵污染好氣性雜菌污染非好氣性雜菌排氣中CO2異常變化顯示染菌二、通過異?，F(xiàn)象判斷工藝一定，尾氣中CO2量變化有一定規(guī)律污染雜菌，糖耗加快，尾氣中CO2量增加污染噬菌體，糖耗減慢，尾氣中CO2量減少種子系統(tǒng)空氣帶菌設(shè)備滲漏培養(yǎng)基滅菌不徹底操作失誤第二節(jié)染菌原因的分析

從染菌規(guī)模分析大規(guī)模染菌空氣凈化系統(tǒng)種子染菌、接種管道滲漏部分罐批染菌某一批號(hào)種子染菌某一套連消系統(tǒng)染菌補(bǔ)料管路滲漏或補(bǔ)料液帶菌個(gè)別罐批連批染菌設(shè)備問題個(gè)別罐不連批染菌培養(yǎng)基滅菌不徹底或操作失誤早期染菌培養(yǎng)基滅菌不徹底種子帶菌接種管道滅菌不徹底或接種操作不當(dāng)中期染菌培養(yǎng)基滅菌不徹底加消沫劑、補(bǔ)料系統(tǒng)滅菌不徹底或滲漏發(fā)酵設(shè)備滲漏泡沫頂罐后期染菌空氣系統(tǒng)有問題從染菌時(shí)間分析酵母菌：種子室、搖瓶間、計(jì)量罐、進(jìn)料補(bǔ)料閥門、攪拌軸封、被倒流的空氣介質(zhì)霉菌：種子室、搖瓶間、攪拌軸封、被倒流的空氣介質(zhì)、空氣普通桿菌：空氣過濾介質(zhì)、冷水設(shè)備滲漏、設(shè)備死角滲漏芽孢桿菌：培養(yǎng)基滅菌不徹底、設(shè)備有死角球菌：空氣系統(tǒng)、無菌間搖瓶間空氣中從染菌的菌型分析第三節(jié)染菌的防治措施

一、一般染菌的防治預(yù)防種子帶菌：

環(huán)境清潔，無菌操作設(shè)備完好、可靠，無菌操作用品滅菌徹底，操作熟練，制度嚴(yán)格。一、一般染菌的防治消滅培養(yǎng)基染菌：

嚴(yán)格物料采購、運(yùn)輸、倉貯配料（防止塊狀物料、清洗配料罐）滅菌（保證蒸汽的壓力、穩(wěn)定及暢通、按操作規(guī)程操作）保壓（防治培養(yǎng)基倒流）

嚴(yán)防空氣帶菌：提高空氣進(jìn)口的潔凈度除盡壓縮空氣中的油和水空氣過濾器滅菌時(shí)防止被沖翻保證空氣過濾器介質(zhì)的填裝質(zhì)量一、一般染菌的防治杜絕設(shè)備污染：良好的設(shè)計(jì)（無死角）規(guī)范的安裝徹底的清洗嚴(yán)密的維修有效的滅菌。一、一般染菌的防治染菌罐的處理種子罐染菌滅菌后放下水道并對種子罐、管道進(jìn)行檢查和滅菌啟用備用罐或倒種

發(fā)酵灌染菌前期：危害大的滅菌后放下水道危害不大，可重新滅菌，重新接種中后期：降低培養(yǎng)溫度，降低通風(fēng)提前放罐控制補(bǔ)料量染菌罐的處理二、噬菌體污染的防治

噬菌體污染的鑒別

現(xiàn)象鑒別：發(fā)酵液變稀、發(fā)粘，OUR

，DO

，NH4+—N

，泡沫

。平板鑒別：觀察噬菌斑。污染的預(yù)防

選育抗噬菌體菌株；

環(huán)境、明溝、下水道定期消毒；

排氣過濾，菌體排放前滅菌；

選用孔徑為0.01

m的微濾膜空氣過濾器；

發(fā)酵車間遠(yuǎn)離農(nóng)田、排污明渠、污水處

培養(yǎng)基中加入適量化學(xué)消毒劑：三聚磷酸鈉0.2%~0.3%，植酸0.1%~0.2%，檸檬酸0.2%~0.5%，草酸0.2%~0.5%，新潔而滅0.02%~0.05。

生產(chǎn)菌種的必備條件：1生長快：2對環(huán)境條件要有比較大的承受能力3遺傳表現(xiàn)型要穩(wěn)定，不易退化4菌種要純斜面沙土管冷干管液氮管實(shí)驗(yàn)室種子制備生產(chǎn)現(xiàn)場種子制備生產(chǎn)種子制備的一般流程

二級斜面一級斜面米孢子母瓶

子瓶一級種子罐發(fā)酵罐

二級種子罐三級種子罐菌種保藏幾個(gè)概念種子罐級數(shù)：種子在種子罐中需擴(kuò)大培養(yǎng)的次數(shù)。發(fā)酵級數(shù)：種子罐的級數(shù)加一。接種量：放罐的種子罐的培養(yǎng)液體積除以接種后培養(yǎng)液的體積的百分?jǐn)?shù)。種齡：生產(chǎn)種子的培養(yǎng)時(shí)間。一斜面種子的制備

1.斜面種子：在試管或扁瓶內(nèi)，以瓊脂固化的培養(yǎng)基表面上生長的菌種培養(yǎng)物。2.制備流程：3.制備過程注意事項(xiàng)

(1)

瓊脂要完全浸沒在營養(yǎng)液內(nèi),用量1.0%-2.5%(2)營養(yǎng)液中最好不含易沉淀的固形物；

(3)裝量掌握在斜面頂端不超過試管或扁平長度