解放軍307醫(yī)院EGFR突變檢測經(jīng)驗分享課件

解放軍307醫(yī)院EGFR突變檢測經(jīng)驗分享劉毅解放軍307醫(yī)院全軍腫瘤中心腫瘤學(xué)研究室&肺癌分子診斷中心開展EGFR突變檢測面臨的問題一、是什么和為什么二、怎么做及注意事項三、臨床問題的解決：轉(zhuǎn)化性研究一、是什么和為什么EGFR基因的基本情況EGFR：表皮生長因子受體EGFR的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑

EGFR與腫瘤的生長及酪氨酸激酶抑制劑（TKI）——/肺癌靶向治療的里程碑：IPASS研究肺癌靶向治療的里程碑：IPASS研究——NEnglJMed2009;361:947-57肺癌靶向治療的里程碑：IPASS研究EGFR突變狀態(tài)指導(dǎo)TKI類藥物的使用EGFR突變狀態(tài)已成為患者能否在一線使用TKI藥物的重要指標(biāo)二、怎么做及注意事項目前較為常見的RGFR突變檢測方法——EGFR突變檢測中需要明確的幾個基本概念2、基因突變是指DNA發(fā)生堿基序列的改變：須選擇有針對性的檢測手段，針對非DNA的檢測手段如：RT-PCR（檢測RNA表達(dá)），免疫組化（檢測蛋白表達(dá)）以及針對非堿基序列的檢測手段如：FISH（檢測DNA的擴(kuò)增、缺失、斷裂、融合）等，均不適用。體細(xì)胞突變發(fā)生在非種系組織中不具有遺傳性不會遺傳給子代種系突變發(fā)生于精子或卵子中可以遺傳子代子代所有細(xì)胞均帶突變1、EGFR突變?yōu)轶w細(xì)胞突變：發(fā)生于腫瘤細(xì)胞中，正常細(xì)胞（癌旁或白細(xì)胞等）不含突變。要盡可能取到足量的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行檢測，這是保證檢測結(jié)果可靠的根本前提。腫瘤細(xì)胞內(nèi)及與正常組織間的異質(zhì)性片段化的DNA不容易進(jìn)行擴(kuò)增EGFR突變檢測中需要明確的幾個基本概念3、樣品特性：異質(zhì)性，突變細(xì)胞或DNA的含量一般較少，DNA經(jīng)常會嚴(yán)重片段化4、關(guān)鍵是保證突變DNA有效擴(kuò)增至可檢測的范圍：擴(kuò)增效率及檢測方法的敏感性1、TapMan探針法：邊擴(kuò)增邊檢測優(yōu)勢只檢測突變的序列敏感性高且污染幾率小不足探針費用較高只能針對已知突變正常DNA的擴(kuò)增無限制NatureReviewsDrugDiscovery2004：3,749-761突變DNA有熒光信號野生型DNA無熒光信號特定的探針：只結(jié)合突變序列2、高分辨率溶解曲線（HRM）：擴(kuò)增后再檢測優(yōu)勢已知和未知突變序列敏感性高且污染幾率小不足正常DNA的擴(kuò)增無限制對儀器設(shè)備的要求較高陽性結(jié)果還需進(jìn)一步確認(rèn)3、變性高效液相色譜分析（dHPLC）：擴(kuò)增后再檢測優(yōu)勢敏感性高已知和未知突變序列不足儀器普及率低正常DNA的擴(kuò)增無限制開蓋檢測增加污染幾率陽性結(jié)果還需進(jìn)一步確認(rèn)檢測環(huán)境需獨立且通風(fēng)良好4、直接測序法：擴(kuò)增后再檢測優(yōu)勢直觀且相對成本低已知和未知突變序列不足工作量大且敏感性低開蓋會增加污染幾率正常DNA的擴(kuò)增無限制Sanger測序法原理5、焦磷酸測序：擴(kuò)增后再檢測優(yōu)勢適合已知序列已知和未知突變均可測敏感性高、直觀、能夠定量不足需要專用儀器正常DNA的擴(kuò)增無限制開蓋會導(dǎo)致污染幾率增加6、突變富集PCR：擴(kuò)增后再檢測（抑制正常DNA擴(kuò)增）優(yōu)勢敏感性高（此消彼長）不足操作繁瑣只針對已知突變開蓋導(dǎo)致污染幾率增加不好找合適的限制性內(nèi)切酶——ClinCancerRes2006;12(1):43-487、擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)（蝎形探針）：邊擴(kuò)增邊檢測優(yōu)勢敏感性高且污染幾率小只擴(kuò)增并檢測突變的序列不足只針對已知突變試劑盒費用較高72℃延伸94℃解鏈60℃自身雜交發(fā)光ARMS引物各種突變檢測方法的綜合比較——1、操作流程2、污染幾率3、敏感性4、可實施性我們最初采用的方法：直接測序法選擇的理由結(jié)果直觀易懂大量文獻(xiàn)支持、金標(biāo)準(zhǔn)實驗室條件能夠滿足要求注意事項：DNA抽提部分新鮮組織體液（胸水或血漿）石蠟包埋組織提取過程約1小時提取過程約1小時提取過程約3小時1、DNA提取之前的病理質(zhì)量控制非常重要，它決定了最終檢測結(jié)果的可靠性2、盡可能使用認(rèn)可程度高的試劑，以保證DNA的提取效率（TaKaRaDEXPAT?）3、嚴(yán)格按照說明書要求保存試劑（溫度、濕度等），以免試劑失效4、可按自身需求對操作流程做適當(dāng)修改，但要形成SOP操作規(guī)范（示例1、2）5、DNA提取區(qū)域與DNA擴(kuò)增后的分析區(qū)域要完全分隔，以避免氣溶膠污染注意事項：PCR擴(kuò)增部分⑴1、DNA質(zhì)量控制非常重要，可保證后續(xù)實驗的順利進(jìn)行（模板過量、PCR抑制劑）2、設(shè)置好陰性對照（避免污染）和陽性對照（驗證實驗體系，必要時可取消）3、選用保真性較高的Taq酶，避免由實驗體系帶來的假陽性4、做好詳細(xì)的實驗記錄，為以后的各種分析提供依據(jù)（示例）Marker百倍稀釋原液空白Marker空白1921Marker空白1921注意事項：PCR擴(kuò)增部分⑵原來的19號外顯子巢式PCR引物原來的21號外顯子巢式PCR引物——NEnglJMed2004;350:2129-39改進(jìn)后的19號外顯子巢式PCR引物改進(jìn)后的21號外顯子巢式PCR引物5、巢式PCR并非必須，如果DNA的質(zhì)量足夠好，可以選擇一次PCR6、不必迷信權(quán)威文獻(xiàn)中的實驗條件，實踐是檢驗真理的唯一標(biāo)準(zhǔn)注意事項：結(jié)果分析部分⑴早期的報告現(xiàn)在的報告報告力求簡潔明了，不僅有檢測結(jié)論還要有可靠的事實依據(jù)注意事項：結(jié)果分析部分⑵檢測結(jié)果隨時歸檔，以備日后查詢、統(tǒng)計三、臨床問題的解決：轉(zhuǎn)化性研究轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)：以患者為中心，建立臨床治療和基礎(chǔ)研究間的雙向通道，從臨床工作中發(fā)現(xiàn)和提出問題，尋找或建立相應(yīng)的解決方案，然后將其應(yīng)用于臨床，解決臨床的實際問題測序法敏感性不足將導(dǎo)致假陰性結(jié)果FHirsch,etal.JCO2006CZhu,etal.JCO2008TMok,etal.DiscoveryMed2009ISELBiomarker1測序法陰性樣本～200份ARMS法重新檢測17(+)測序法復(fù)測7(+)BR21后續(xù)分析2測序法陰性樣本n=148ARMS法重新檢測11(+)ARMS法是靈敏度更高的方法，測序法的假陰性率約為8%3阿斯利康第四期EGFR突變檢測培訓(xùn)班ADx-ARMS：邊擴(kuò)增邊檢測且保證突變序列的有效擴(kuò)增ARMS引物第一輪擴(kuò)增64℃退火保證特異性第二輪擴(kuò)增60℃退火保證擴(kuò)增效率擴(kuò)增特異性由一輪引物保證突變熒光信號：FAM內(nèi)控?zé)晒庑盘枺篐EX或VIC外控?zé)晒庑盘枺篎AM陽性對照：內(nèi)含陽性質(zhì)粒陰性對照：蒸餾水內(nèi)外控均檢測EGFR基因2號外顯子體系中含特殊石蠟避免氣溶膠污染ADx-ARMS試劑盒的判讀流程是否污染實驗體系DNA質(zhì)量DNA含量結(jié)果判讀參數(shù)設(shè)置ADx-AMRS和DxsARMS試劑盒的比較——阿斯利康中國創(chuàng)新研究中心與張緒超/吳一龍教授等合作共同完成測序法和ARMS法的比較我院已采用ARMS進(jìn)行檢測，提供測序法和ARMS兩種方法供臨床選擇轉(zhuǎn)化研究的理想模式：臨床、實驗室及企業(yè)間密切協(xié)作肺癌個體化診斷與治療學(xué)術(shù)交流（2010年12月28日307醫(yī)院)ARMS法檢測EGFR突變已在我院臨床正式開展，其