生物制藥技術2-基因構建課件

生物制藥技術朱俊銘2016-3-71《生物制藥技術（含實驗）》課程教學大綱2生物制藥研發(fā)的基本流程3基因構建發(fā)酵培養(yǎng)分離純化制劑研究質量研究中試放大穩(wěn)定性研究藥效學研究安全藥理研究臨床申報藥學(實驗室)藥學(中試)藥理學臨床試驗2.1基因與工程細胞構建2.2工程細胞的發(fā)酵培養(yǎng)與蛋白表達2.3重組蛋白的分離純化2.4生物制藥的制劑研究2.5生物制藥的質量研究與分析技術2.6生物制藥的中試研究2.7生物制藥的穩(wěn)定性研究第二章重組蛋白藥物的藥學概論原核細胞真核細胞42.1.1基本概念2.1.2質粒、載體2.1.3工程細胞與細胞庫2.1.4表達方式選擇2.1.5基因構建與誘導表達2.1.6實例2.1基因與工程細胞構建5第二章重組蛋白藥物的藥學概論2.1

基因與工程細胞構建基因重組——分子水平、提取、連接、轉染、復制、表達別稱——基因工程、DNA重組、遺傳工程、基因操作、克隆工程細胞的三要素基因載體宿主細胞62.1.1基本概念2.1.2質粒、載體2.1

基因與工程細胞構建92.1

基因與工程細胞構建102.1

基因與工程細胞構建11克隆鑒定宿主細胞細胞篩選細胞庫合成、分離、RT-PCR優(yōu)化、測序抗性基因、限制性內切酶位點宿主與產品的相關性表達水平、產品鑒定三級細胞庫、遺傳穩(wěn)定性載體2.1

基因與工程細胞構建122.1.3工程細胞與細胞庫原始種子庫主種子庫工作種子庫2.1

基因與工程細胞構建13調控調控生物遺傳中心法則DNARNAProtein2.1

基因與工程細胞構建14蛋白質結構PrimaryStructure——ThesequenceofaminoacidsonthepolypeptidechainSecondaryStructure——Conformationofthepolypeptidechain(3Dstructure)TertiaryStructure——ThreeDimensionalStructure(Folding)oftheproteinQuaternaryStructure——Complexationwithotherproteins(Similarordissimilarstructures)2.1基因與工程細胞構建152.1.4表達方式選擇依賴于制備過程的蛋白質結構Prokaryoticcells

EasiertomakeCheapertoproduceImproperfoldingofproteinNoglycosylationNoSecretionEukaryoticcells

CanproperlyfoldtheproteinGlycosylate-(maybedifferently)HardertocloneHardertomaintainincellcultureMayharborviruses

LoweryieldsHigherexpense2.1基因與工程細胞構建162.1.4表達方式選擇2.1.5基因構建與誘導表達2.1基因與工程細胞構建172.1基因與工程細胞構建182.1.5基因構建與誘導表達SolubleInclusionBodySecreting2.1

基因與工程細胞構建原核細胞表達系統(tǒng)192.1.5基因構建與誘導表達優(yōu)點突出正確指導蛋白質正確折疊提供糖基化等多種翻譯后加工在新基因發(fā)現(xiàn)、蛋白質結構功能研究中起極為重要的作用生產階段系統(tǒng)表達水平達到7g/L生物醫(yī)藥產業(yè)發(fā)達國家新藥研發(fā)中均選擇哺乳動物細胞表達系統(tǒng)2.1基因與工程細胞構建哺乳動物細胞表達系統(tǒng)202.1.5基因構建與誘導表達正常細胞生長特性錨地依賴性血清依賴性接觸抑制性形態(tài)依賴性體外培養(yǎng)正常細胞改變某些特征，越過生理臨界點，繼續(xù)無限制分裂——細胞系形成2.1基因與工程細胞構建哺乳動物細胞表達系統(tǒng)212.1.5基因構建與誘導表達哺乳動物細胞表達系統(tǒng)受體細胞條件細胞系特征——喪失細胞接觸抑制和錨地依賴性遺傳穩(wěn)定性——外源基因多次傳代不丟失合適的標記——便于篩選與維持生長快且齊——分裂周期短，生長均一安全性——不合成、分泌致病物質，不致癌以高效表達外源基因為目標的高等哺乳動物受體細胞必須條件2.1基因與工程細胞構建222.1.5基因構建與誘導表達遺傳標記哺乳動物細胞表達系統(tǒng)2.1

基因與工程細胞構建232.1.5基因構建與誘導表達常用宿主細胞商業(yè)化CHO——中國倉鼠卵巢細胞系BHK——小倉鼠腎細胞系COS——非洲綠猴腎成纖維細胞系NSO——小鼠骨髓瘤細胞系SP2/0——小鼠骨髓瘤細胞系HEK293——人胚腎細胞系NIH313——鼠成纖維細胞系因穩(wěn)定性與糖基化不同，根據(jù)表達目的蛋白選擇適當細胞系哺乳動物細胞表達系統(tǒng)2.1

基因與工程細胞構建242.1.5基因構建與誘導表達真核表達載體必要原件高活性啟動子、轉錄終止序列、有效mRNA翻譯信號復制子、抗生素抗性基因、限制性酶切位點標志基因內含子內部核糖體進入位點（IRES）哺乳動物細胞表達系統(tǒng)2.1

基因與工程細胞構建

一般真核mRNA的翻譯都需要5'帽子來介導核糖體結合，但真核生物和病毒中還存在一些例外情況，例如一些基因5'端具有一段較短的RNA序列（約150-250bp），這類RNA序列能折疊成類似于起始tRNA的結構，從而介導核糖體與RNA結合，起始蛋白質翻譯，這段非翻譯RNA被稱為內部核糖體進入位點序列（Internalribosomeentrysite,IRES）252.1.5基因構建與誘導表達誘導的方式IPTG/乳糖低溫pH低磷表達檢測方式表達標志物電泳GFP遺傳穩(wěn)定性基因穩(wěn)定性——瓊脂糖電泳、指紋圖譜、PCR、測序表達穩(wěn)定性——表達標志物、活性四環(huán)素蛻皮激素他可莫斯/雷帕霉素RU4862.1

基因與工程細胞構建262.1.5基因構建與誘導表達高效表達外源蛋白的基本原理通過強化基因擴增高效表達外源基因DHFR-MTX高效表達系統(tǒng)哺乳動物細胞表達系統(tǒng)2.1

基因與工程細胞構建272.1.5基因構建與誘導表達組織纖溶酶原激活劑第一個重組哺乳動物細胞規(guī)?；a的溶栓藥物——人組織纖溶酶原激活劑(tPA)目前市場上銷售的阿替普酶(tPA)采用DHFR-MTX系統(tǒng)表達，受體細胞為CHO系統(tǒng)人tPA也可由大腸桿菌生產，但蛋白折疊效率低2.1

基因與工程細胞構建282.1.6實例組織纖溶酶原激活劑2.1基因與工程細胞構建292.1.6實例組織纖溶酶原激活劑2.1基因與工程細胞構建302.1.6實例tPArPA

527個氨基酸分子量65kD缺失突變

355個氨基酸

分子量39kDKringleⅡ、絲氨酸蛋白酶區(qū)Finger區(qū)、KringleⅠ、KringleⅡ、EGF區(qū)、絲氨酸蛋白酶區(qū)2.1

基因與工程細胞構建組織纖溶酶原激活劑312.1.6實例2.1基因與工程細胞構建組織纖溶酶原激活劑322.1.6實例載體：pET-44a宿主