大腸桿菌表達(dá)重組蛋白的超聲破碎及純化

大腸桿菌表達(dá)■組蛋白的超聲破碎及純化大腸桿菌表達(dá)重組蛋白的超聲破碎及純化一可溶性蛋白的純化（一）菌體的破碎儀器與材料：-801冰箱；超聲波細(xì)胞破碎儀；50mMPBS或50mMTris-HClpH7.5;50ml離心管；冷凍高速離心機(jī)方法2.1反復(fù)凍融2.1.1收集菌液500ml,等分10份，4000r/min4^離心15min,棄上清。2.1.2菌體沉淀中加入相同菌液體積的50mMPBS或50mMTris-HCl（選擇使蛋白穩(wěn)定的緩沖液和pH）重懸洗滌一次。2.1.3然后按原菌液體積的1/4加入緩沖液重懸菌體，并加入蛋白酶抑制劑PMSF和EDTA帶His標(biāo)簽不加）,PMSF終濃度為100四/ml,EDTA的終濃度為。取205重懸菌液進(jìn)行電泳，檢測(cè)蛋白表達(dá)的情況（是否表達(dá)，是可溶性表達(dá)還是包涵體表達(dá)）。2.1.4將菌液（經(jīng)檢測(cè)有表達(dá)）在-80度冰凍，室溫融解，反復(fù)幾次（反復(fù)凍融三次），由于細(xì)胞內(nèi)冰粒形成和剩余細(xì)胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎。2.2超聲波處理（對(duì)超聲波及熱敏感的蛋白慎用）2.2.1將反復(fù)凍融的菌液（必要時(shí)可加入1mg/ml溶菌酶，緩沖液pH>8.0，加入后需靜置20min），進(jìn)行超聲破碎，超聲條件：400W,工作5秒，間隔5秒，重復(fù)一定次數(shù)，（根據(jù)我們的儀器找出一個(gè)比較好的工作條件）。直至菌體溶液變清澈為止，大約花費(fèi)時(shí)間。2.2.2取少量經(jīng)超聲破碎后的菌液，10000rpm離心10分鐘，分別對(duì)上清和沉淀進(jìn)行檢測(cè)，并用全菌作為陽(yáng)性對(duì)照，檢測(cè)菌體破碎程度及目標(biāo)條帶占總蛋白的含量。注意事項(xiàng)：（1）超聲破碎具體條件可根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況而定，要掌握好功率和每次超聲時(shí)間，降低蛋白被降解的可能。功率大時(shí)，每次超聲時(shí)間可縮短，不能讓溫度升高，應(yīng)保持在4度左右，超聲時(shí)保持冰浴。菌體破碎后總蛋白濃度的測(cè)定可用Bradford法或者紫外吸收法?？赏ㄟ^(guò)SDS電泳觀察菌體破碎程度及目標(biāo)條帶占總蛋白的含量。二包涵體蛋白的純化1菌體的破碎(加溶菌酶處理包涵體效果可能不好，包涵體中總是有殘留的溶菌酶，你看看有沒(méi)有不加溶菌酶的，這個(gè)先保留好了)1.1儀器與材料：超聲波細(xì)胞破碎儀；20mMPBS或20mMTris-HClpH7.5；裂解液bufferA；溶菌酶10mg/ml；50ml，15ml離心管；令凍離心機(jī)1.2方法收集菌液500ml，等分1。份，4000r/min4^離心15min,棄上清。(2)菌體沉淀中加入相同菌液體積的20mMPBS或20mMTris-HCl(選擇使蛋白穩(wěn)定的緩沖液和pH，一般為7.5-8.0)，重懸洗滌2-3次，棄掉上清。(3)然后沉淀按原菌液體積每500ml以15ml預(yù)令的裂解液bufferA重懸。(有的文獻(xiàn)為每克濕菌加4ml-10ml裂解液)(4)每毫升懸液中加入100ul10mg/ml溶菌酶(即溶菌酶終濃度1mg/ml)。在冰上孵育15min對(duì)15ml懸液進(jìn)行超聲破碎，超聲條件：400W，工作5秒，間隔5秒，重復(fù)一定次數(shù)。超聲破碎時(shí)保持冰浴。具體條件可根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況而定。4。。4000rpm/min離心20分鐘所得沉淀即為包涵體。注意事項(xiàng)：融合蛋白的分子量如果大于150KD時(shí)，用超聲波破碎很容易將目標(biāo)蛋白打碎而造成降解，故可用溶菌酶先做處理.2包涵體的洗滌將包涵體沉淀重懸于含有適量脲(1-4M)的BufferA中，每克濕重加4-6ml洗滌液。超聲波處理5秒打碎沉淀，繼續(xù)用注射器吸入并擠出懸液，重復(fù)數(shù)次，4°C渦旋懸液30mino或者高速攪拌懸液10min。4C,4000rpm/min離心15分鐘。重復(fù)上述操作2次至上清液透明無(wú)色。將包涵體沉淀重懸于BufferA,4C,4000rpm/min離心15分鐘，棄掉上清。注意事項(xiàng)：包涵體洗滌時(shí)增加NaCl濃度到0.5M，有助于包涵體中雜蛋白的溶解。經(jīng)提取洗滌后得到的包涵體，由還原SDS電泳結(jié)合光密度掃描可知包涵體中目標(biāo)蛋白的含量。包涵體洗滌是純化極重要的一步，不同培養(yǎng)條件下收集的菌液經(jīng)洗滌可得到不同的純度。50mMTris-HClpH8,0.2mMEDTA,100mMNaCl,1%Tritonx-100(或2%脫氧膽酸鈉)1mMDTT1mMPMSF10mg/ml大腸桿菌表達(dá)重組蛋白的超聲破碎及純化用通常的洗滌方法，如果包涵體達(dá)不到所需的純度，可試用分級(jí)沉淀法初純包涵體，步驟如下：菌體破碎后將所得的包涵體懸浮于含6mol/L鹽酸胍的BufferA中，4C渦旋懸液30min,4000r/min離心20min，上清進(jìn)行分級(jí)沉淀。取一小部分上清用BufferA稀釋到鹽酸胍濃度為4M,然后4C渦旋懸液15min，靜置30min,4000r/min離心20min，上清繼續(xù)稀釋到3M，重復(fù)上面操作一直到2M，把每次沉淀和上清跑SDS電泳分析，看目標(biāo)蛋白在哪個(gè)鹽酸胍濃度下純度最高。摸索好條件后，直接將剩余上清直接用BufferA稀釋到所需的鹽酸胍濃度，然后4C渦旋懸液15min，靜置30min,4000r/min離心20min，沉淀既為分級(jí)沉淀后的包涵體。超聲破碎在建立表達(dá)條件過(guò)程中，小量制備樣品可用小型超聲細(xì)胞粉碎儀。離心1.0?1.5ml誘導(dǎo)后的菌液收集菌體，然后視菌體的量加入300?500ml的緩沖液重懸細(xì)胞，然后置于冰上超聲破碎。因很多實(shí)驗(yàn)室有自己的小型超聲粉碎器各個(gè)操作不盡相同，具體操作參考儀器說(shuō)明書(shū)。常規(guī)操作步驟如下(以100ml培養(yǎng)液為例)：(1)100ml誘導(dǎo)后的菌液(OD600=1.2左右)，12000rpm,4^離心2min，收集菌體。(2)加入預(yù)冷的緩沖液50ml,重懸細(xì)胞洗滌菌體一次，12000rpm,4^離心2min,收集菌體；常規(guī)的操作所使用的緩沖液多為PBS或者Tris-NaCl,針對(duì)不同的載體和純化方法，選擇相應(yīng)的緩沖液。對(duì)于一些蛋白酶敏感的目的蛋白，可以在整個(gè)操作過(guò)程中加入一些蛋白酶抑制劑。(3)向沉淀中加入15ml的緩沖液同上(若菌體太濃，可加倍)，充分懸浮，將菌懸液裝在一個(gè)玻璃小燒杯中，置于冰水混合物中。破碎：將用緩沖液洗滌過(guò)的超聲探頭伸入到菌液中，不要接觸燒杯底部，每處理30sec間隔1min使菌液冷卻，輸出強(qiáng)度為5?6,頻率為60?70%。(5)分離上清和沉淀：12000rpm,4^離心20min，分離上清和沉淀。(6)SDS分析蛋白表達(dá)情況。(7)準(zhǔn)備純化蛋白。超聲破碎注意事項(xiàng)與一些小的改進(jìn)：(1)破碎完全的判斷：超聲前菌懸液是渾濁的，超聲完全后變的透明、清澈。(2)如果超聲時(shí)出現(xiàn)黑色沉淀，說(shuō)明超聲功率太強(qiáng)。(3