轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)課件

轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)

---轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建李懿萍2010.05.201/6/20241基因打靶的簡易程序1/6/20242優(yōu)點：外源基因整合情況的可控性高可預先在細胞水平檢測外源基因的拷貝數(shù)、定位、表達的水平及插入的穩(wěn)定性外源基因?qū)隕S細胞的方法多樣，細胞鑒定及篩選方便缺點：ES細胞系建立及培養(yǎng)困難維持ES細胞的未分化及多向分化潛能不易所得個體為嵌合體胚胎干細胞（ES細胞）法1/6/202431/6/20244主要是利用反轉(zhuǎn)錄病毒的長末端重復序列(LTR)區(qū)域具有轉(zhuǎn)錄啟動子活性的特點,將外源基因連接到LTR下游進行基因重組后,再包裝成為高滴度病毒顆粒,去直接感染受精卵或顯微注入囊胚腔中,攜帶外源基因的反轉(zhuǎn)錄病毒DNA可以整合到宿主染色體上。3、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法1/6/202453、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法優(yōu)點由于反轉(zhuǎn)錄病毒的高效率感染和在宿主細胞DNA中的高度整合特性,大大提高基因轉(zhuǎn)移的效率細菌質(zhì)粒和噬菌體載體只能將目的基因運載至細菌中擴增和表達。病毒載體是較理想的真核基因工程載體缺點獲得純合體的轉(zhuǎn)基因動物的機會少病毒載體構(gòu)建復雜轉(zhuǎn)入的外源基因的大小受到限制,<10kb轉(zhuǎn)入病毒自身基因的復制表達1/6/20246優(yōu)點減少受體動物的數(shù)目,不需要用受體母畜來承擔那些非轉(zhuǎn)基因的胚胎,表現(xiàn)了強大的生命力。事先在細胞中進行基因轉(zhuǎn)移和對陽性細胞進行篩選,簡化了轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)的許多環(huán)節(jié),節(jié)約了人力,具有很大的優(yōu)越性。缺點體細胞克隆技術(shù)近年來發(fā)展勢頭十分迅猛,但在基礎(chǔ)理論和實驗技術(shù)上還需進一步探索。4、體細胞核移植法1/6/202495、精子載體法將精子與外源DNA進行預培養(yǎng)之后,使精子有能力攜帶外源基因進入卵中,受精后進行胚胎移植,這樣產(chǎn)生的動物也會使外源基因得到表達。精子攜帶DNA的途徑 外源DNA與精子共孵育 電穿孔導入法 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法1/6/202410優(yōu)點基因轉(zhuǎn)化方法簡便,效率高動物育種不經(jīng)過嵌合體,實驗周期短缺點目的基因整合的隨機性無法早期驗證修飾事件成功率不高、效果不穩(wěn)定5、精子載體法1/6/2024116、YAC法（人工酵母染色體法）優(yōu)點：克隆百萬堿基對(Mbp)級的大片段外源DNA的能力,可以保證巨大基因的完整性;保證所有順式作用因子的完整并與結(jié)構(gòu)基因的位置關(guān)系不變;保證較長的外源基因片段在轉(zhuǎn)基因動物研究中整合率的提高;鑒于基因的完整性,目的基因上下游的側(cè)翼序列可以消除或減弱基因整合的位置效率。缺點：不穩(wěn)定，制備工藝繁瑣。1/6/2024127、BAC法（人工細菌染色體法）建立在大腸桿菌的F因子上的BAC載體：外源DNA可>300kb。F因子（F質(zhì)粒）是一種“性質(zhì)?！保赊D(zhuǎn)移至F-宿主細胞。100kb,近百個蛋白質(zhì)?？蓸?gòu)建BAC文庫；有單一的loxp位點，利于圖譜分析（借助標記loxp和cre

重組酶；

BAC載體兩端有Sp6和T7引物序列利于測序，確定基因的染色體定位；可穩(wěn)定遺傳，易于操作。BAC文庫：基因組酶切后100～300kbDNA+BAC

大腸桿菌1/6/202413方法顯微注射核移植胚胎干細胞逆轉(zhuǎn)錄病毒基因敲除精子介導優(yōu)點外源基因整合效率較高，不需要載體，目的基因的長度可達100Kb轉(zhuǎn)基因效率高；預測基因表達水平；可以使用定點整合技術(shù)外源DNA的整合率高；

整合在生殖細胞中的比例也很高。

可在整合點整合轉(zhuǎn)移基因的單個拷貝；該方法簡單、方便缺點精密儀器，技術(shù)操作較難，易造成宿主動物基因組的插入突變供體細胞易衰老ES細胞株不易建立，長期培養(yǎng)后出現(xiàn)分化現(xiàn)象；生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因動物都是嵌合體

插入的基因有大小限度；嵌合性很高；外源DNA在動物各種組織中的分布不均

應用具有一定局限性有些結(jié)果不能重復

基因轉(zhuǎn)移方法的比較1/6/202414Electroporation1/6/202415電擊儀1/6/2024161/6/2024171/6/2024181/6/2024191234561/6/2024201256431/6/2024211/6/2024221/6/2024231/6/202424

轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)

---轉(zhuǎn)基因小鼠在科研中的應用1/6/2024251.

7500萬－1.25億年前--人鼠始祖小鼠的歷史2.

19世紀--寵物鼠---實驗鼠的“先驅(qū)”3.

1897年--重組表型

1/6/2024264.

1900年--從寵物鼠到實驗鼠AbbieLathrop----飼養(yǎng)寵物鼠1902年，WilliamErnestCastle購買老鼠，用于遺傳學研究。哈佛大學---老鼠的毛色進行觀察，以檢測孟德爾法則的正確性。小鼠的歷史5.

1905年--孟德爾老鼠

通過對黃白相間的雜色鼠進行研究，法國遺傳學家LucienClaudeCuéno發(fā)現(xiàn)，兩個攜帶黃色皮毛基因的老鼠之間交配，其子代老鼠中黃色老鼠和白色老鼠的數(shù)量比總是2:1。--這是報道的第一個等位純合致死的基因。

1/6/202427ClarenceCookLittle是一個來自于WilliamCastle實驗室的哈佛大學生物學家，他培育出了第一個近親繁殖的小鼠株系――DBA。小鼠的歷史6.

1909年--實驗鼠的誕生ClarenceLittle和ErnestTyzzer發(fā)現(xiàn)在同一株系小鼠間進行腫瘤移植不會產(chǎn)生排斥現(xiàn)象，但不同株系間的移植則會發(fā)生排斥反應。7.

1916年--腫瘤易受性和組織相容性

Jackson實驗室的GeorgeSnell在1940年代發(fā)現(xiàn)了組織相容性基因---榮獲了1980年的諾貝爾獎

1/6/2024288.

1921年--C57BL株系基因組測序在2002年完成小鼠的歷史9.

1929年--Jackson實驗室---世界上最重要的小鼠遺傳學研究中心在Hudson汽車公司的頭目EdselFord和RoscoeJackson兩位大財主的資助下，CharenceLittle在美國緬因州BarHarbor建立了Jackson實驗室1/6/20242910.

1953年--DNA雙螺旋Crick，Watson和Wilkins三人因為這項杰出的成就榮獲了1962年的諾貝爾獎。11.

1966年--遺傳密碼破譯

RobertHolly，HarGobindKhorana和MarshallNirenberg破譯了遺傳密碼---1968年的諾貝爾獎

小鼠的歷史1/6/20243012.

1972年---小鼠遺傳學的計算機數(shù)據(jù)庫

Jackson實驗室設(shè)計了第一個哺乳動物遺傳學計算機數(shù)據(jù)庫13.

1977年--Sanger測序法和同事WalterGilbert分享了1980年的諾貝爾化學獎---人類和小鼠基因組測序過程中的主要技術(shù)14.

1982年--轉(zhuǎn)基因小鼠

小鼠的歷史1/6/20243116.

1987-89年--第一只基因敲除小鼠

MartinEvans，OliverSmithies和MarioCapecch領(lǐng)導的幾個研究小組---2001獲得了Lasker獎17.

1996年--“百慕大法則”

公共基因組序列數(shù)據(jù)18.

1998年

--克隆鼠

1997年克隆羊“多莉”誕生之后，夏威夷的一個小組培育出了第一批克隆鼠——“Cumulina”和她的姐妹們。15.

1983年--PCR

KaryMullis--1993年的諾貝爾獎

小鼠的歷史1/6/20243219.

1999年--小鼠基因組測序協(xié)會人類基因組三個主要測序中心（TheWellcomeTrustSangerInstitute,TheWhiteheadCenterforGenomeResearch和WashingtonUniversityGenomeSequencingCenter）成立了一個相互協(xié)作的小鼠基因組測序機構(gòu)，取名為小鼠基因組測序協(xié)會（MouseGenomeSequencingConsortium,MGSC)20.

2001年2月--人類基因組

21.

2001年6月--散彈法美國公司CeleraGenomics使用散彈法測得了用于銷售的小鼠序列草圖。散彈法是一種一次性測得基因組全序列的技術(shù)。小鼠的歷史1/6/20243322.

2002年5月--16號染色體與已被分析的人類

21號染色體序列高度相似23.

2002年8月--小鼠基因組物理圖譜

24.

2002年12月

--小鼠基因組小鼠基因組測序協(xié)會發(fā)表了一份高質(zhì)量的小鼠基因組序列草圖，并且同時對C57BL/6J小鼠株系做了分析。這個基因組大小約為2.5Gb，比人類基因組要小，預計的基因也少于30000個。約有40%的小鼠和人類基因組序列相高度似性，80%的人類基因在小鼠基因組中能找到相應的基因。同時還有不少文章對小鼠遺傳組成的其它方面做了詳細討論。在日本RIKEN基因組科學實驗室的努力下，很多相關(guān)的重要資源都能夠被免費獲取。

小鼠的歷史1/6/202434轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)的應用基因表達調(diào)控、基因功能及發(fā)育調(diào)控作用的研究基因工程定向育種轉(zhuǎn)基因動物生物反應器研制人類疾病小鼠模型與基因治療藥理學研究器官移植環(huán)境科學研究1/6/202435基因表達調(diào)控、基因功能及發(fā)育調(diào)控作用的研究Hoxgene(同源異形盒基因）疾病基因?qū)W習與記憶基因生理周期基因基因表達有時空與組織的特異性；外源基因的表達受特異性有關(guān)順式作用序列的調(diào)控；1/6/202436基因工程定向育種向動物體轉(zhuǎn)移外源基因并使之在動物體內(nèi)表達，能夠克服物種間固有的生殖隔離，實現(xiàn)動物育種之間遺傳物質(zhì)的交換。實質(zhì)是將基因轉(zhuǎn)移與傳統(tǒng)育種方法結(jié)合，各取其精華，快速創(chuàng)造新的目的變異和固定擴展變異，從而快速培育出高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)和抗逆動物品種。轉(zhuǎn)基因羊、豬、雞、魚、鼠等1/6/202437轉(zhuǎn)基因動物生物反應器研制轉(zhuǎn)基因動物生物反應器概念：將具某種重要應用價值的生物活性蛋白基因?qū)雱游锸芫鸦蛟缙谂咛?，培育轉(zhuǎn)基因動物，使外源基因在動物的特定組織內(nèi)高效表達，再從這些組織的分泌液、浸出液或血清中分離提取目的基因產(chǎn)物。乳腺---理想器官腎臟和膀胱多肽藥物、蛋白質(zhì)疫苗、酶類細菌-動物細胞-轉(zhuǎn)基因動物1/6/202438乳腺生物反應器具有以下特點：

⑴乳腺是自我封閉系統(tǒng)，乳腺表達的蛋白質(zhì)不回流到血液循環(huán)系統(tǒng)，避免外源基因表達的蛋白質(zhì)對動物本身的影響；

⑵乳腺組織是一種有效的蛋白質(zhì)合成器；

一頭奶牛一年可生產(chǎn)乳蛋白250—300Kg，一只綿羊或山羊 一年可生產(chǎn)乳蛋白25—30Kg。如果有百分之一的乳蛋白代 換成醫(yī)用蛋白，產(chǎn)量十分可觀。

⑶乳腺分泌的基因產(chǎn)物不但產(chǎn)量高，而且易提純。表達的蛋白經(jīng)過充分的修飾加工，具有穩(wěn)定的生物活性。生物活性接近天然產(chǎn)品；

⑷在動物乳腺表達的外源基因可以遺傳，可用常規(guī)技術(shù)繁殖生產(chǎn)群體。轉(zhuǎn)基因動物生物反應器研制1/6/202439轉(zhuǎn)基因動物生物反應器研制乳腺組織特異表的基因：具milkbox保守序列----乳清蛋白基因 ----b乳球蛋白基因 ----酪蛋白基因已開發(fā)的產(chǎn)物： ----血栓治療藥物（組織型纖溶酶原激活因子)----出血性疾?。蜃覸III，IX） ----免疫治療藥物（IFN，IL，TNF） ----營養(yǎng)制劑(人乳鐵蛋白）1/6/202440人類疾病小鼠模型與基因治療癌癥---肺癌---p53功能缺陷遺傳病---地中海貧血（臨床失敗---細胞表達？）AD

---對AD患者死亡后腦部解剖發(fā)現(xiàn)腦部存積了一種β淀粉狀蛋白

----將人類β淀粉狀蛋白的基因轉(zhuǎn)到大鼠體內(nèi)使其發(fā)病，再清除β淀粉狀蛋白，發(fā)現(xiàn)能夠減慢甚至停止病情1/6/202441藥理學研究胰島b細胞B7-1轉(zhuǎn)基因小鼠對STZ敏感阿霉素抗癌，但心臟毒性等副作用大

---金屬硫蛋白MT具保護作用P糖蛋白---腫瘤多藥耐藥

---knockoutmice證實其影響藥物的分布與清除1/6/202442器官移植超急性排斥反應補體激活的阻斷---免疫抑制劑危險補體活性調(diào)節(jié)因子的負調(diào)控 ---膜輔助因子MCP ---衰退促進因子hDAP/hCD591999---豬心—獼猴（器官大?。?/6/202443環(huán)境科學研究生物可利用性的分析只能在活體研究毒理/環(huán)境基因組學轉(zhuǎn)基因線蟲---HSP16/lacZ1/6/202444轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)的主要問題外源基因的整合率低外源基因的表達不理想成本高轉(zhuǎn)基因給動物造成插入突變和機能紊亂轉(zhuǎn)基因動物成活率低轉(zhuǎn)基因動物產(chǎn)品的安全性改善外源基因轉(zhuǎn)移方法定點整合-cre/loxp組織特異性啟動子生態(tài)/遺傳/食品安全結(jié)合動物克隆技術(shù)--Dolly&Polly1/6/2024451/6/202446參考文獻現(xiàn)代細胞分子生物學技術(shù)---科學出版社，林菊生主編精編分子生物學實驗指南---科學出版社，顏子穎/王海林譯小鼠胚胎操作實驗手冊---化學工業(yè)出版社，孫青原/