生物免疫分析技術(shù)

第四章生物免疫分析技術(shù)免疫學方法在食品分析中正得到越來越廣泛的運用，其中酶聯(lián)免疫吸附法〔ELISA〕曾經(jīng)在食品工業(yè)中廣泛運用，它可以用于測定人們希望含有的物質(zhì)，以及不希望含有的物質(zhì)。例如如今人們所關(guān)注的食品平安性問題中一些物質(zhì)的檢測：殺蟲劑、藥物殘留物、激素、生長素、微生物毒素、真菌毒素或腸毒素、天然毒素，以及一些添加劑。免疫分析法具備有效的靈敏度、特異性、快速和低本錢的優(yōu)點；可對大量的樣品進展常規(guī)分析；可以用于樣品的定性挑選，也可以對樣品進展定量測定以確定樣品中待測組分的含量。4.1免疫的原理Ag+AbAg－Ab特異性、靈敏性在Ag，Ab反響中，用容易示蹤的化學物質(zhì)標志一種反響物，以了解反響能否發(fā)生，發(fā)生部位，以及發(fā)生的程度〔即對未知成分的樣品進展定性、定位及定量分析〕。4.2酶聯(lián)免疫法免疫酶技術(shù)：把抗原抗體的免疫反響和酶的高效催化作用原理有機地結(jié)合起來。它具有免疫熒光實驗和放射免疫實驗的優(yōu)點，并抑制上述兩種方法的缺陷。酶標志試劑制備容易、穩(wěn)定、有效期長，免疫酶技術(shù)的敏感性接近放射免疫實驗，可直接肉眼察看也可借助簡單的儀器作定量測定，所得結(jié)果比較客觀。酶免疫測定或免疫酶技術(shù)是指酶標志抗體或酶標志抗體進展的抗原抗體反響。它主要包括兩個方面：免疫過氧化物酶法：以過氧化物酶作為標志，與抗原或抗體結(jié)合，然后根據(jù)酶與其底物間所產(chǎn)生的不溶性顏色產(chǎn)物，借助于光學或電子顯微鏡察看細胞及亞細胞程度的抗原或抗體。酶聯(lián)免疫吸附法：根據(jù)可溶性抗原或抗體與不溶性固相載體結(jié)合后，還保管其免疫活性，結(jié)合了作為標志的酶催化作用。ELISA的根本原理和方法ELISA的種類和變化ELISA的特點ELISA的運用實例ELISA4.2.1根本原理它采用抗原與抗體的特異反響將待測物與酶銜接，然后經(jīng)過酶與底物產(chǎn)生顏色反響，用于定量測定。測定的對象可以是抗體也可以是抗原。在這種測定方法中有3種必要的試劑：①固相的抗原或抗體〔免疫吸附劑〕②酶標志的抗原或抗體〔標志物〕③酶作用的底物〔顯色劑〕丈量時，抗原〔抗體〕先結(jié)合在固相載體上，但仍保管其免疫活性，然后加一種抗體〔抗原〕與酶結(jié)合成的偶聯(lián)物〔標志物〕，此偶聯(lián)物仍保管其原免疫活性與酶活性，當偶聯(lián)物與固相載體上的抗原〔抗體〕反響結(jié)合后，再加上酶的相應(yīng)底物，即起催化水解或氧化復原反響而呈顏色。顏色反響的深淺與相應(yīng)的抗體或抗原量成正比，因此可借助于顏色反響的深淺來定量抗體或抗原。

這種有色產(chǎn)物可用肉眼、光學顯微鏡、電子顯微鏡察看，也可以用分光光度計〔酶標儀〕加以測定。

其方法簡單，方便迅速，特異性強。4.2.2酶及其底物

酶結(jié)合物是酶與抗體或抗原,半抗原在交聯(lián)劑作用下結(jié)合的產(chǎn)物。是ELISA成敗的關(guān)鍵試劑，它不僅具有抗體抗原特異的免疫反響，還具有酶促反響，顯示出生物放大作用，但不同的酶選用不同的底物，將得到不同的顏色反響。酶底物顯色反應(yīng)

測定波長

辣根過氧化物酶鄰苯二胺

四甲替聯(lián)苯胺

氨基水楊酸

鄰聯(lián)苯甲胺

2,2‘-連胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)銨鹽

橘紅色

黃色

棕色

蘭色

藍綠色492460449

425

642

堿性磷酸酯酶

4-硝基酚磷酸鹽(PNP)

萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽黃色

紅色400

500葡萄糖氧化酶

ABTS+HRP+葡萄糖

葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑蘭黃色

深藍色405420β-Ｄ-半乳糖苷酶

甲基傘酮基半乳糖苷(4MuG)

硝基酚半乳糖苷(ONPG)熒光

黃色

360,450

420

4.2.3ELISA的種類和變化〔一〕雙抗體夾心法〔二〕間接法〔三〕競爭法〔四〕雙位點一步法〔五〕捕獲法測IgM抗體〔六〕運用親和素和生物素的ELISA〔一〕雙抗體夾心法此法適用于檢驗各種蛋白質(zhì)等大分子抗原步驟：A將知抗體吸附于載體上，溫育后清洗；B參與待檢標本溶液，使溶液中的抗原與吸附的抗體結(jié)合，溫育后清洗；C參與酶標志特異性抗體，溫育后清洗；D參與酶作用底物，產(chǎn)生顯色反響，顏色的改動與所加的待檢標本溶液中的抗原量成正比。間接法是檢測抗體最常用的方法，其原理為利用酶標志的抗抗體以檢測已與固相結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法?！捕抽g接法步驟：A將知可溶性抗原吸附于載體〔聚苯乙烯板或聚乙苯乙烯小珠〕，經(jīng)溫育后清洗；B參與待檢稀釋血清，假設(shè)血清中有相應(yīng)特異性抗體存在那么與吸附的抗原結(jié)合，溫育后清洗；C參與酶標志的抗球蛋白抗體，此時酶標志抗抗體與吸附的抗原抗體復合物結(jié)合，溫育后清洗；D參與酶作用底物〔或稱基質(zhì)〕，酶分解底物并顯色，用光電比色計測定底物顯色深淺，即可推知抗體量?！踩掣偁幏ù朔捎糜跈z測小分子抗原。步驟：A將知抗體吸附于固相載體外表，溫育后清洗；B將能夠含抗原的待檢溶液和酶標志的知抗原溶液以適當比例混合，參與已包被的載體孔中，溫育后清洗；C參與酶作用的底物，產(chǎn)生顯色反響。色深表示結(jié)合的酶標志抗原多，而待檢溶液中未標志的抗原量少；反之，色淺表示結(jié)合的酶標志抗原少，而待檢溶液中抗原量多。對看管由于只加酶標抗原，與固相抗體充分結(jié)合，故分解底物顯色深；測定管的顯色程度那么隨待測抗原和酶標抗原與固相抗體競爭結(jié)合的結(jié)果而異。如待測抗原量多，競爭性地抑制酶標抗原與固相抗體結(jié)合，使固相上結(jié)合的酶標抗原量減少。因此，參與底物后顯色反響較弱。4.2.4特點特點一：靈敏性該測定法的靈敏度來自酶。眾所周知,酶是一種有機催化劑，很少量的酶即可誘導大量的催化反響，產(chǎn)生可供察看的顯色反響景象。因此該體系常被稱為酶放大體系。ELISA實現(xiàn)了在細胞或亞細胞程度上示蹤抗原或抗體的所在部位，或在微克、甚至納克程度上對其進展定量。例如，在測定血清中某一物質(zhì)的含量時，化學比色法的敏感度為mg/ml程度，酶反響測定法的敏感度約為5～10μg/ml。特點二：特異性其特異性來自抗體或抗原的選擇性?？乖贵w的結(jié)合本質(zhì)上只發(fā)生在抗原的抗原決議簇與抗體的抗原結(jié)合位點之間。由于兩者在化學構(gòu)造和空間構(gòu)型上呈互補關(guān)系，所以抗原抗體反響具有高度的特異性。

例如乙肝病毒中的外表抗原〔HBsAg〕、e抗原〔HBeAg〕和中心抗體〔HBcAg〕，雖來源于同一病毒，但僅與其相應(yīng)的抗體結(jié)合，而不與另外兩種抗體反響。抗原抗體反響的這種特異性使免疫測定能在一非常復雜的蛋白質(zhì)化合物〔例如血清〕中測定某一特定的物質(zhì)，而不需先分別待檢物。ELISA運用實例飼料中鹽酸克倫特羅的測定飼料中毒素的測定〔主要包括黃曲霉毒素，簡曲霉毒素〕飼料中有害微生物的快速篩檢〔如沙門氏菌〕甲胺磷殘留分析甲基對硫磷殘留分析呋喃丹殘留分析ELISA在飼料平安檢測中的運用ELISA用于農(nóng)藥殘留的檢測河豚毒素植物毒素如罌粟鹼、嗎啡、藻類毒素苯并芘主要有除草劑與殺蟲劑兩大類例如殺暝松〔FN〕、甲氟磷酸異已酶〔SOMAN〕、草不綠〔Alachor〕、西維因〔Carbaryl〕、多菌靈及克菌丹〔Captan〕等。農(nóng)藥的檢測：ELISA檢測“非典型肺炎〞冠狀病毒ELISA在結(jié)締組織病早期診斷中的運用檢測抗異質(zhì)性胞核核糖蛋白A2〔hnRNPA2〕/類風濕性關(guān)節(jié)炎〔PtA〕33抗體ELISA在疾病診斷中的作用ELISA法檢測幽門螺桿菌抗體ELISA試劑盒商業(yè)資訊ELISA試劑盒酶聯(lián)免疫井DNM-9602G酶標分析儀DNM-9602標配酶標分析儀DNM-9602A酶標分析儀幾種酶標分析儀4.3放射免疫法放射免疫測定〔radioimmunoassay，RIA〕是1959年由Berson和Yalow首先用于糖尿病患者胰島素含量的測定，是一種將同位素分析的靈敏性和抗原抗體反響的特異性這兩大特點結(jié)合起來的免疫標志測定技術(shù)。其優(yōu)點是靈敏度高、特異性強、準確性好、樣品用量少，而且不需求復雜的提純步驟。缺陷是需求特殊的儀器設(shè)備和一定的防護條件，而且有些同位素標志物的半衰期較短以及實驗廢物難以處置，對環(huán)境呵斥放射性污染。放射免疫測定法根本原理放射免疫測定是建立在待測抗原和標志抗原對有限量抗體進展競爭性結(jié)合的根底上。待測抗原是指人體內(nèi)某種微量活性物質(zhì)〔如微生物＆寄生蟲抗原、激素、維生素、酶、藥物等〕，而標志抗原使將知的上述物質(zhì)標志上放射性同位素，具有示蹤作用。將標志抗原〔Ag*〕和未標志抗原〔Ag〕與特異性抗體〔Ab〕相混合，結(jié)果構(gòu)成標志的和未標志的抗原抗體復合物。標志和未標志的抗原競爭與抗體進展結(jié)合的景象，成為競爭性抑制造用。Ag*+AbAg*-Ab標志抗原特異性抗體標志抗原抗體復合物+