細(xì)胞化學(xué)術(shù)課件

細(xì)胞（組織）化學(xué)技術(shù)

發(fā)展史：細(xì)胞化學(xué)是研究細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)的化學(xué)組成及其定位的科學(xué)（定量）。研究對(duì)象是生物大分子：核酸、蛋白質(zhì)、酶、多糖、脂類等在細(xì)胞或組織內(nèi)的結(jié)構(gòu)、分布及變化，為深入闡明細(xì)胞和異常細(xì)胞的增值與分化、遺傳與發(fā)生、病理和病因等提供科學(xué)依據(jù)。1830年比利時(shí)植物學(xué)家Raspail發(fā)表論文《在生理學(xué)重視用顯微鏡觀察生化物質(zhì)》。1830-1870組織化學(xué)主要用于揭示生物界中的生理現(xiàn)象。1880-1920隨著顯微鏡的改進(jìn)和組織細(xì)胞學(xué)染色技術(shù)的發(fā)展，組織化學(xué)的概念從生理組織學(xué)轉(zhuǎn)變?yōu)轱@微化學(xué)。1900-1935年細(xì)胞化學(xué)技術(shù)在病理學(xué)染色方法中的應(yīng)用，豐富了顯微鏡下證實(shí)核酸、蛋白質(zhì)、酶、多糖、脂類等物質(zhì)的組織化學(xué)內(nèi)容。以后發(fā)展了酶細(xì)胞化學(xué)。20世紀(jì)50年代，電子顯微鏡的問(wèn)世，觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。到80年代末，發(fā)展與完善了電鏡細(xì)胞化學(xué)。70年代由于細(xì)胞顯微分光光度法和熒光顯微光度法的建立，使細(xì)胞化學(xué)的成分得以定量、形成定量細(xì)胞化學(xué)。80-90年代，流式細(xì)胞儀可對(duì)單細(xì)胞化學(xué)成分定量分析的新技術(shù)（每秒可測(cè)上萬(wàn)個(gè)信息）。80年代后期，創(chuàng)立了激光掃描共聚焦顯微技術(shù)，對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行CT分析，通過(guò)計(jì)算機(jī)進(jìn)行三微立體旋轉(zhuǎn)，從各角度分析細(xì)胞深層和細(xì)胞表面的各種結(jié)構(gòu)?？裳芯炕罴?xì)胞和定量分析細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)DNA、RNA、細(xì)胞器、酶的含量等。

基本原理：細(xì)胞中的某種化學(xué)成分和其相應(yīng)的底物呈現(xiàn)一系列的化學(xué)反應(yīng)，形成在顯微鏡下可見(jiàn)到的反應(yīng)產(chǎn)物。對(duì)細(xì)胞內(nèi)的各種成分進(jìn)行定性、定位、定量研究。（特異性）常用方法及原理：一

金屬-金屬鹽沉淀法原理利用金、銀、銅、鐵、鈷等金屬化合物與細(xì)胞化學(xué)成分反應(yīng)過(guò)程中生成有色沉淀。二偶氮偶聯(lián)法原理用人工的酶底物，在酶的作用下產(chǎn)生分解產(chǎn)物，后者與重氮鹽結(jié)合，引起偶氮偶聯(lián)法反應(yīng)，形成不溶性偶氮色素。三過(guò)碘酸Schiff氏劑反應(yīng)原理四多糖（糖原）+過(guò)碘酸→醛基+Schiff氏劑→紫紅色化合物顯示細(xì)胞內(nèi)糖類為PAS反應(yīng)顯示細(xì)胞核內(nèi)為Feulgen反應(yīng)

五色素形成法顯示酶定位的方法某化學(xué)物質(zhì)在酶作用下在細(xì)胞局部形成色素沉淀，包括四唑鹽法、聯(lián)苯胺色素法、黑色素形成法等。其中四唑鹽法用于定性各種氧化還原酶、多種脫氫酶、轉(zhuǎn)移酶等。還有脫氫酶顯示法、底物標(biāo)記法、熒光染色與免疫熒光法、酶標(biāo)抗體法等。

具體幾項(xiàng)細(xì)胞化學(xué)技術(shù)簡(jiǎn)介：（一）。孚爾更反應(yīng)顯示DNA方法(Feulgen)用弱酸（!NHCL）水解析飽和中DNA，打開嘌呤鹼基和脫氧核糖核酸連接的雙鏈，釋放出醛基，與Schiff試劑結(jié)合→紫紅色化合物。用顯微分光光度計(jì)定量分析。（二）。甲綠—派郎寧顯示DNA和RNA甲綠染DNA，派郎寧染RNA，它們并不是化學(xué)作用，而是與兩種核酸的聚合程度有關(guān)。結(jié)果細(xì)胞核的DNA綠色→蘭綠色，核仁和胞質(zhì)的RNA呈紅色。（三）。丫叮橙（AO）熒光染色顯示DNA和RNA

AO熒光染料與多聚體的DNA和RNA具有親和力。結(jié)果細(xì)胞核的DNA亮綠色→黃綠色熒光，核仁和胞質(zhì)的RNA呈紅色熒光。（四）。多糖的顯示法—過(guò)碘酸雪夫（Schiff）氏劑反應(yīng)多糖（糖原）+過(guò)碘酸→醛基+Schiff氏劑→紫紅色化合物（五）。酶的顯示1．

堿性磷酸酶的顯示（鈣-鈷法）用磷酸脂為底物，被堿性磷酸酶水解后釋放出磷酸基，在pH9。2—9。8條件下，磷酸基與鈣形成磷酸鈣（無(wú)色）+硝酸鈷→磷酸鈷（無(wú)色）+黃色硫化胺→硫化胺鈷（黑色）結(jié)果堿性磷酸酶成淺灰、灰黃、灰黑色。色深者表示酶多。對(duì)照組無(wú)反應(yīng)。ATPase

ATPase

G-6-Pase

G-6-Pase

G-6-Pase

G-6-Pase

4．5-核苷酸酶的顯示法（5-Nucleoyidase）此酶作用于5-核苷酸、水解嘌呤核苷酸或嘧啶核苷酸第五位碳原子的磷酸分子，釋放磷酸基+硝酸鉛→磷酸鉛（黑色）。結(jié)果5-核苷酸酶呈棕黑色沉淀，色深者表示酶多。對(duì)照組無(wú)反應(yīng)。

免疫細(xì)胞化學(xué)術(shù)

應(yīng)用抗原與抗體結(jié)合的免疫學(xué)原理，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的多肽、蛋白質(zhì)及膜抗原和受體等大分子物質(zhì)的存在與分布。其特點(diǎn)是特異性強(qiáng)、敏感性高、進(jìn)展迅速，應(yīng)用廣泛。程序：﹙1﹚抗原（提取動(dòng)物某些肽類或蛋白質(zhì)）→注入另一動(dòng)物體內(nèi)→產(chǎn)生抗體（Ig）→血清分離提取抗體﹙2﹚抗體標(biāo)記抗體+熒光素（異硫氰酸熒光素）→與相應(yīng)抗原結(jié)合呈黃綠色熒光抗體+辣根過(guò)氧化物酶（HRP）→與相應(yīng)抗原結(jié)合呈棕紅色熒光

方法：（1）

直接法

抗原——抗體直接結(jié)合簡(jiǎn)便、迅速，但是敏感性較低。（2）間接法一抗體（作為抗原）→注入物體內(nèi)→產(chǎn)生第二抗體常用過(guò)氧化物酶——抗過(guò)氧化物酶復(fù)合物法（PAP法）。較復(fù)雜，敏感性高（3）新進(jìn)展

親合素（卵白素）——生物素法（LAB法）橋連親合素（卵白素）——生物素法（BAB法）親合素——生物素——過(guò)氧化物酶復(fù)合物法（ABC法）(市場(chǎng)商品)

組織培養(yǎng)術(shù):

體外研究活細(xì)胞或組織的有價(jià)值的手段無(wú)菌條件下，取活組織、活細(xì)胞（或傳代培養(yǎng)的細(xì)胞株）→培養(yǎng)液（天然或人工合成），在一定溫度、O2、CO2、、Ph→培養(yǎng)（加某種受試因素）→倒置顯微鏡下觀察：細(xì)胞活組織的增殖、分化、運(yùn)動(dòng)、吞噬等?？蛇B續(xù)錄像觀察。

正常培養(yǎng)細(xì)胞

中藥組細(xì)胞

西藥組細(xì)胞對(duì)照組細(xì)胞

中藥組細(xì)胞

原位雜交術(shù):

即核酸分子雜交組織化學(xué)術(shù)?；驹恚簝蓷l核苷酸單鏈片段，在適宜的條件下，通過(guò)氫鍵結(jié)合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA雙鏈分子的特點(diǎn)，應(yīng)用帶有標(biāo)記的（有放射性同位素，如3H、35S、32P、熒光素、生物素、地高辛等放射性物質(zhì)）DNA或RNA片段作為核酸探針，與組織切片或細(xì)胞內(nèi)待測(cè)核酸（RNA或DNA）片段進(jìn)行雜交，然后可用放射自顯影等方法予以顯示。在光鏡或電鏡下觀察目的mRNA或DNA的存在與定位。用此技術(shù)可在原位研究細(xì)胞合成某種多肽或蛋白質(zhì)的基因表達(dá)。此方法有極高的敏感性和特異性，可進(jìn)一步從分子水平探討細(xì)胞的功能表達(dá)及其調(diào)控機(jī)制，已成為當(dāng)今細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)研究的重要手段。

放射自顯影術(shù):

是通過(guò)活細(xì)胞對(duì)放射性物質(zhì)的特異性攝入，以顯示該細(xì)胞的功能狀態(tài)、或該物質(zhì)在組織或細(xì)胞內(nèi)的代謝過(guò)程。將放射性同位素或放射性同位素標(biāo)記的物質(zhì)注入體內(nèi)，間隔一定時(shí)間后取材、制備切片，并在其上面涂以感光材料（感光乳膠或貼以照相底片），置暗處暴光，再顯影、定影。結(jié)果，在放射性同位素或其標(biāo)記物存在的部位，溴化銀被還原為黑色的微細(xì)顆粒，可在光鏡或電鏡下觀察，從而獲知被檢物質(zhì)在組織或細(xì)胞內(nèi)的分布及相對(duì)含量。在注入同位素標(biāo)記物后，如果有規(guī)律地在若干時(shí)間段取材，則可以觀察到被檢物質(zhì)的動(dòng)態(tài)分布及變化過(guò)程，如將131I注入體內(nèi)可以觀察碘在甲狀腺濾泡內(nèi)的代謝情況；將3H標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷注入體內(nèi)，就能研究蛋白質(zhì)或核酸在組織、細(xì)胞內(nèi)的代謝過(guò)程。

組織工程:

是用細(xì)胞培養(yǎng)術(shù)在體外模擬構(gòu)建機(jī)體組織或器官的技術(shù)。組織工程主要包括以下四方面：①獲取生長(zhǎng)旺盛的細(xì)胞,即種子細(xì)胞。②準(zhǔn)備細(xì)胞外基質(zhì)，包括生物材料(如牛膠原)及無(wú)毒、可被機(jī)體吸收的人工合成高分子材料。③構(gòu)建組織或器官，即有目的地把種子細(xì)胞置于細(xì)胞外基質(zhì)中進(jìn)行三維培養(yǎng)，并形成所需要的形狀。④將構(gòu)建物移植機(jī)體。目前正在研究構(gòu)建的組織器官主要有皮膚、軟骨、骨、肌腱、骨骼肌、血管及角膜等；其中以組織工程皮膚較為成功并已應(yīng)用于臨床治療燒傷、皮膚靜脈性潰瘍等疾病。軟骨組織工程研究進(jìn)展實(shí)驗(yàn)中的組織工程“耳”

CaoYL，etal:Transplantationofchondrocytesutilizingapolymer-cellconstructtoproducetissueengineeredcartilageintheshapeofahumanear

PlasticReconstrSurg,1977,100:297

實(shí)驗(yàn)中的組織工程“耳”制備程序1、將人的耳廓印下來(lái)，制成石膏軟件。2、生物材料（聚乙醇酸）形成耳廓模型。3、取小牛關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，加入到耳廓模型中，體外細(xì)胞培養(yǎng)(1周）。4、將耳模型植入到裸鼠背部。5、4周后生長(zhǎng)形成與人耳外形相同的“人耳”。5．形態(tài)計(jì)量術(shù)形態(tài)計(jì)量術(shù)是研究組織和細(xì)胞內(nèi)各種有形成分的數(shù)量、體積、表面積等項(xiàng)的絕對(duì)或相對(duì)值的方法。研究機(jī)體某些結(jié)構(gòu)的立體數(shù)值的科學(xué)，稱為體視學(xué)數(shù)值以“量”的概念進(jìn)一步闡述了結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系及其病理狀態(tài)下發(fā)生的變化。目前常用的精密定量方法有以下幾種：（1）顯微分光光度術(shù)顯微分光光度術(shù)是顯微鏡技術(shù)與分光光度技術(shù)的結(jié)合，可測(cè)出細(xì)胞內(nèi)各種化學(xué)成分的含量，如測(cè)定蛋白質(zhì)、酶、脂類、糖及DNA與RNA等含量。（2）顯微熒光光度術(shù)顯微熒光光度術(shù)是利用對(duì)細(xì)胞內(nèi)原有發(fā)熒光的物質(zhì)，或?qū)?xì)胞內(nèi)各種化學(xué)成分用不同熒光素標(biāo)記后，進(jìn)行定性、定位和定量的測(cè)量。（3）流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù)是一種對(duì)流體單個(gè)細(xì)胞及其它生物微粒進(jìn)行快速定量分析與分選技術(shù)。同時(shí)可測(cè)量一個(gè)細(xì)胞8個(gè)相關(guān)參數(shù)，測(cè)速可達(dá)5000個(gè)細(xì)胞/秒，分選純度可高達(dá)99%以上。

（4）圖像分析術(shù)圖像分析術(shù)是把計(jì)算機(jī)、電視和數(shù)字圖像處理等結(jié)合在一起的一種新技術(shù)，可快速準(zhǔn)確地測(cè)量組織切片