巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)研究進(jìn)展課件

巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)研究進(jìn)展生科院楊軍宿主系統(tǒng)載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)表達(dá)系統(tǒng)蛋白修飾與分泌系統(tǒng)Content一、前言二、畢赤酵母簡(jiǎn)介三、畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)四、畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)化啟動(dòng)子選擇外源基因的特性基因劑量mRNA的非翻譯區(qū)翻譯后修飾產(chǎn)物的穩(wěn)定性發(fā)酵條件五、前景展望在過(guò)去的數(shù)十年中，遺傳學(xué)家致力于DNA的鑒定和基因重組的研究，而重組有機(jī)體主要應(yīng)用于蛋白質(zhì)的生產(chǎn)。由于一些蛋白具有巨大的商業(yè)價(jià)值，因此大多數(shù)研究致力于尋找能夠高效生產(chǎn)有功能蛋白的途徑。隨著蛋白質(zhì)工程和DNA重組技術(shù)的發(fā)展，諸多有應(yīng)用潛力的蛋白分子有待開(kāi)發(fā)，不同在蛋白在不同系統(tǒng)中表達(dá)水平有顯著差異，目前應(yīng)用的表達(dá)系統(tǒng)包括細(xì)菌、酵母、昆蟲(chóng)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等表達(dá)體系。其中酵母表達(dá)系統(tǒng)相對(duì)于其他表達(dá)系統(tǒng)有以下優(yōu)點(diǎn)：不存在原核表達(dá)系統(tǒng)的內(nèi)毒素難以除去的問(wèn)題，也不存在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的病毒和支原體污染等問(wèn)題；并能夠?qū)δ康牡鞍走M(jìn)行類似高等真核生物的信號(hào)肽剪切、二硫鍵形成、糖基化等過(guò)程的翻譯后蛋白加工。在酵母表達(dá)系統(tǒng)中，巴斯德畢赤酵母（Pichiapastoris,Pp)表達(dá)外源基因最理想。下面就巴斯德畢赤酵母表達(dá)的特點(diǎn)和研究進(jìn)展作一簡(jiǎn)要綜述。前言

巴斯德畢赤酵母是一種甲基營(yíng)養(yǎng)菌，能夠在低廉的甲醇培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，甲醇能高效誘導(dǎo)甲醇代謝途徑中各酶編碼基因的表達(dá)，因此生長(zhǎng)迅速、乙醇氧化酶基因AOX1所屬?gòu)?qiáng)啟動(dòng)子、表達(dá)的可誘導(dǎo)性是巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的三大優(yōu)勢(shì)。由于巴斯德畢赤酵母沒(méi)有合適的自主復(fù)制型載體，所以外源基因的表達(dá)序列一般整合入受體的染色體DNA上，因此能夠穩(wěn)定遺傳。目前已有500多種外源蛋白在巴斯德畢赤酵母系統(tǒng)中獲得成功表達(dá)。二、巴斯德畢赤酵母簡(jiǎn)介Pichiapastoris甲醇代謝途徑目前廣泛應(yīng)用于外源基因表達(dá)和研究的畢赤酵母宿主菌有兩種主要類型：營(yíng)養(yǎng)缺陷型宿主菌和蛋白酶缺陷型宿主菌三、畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)宿主系統(tǒng)營(yíng)養(yǎng)缺陷型：胞內(nèi)表達(dá)型載體分泌表達(dá)型載體轉(zhuǎn)化程序重組子在酵母細(xì)胞中的命運(yùn)用于轉(zhuǎn)化子篩選的基因標(biāo)記轉(zhuǎn)化系統(tǒng)主要有三種方法：原生質(zhì)體法：早期酵母菌的轉(zhuǎn)化都采用在等滲緩沖液中穩(wěn)定的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法，在Ca2+和PEG的存在下，轉(zhuǎn)化細(xì)胞可達(dá)原生質(zhì)體總數(shù)的1-2%；離子溶液法:酵母的完整細(xì)胞經(jīng)堿金屬離子（如Li+等）、PEG、熱休克處理后，也可高效吸收質(zhì)粒DNA。103~104個(gè)轉(zhuǎn)化子/μg

DNA；電穿孔法(electroporation)：酵母菌原生質(zhì)體和完整細(xì)胞均可在電擊條件下吸收質(zhì)粒DNA。105個(gè)轉(zhuǎn)化子/μg

DNA。轉(zhuǎn)化程序?qū)氘叧嘟湍傅闹亟M質(zhì)粒能通過(guò)同源重組整合到染色體上，不同的整合方式可產(chǎn)生不同表型的轉(zhuǎn)化子：（1）同源雙交換：表達(dá)載體線性化后，兩端分別為5’AOX1和3’AOX1序列，與基因組的同源序列發(fā)生雙交換后，導(dǎo)致畢赤酵母基因組內(nèi)AOX1編碼區(qū)被表達(dá)單元所替換，胞內(nèi)醇氧化酶只能來(lái)自AOX2基因，酶活性大大降低。因此轉(zhuǎn)化子表現(xiàn)為甲醇利用緩慢，表型為Muts。重組子在酵母細(xì)胞中的命運(yùn)

（2）特異性的單交換：表達(dá)載體在5’AOX1或3’AOX1處線性化后，與染色體基因組中的相應(yīng)序列發(fā)生同源重組，整合入AOX1基因的上游或下游。由于AOX1基因未被破壞，仍具有活性，所以轉(zhuǎn)化子能正常利用甲醇，表型為Mut+，在甲醇為唯一碳源的培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng)。通常有5%-10%轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)多拷貝整合，可用重組子上標(biāo)記基因（如G418）來(lái)篩選多拷貝轉(zhuǎn)化子，斑點(diǎn)雜交來(lái)測(cè)定外源基因拷貝數(shù)。一般情況下，整合的外源基因表達(dá)單元的拷貝數(shù)越多，表達(dá)效率越高，可直接通過(guò)SDS電泳來(lái)測(cè)定外源蛋白表達(dá)量。此外也可利用同尾酶體外構(gòu)建多拷貝重組子。

若整合發(fā)生在his4位點(diǎn)處，可能出現(xiàn)表達(dá)單元丟失現(xiàn)象，這可能是由于基因組中突變的his4與表達(dá)單元中的his4基因之間發(fā)生了基因轉(zhuǎn)換（geneconversion）所致，所以一般選擇AOX1位點(diǎn)整合。his4用于轉(zhuǎn)化子篩選的基因標(biāo)記用于畢赤酵母轉(zhuǎn)化子篩選的基因標(biāo)記主要有營(yíng)養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)基因和顯性基因：

營(yíng)養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)基因主要氨基酸和核苷酸生物合成基因，如：HIS4,ARG4（精氨酸琥珀酸裂合酶）,URA3(尿嘧啶合成酶基因）

顯性標(biāo)記基因，如Zeocin，Blasticidin（滅瘟素）,G418表達(dá)系統(tǒng)信號(hào)肽對(duì)分泌表達(dá)效率的影響畢赤酵母啟動(dòng)子的可控性常用的啟動(dòng)子有誘導(dǎo)型和組成型。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括：PAOX1、PFLD1、PICL1組成型啟動(dòng)子：PGAP（1）PAOX1：是由甲醇誘導(dǎo)的強(qiáng)啟動(dòng)子，也是畢赤酵母表達(dá)中使用最廣泛的啟動(dòng)子，AOX1基因是利用的甲醇的第一個(gè)酶基因，它的表達(dá)是在轉(zhuǎn)錄水平被調(diào)控的。具有以下優(yōu)勢(shì)：以甲醇作為唯一碳源時(shí)，才能誘導(dǎo)AOX1的表達(dá)，因此可嚴(yán)密調(diào)控外源蛋白的表達(dá)?？梢愿咝П磉_(dá)外源蛋白。畢赤酵母啟動(dòng)子的可控性缺點(diǎn)：甲醇添加時(shí)間和添加量不好掌握；甲醇易燃，大量?jī)?chǔ)存危險(xiǎn)性大；甲醇為石油化工原料，因此不適宜生產(chǎn)食用蛋白。

（2）PFLD1：FLD（Formaldehydedehydrogenase）是甲醛脫氫酶基因，是甲醇代謝途徑中的另一關(guān)鍵酶，同時(shí)參與甲胺代謝。FLD1基因既可受甲醇誘導(dǎo)，又可以受甲胺誘導(dǎo)。因此它利用甲醇或甲胺誘導(dǎo)PFLD1表達(dá)外源蛋白，當(dāng)用甲胺誘導(dǎo)時(shí)，葡萄糖或甘油可代替甲醇做為碳源。其嚴(yán)格調(diào)控和轉(zhuǎn)錄效率與PAOX1相當(dāng)。Resina等發(fā)現(xiàn)用甲醇和甲胺共誘導(dǎo)PFLD1與單純用甲醇誘導(dǎo)相比，外源蛋白R(shí)hizopusoryzaelipase（稻根霉菌脂肪酶）的表達(dá)量有所提高。（3）PICL1：檸檬酸裂合酶啟動(dòng)子是一種能以甲醇為唯一碳源誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，它能夠在畢赤酵母中高效表達(dá)葡聚糖酶。但是，關(guān)于它能否在畢赤酵母中啟動(dòng)外源蛋白表達(dá)及其誘導(dǎo)表達(dá)條件，還需要進(jìn)一步的研究。

（4）PGAP：是一種組成型表達(dá)啟動(dòng)子，不需甲醇，操作簡(jiǎn)單，誘導(dǎo)外源蛋白的表達(dá)量與PAOX1相當(dāng)。但不適宜表達(dá)對(duì)畢赤酵母有毒性作用的蛋白。因畢赤酵母只能識(shí)別很少的外源蛋白信號(hào)序列,所以更多的是利用酵母的同源信號(hào)序列,如來(lái)自畢赤酵母的酸性磷酸酶信號(hào)序列（PHO1)和釀酒酵母的α交配因子前導(dǎo)肽（α-Factorprepropeptide），其中α交配因子前導(dǎo)肽應(yīng)用最廣泛。信號(hào)肽對(duì)分泌表達(dá)效率的影響

α-Factorprepropeptide:來(lái)自釀酒酵母，由19個(gè)氨基酸殘基的前體序列和66個(gè)氨基酸的殘基的前導(dǎo)肽序列組成，其中前導(dǎo)肽序列中含有三個(gè)N-糖基化位點(diǎn)和一個(gè)Kex2蛋白內(nèi)切酶位點(diǎn)，是目前應(yīng)用最成功的信號(hào)肽。信號(hào)肽結(jié)構(gòu)的改變可能會(huì)提高分泌效率Antonio等發(fā)現(xiàn)，改造了的信號(hào)肽大大提高了外源蛋白表達(dá)量。用經(jīng)過(guò)修飾的人血清白蛋白天然信號(hào)肽可使HSA在畢赤酵母中的分泌提高幾倍。Thomas等將編碼10個(gè)氨基酸連接肽的序列插入到α-Factor與胰島素前體基因之間，使胰島素前體在畢赤酵母中的表達(dá)提高了3倍。作為真核生物，畢赤酵母可以進(jìn)行類似哺乳動(dòng)物細(xì)胞的蛋白翻譯后修飾，如信號(hào)肽加工，蛋白折疊，二硫鍵形成和糖基化修飾等蛋白修飾與分泌系統(tǒng)畢赤酵母中外源糖蛋白的糖基化：酵母菌中的蛋白糖基化修飾有兩個(gè)主要步驟，即在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜內(nèi)腔中的寡聚多糖核裝配以及在高爾基體中的糖外鏈延伸。

糖基分為兩種類型：O-糖基和N-糖基。O-寡聚多糖只有甘露糖，但許多高等真核生物的蛋白在相同的糖基化位點(diǎn)上都含有唾液酸基團(tuán)，而且糖基化位點(diǎn)也存在差異。N-寡聚多糖核與高等真核生物完全相同，但外側(cè)鏈卻有明顯差異。而這種差異往往會(huì)導(dǎo)致蛋白生物活性下降、免疫原性增加等不良影響。

線性化重組載體感受態(tài)菌株平板篩選PCR鑒定與篩選MD和MM平板篩選篩選多拷貝外源基因轉(zhuǎn)化子G418表達(dá)鑒定與篩選mRNA水平蛋白表達(dá)水平高效表達(dá)種子工程菌發(fā)酵罐工藝建立Muts和Mut+技術(shù)路線：

根據(jù)啟動(dòng)子的特性選擇

甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子如PAOX1

，但甲醇易燃，也不適用于食品生產(chǎn)，這時(shí)可選擇PGAP,但不宜用于表達(dá)對(duì)宿主有毒的蛋白。強(qiáng)啟動(dòng)子可能產(chǎn)生無(wú)功能的蛋白

由于超過(guò)宿主自身翻譯后修飾加工的能力，引起蛋白的錯(cuò)折疊、不加工或錯(cuò)定位。這是可選用較溫和的啟動(dòng)子如PPEX8(一種過(guò)氧化物酶體基質(zhì)蛋白啟動(dòng)子)。四、畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)化啟動(dòng)子的選擇

目的基因的堿基組成

基因富含A+T，會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄提前終止

種屬特異性影響

稀有密碼子制約翻譯速率此時(shí)需要進(jìn)行全基因的合成，使編碼序列符合畢赤酵母密碼子的偏愛(ài)性和具有更高的G+C含量。目的基因特性

相對(duì)劑量效應(yīng)

一般情況下，隨著整合拷貝數(shù)的增加，表達(dá)量也會(huì)增加，例如，1-8整合拷貝數(shù)范圍內(nèi)，HBsAg表達(dá)量成比例升高。但也有例外，如小牛溶菌酶的表達(dá)隨著拷貝數(shù)從1-3的上升反而減少，這可能與mRNA翻譯、蛋白折疊效率有關(guān)。

過(guò)高表達(dá)對(duì)分泌途徑抑制

對(duì)于分泌蛋白，過(guò)高表達(dá)會(huì)對(duì)分泌途徑產(chǎn)生負(fù)反饋抑制

基因劑量UTR對(duì)蛋白表達(dá)的影響主要表面在mRNA的翻譯水平上，目的蛋白mRNA5’UTR應(yīng)盡可能與AOX1mRNA相同。Sreekrishna等通過(guò)調(diào)整人血清白蛋白mRNA與AOX1mRNA的5’UTR相同后表達(dá)水平提高50倍以上。mRNA5’非翻譯區(qū)畢赤酵母糖蛋白因與哺乳動(dòng)物糖蛋白糖鏈結(jié)構(gòu)的差異而具有潛在的抗原性，使其在醫(yī)藥工業(yè)上的應(yīng)用受到一定的制約。它們?cè)诓溉閯?dòng)物體內(nèi)可被免疫系統(tǒng)清除而失去效能，而且有引起超敏反應(yīng)的危險(xiǎn)性。解決糖基化策略：嘗試胞內(nèi)表達(dá)，避免目的蛋白的糖基化；對(duì)非活性中心的糖基化位點(diǎn)進(jìn)行突變改造，清除糖基化；共表達(dá)糖鏈加工酶，使糖鏈結(jié)構(gòu)接近哺乳動(dòng)物，從而降低抗原性。

翻譯后修飾表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性

解決外源蛋白降解的三條基本途徑：在培養(yǎng)基中加入富含氨基酸和多肽的蛋白胨或酪蛋白水解物等，增加蛋白酶的底物以減少對(duì)目的蛋白的降解；調(diào)節(jié)培養(yǎng)基PH值抑制蛋白酶活性；使用蛋白酶缺陷型菌株，如SMD1168、SMD1165等溫度：必須選擇合適的溫度。溫度升高，反應(yīng)速率加大，生長(zhǎng)代謝加快，但溫度過(guò)高，又會(huì)使酶易因熱而失去活性。pH值：畢赤酵母生長(zhǎng)的pH值范圍比較寬，因此應(yīng)當(dāng)選擇適宜外源蛋白表達(dá)的pH值。溶氧量：甲醇代謝過(guò)程中需要消耗大量氧，因此在發(fā)酵過(guò)程及時(shí)補(bǔ)充畢赤酵母代謝所需要的氧氣對(duì)于外源蛋白表達(dá)量是至關(guān)重要的。甲醇的濃度和監(jiān)測(cè)：在發(fā)酵過(guò)程中，需要定期補(bǔ)加一定量的甲醇以補(bǔ)償甲醇的消耗和揮發(fā)。一般液體培養(yǎng)時(shí)，補(bǔ)加甲醇的終深度達(dá)到0.5%即可。但具體情況需要根據(jù)試驗(yàn)而定，同時(shí)可以根據(jù)溶氧和氣象色譜控制甲醇流加。發(fā)酵條件

近年來(lái)，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)應(yīng)用的范圍