把線粒體的蛋白也提取出來

把線粒體的蛋白也提取出來果子導(dǎo)讀這篇帖子本來應(yīng)該是大年初一發(fā)的的，但是我給忘記了。今天補上?？吹蕉棺咏裉斓奶雍透邢?，能有這樣優(yōu)秀的伙伴在身邊是一種幸運。提蛋白只是一個簡單的操作，但是豆子老師連講了5期，這只是她技能的一個小點，還有一大批帖子等著我們，這一年，有高師姐和豆子老師在，我自己很期待。本來還想講幾句，但是此刻心里翻江倒海，五味雜陳，不知道如何開口。醫(yī)院前門的包子鋪沒有開，導(dǎo)致我?guī)滋鞗]有吃早飯，后門沒有什么餐館開門，中午就像游魂一樣找吃的，昨天開始消毒細(xì)胞培養(yǎng)箱，整個過程需要兩天。過年會給連續(xù)的工作帶來打擊，工作的停頓從放假前3天就開始，一直持續(xù)到放假后3天，加起來都要兩周，而那種因為放假而停下來的熱情，不知道要什么時候才能完全恢復(fù)，老家還有一句話，正月里面都是年。以下是今天豆子老師的正文：最近看了很多場的團拜會的表演，覺得好像有種說不出的感覺，但恍惚中星星點點仿佛照亮了什么，自己好像是舞蹈隊的隊長，一場下來有時候會表演四五個節(jié)目，自己好像愛好唱歌，音樂老師都說挺好的（可能只是鼓勵，反正我把他當(dāng)真了），自己能吹豎笛還是滿分，鼓樂隊的都特別想要我，但是還是被舞蹈隊打敗了，o（n_n）o~，自己仿佛朗誦的也不錯，脫稿演講也有那么多次，自己或許文章寫的還可以，還上過報紙。。。原來竟是勾起了自己塵封多年的記憶。我們有不同的自己，可以高山流水，陽春白雪，可以喜歡李煜潛來珠簾動，驚覺銀屏夢，可以有長江東去浪淘盡的魄力，可以有潤物細(xì)無聲的溫柔，有惟吾德馨的高雅，平平凡凡也是不錯。不管做何種選擇，自己一定是舒服的開心

的就好，所以我看到很多人說好像自己忘記了很多東西，我覺得其實并不是忘記了，只是沒有一個契機讓自己想起來，你的記憶就放在那里等你去取，但是放在哪里卻需要自己去找。今天講講線粒體蛋白的提取線粒體的重要性我想大家肯定都知道，線粒體主要是提供細(xì)胞內(nèi)各種物質(zhì)代謝所需要的能量。能量是我們進行一切事情的前提條件，想要研究線粒體的功能以及物理化學(xué)性質(zhì)，提取線粒體必不可少，線粒體大量存在于代謝旺盛的細(xì)胞中，如動物的心肌，腦，肝，腎等器官和組織的細(xì)胞中，今天也是照舊提到幾種方法?？偟膩碚f提取線粒體的過程大概是先破碎細(xì)胞保存線粒體的活性，再梯度離心分離線粒體，最后破碎線粒體，提取線粒體蛋白。為保證獲得完整的線粒體，務(wù)必做到：第一，全程低溫操作；第二，快速；第三，在不破壞亞細(xì)胞器的情況下破碎細(xì)胞，這是制備線粒體的最關(guān)鍵環(huán)節(jié)。蔗糖梯度離心一成分及濃度口0.22M-了如M成分及濃度口0.22M-了如M0.1施甘露醇/庶糖『EDTAp.1.細(xì)胞（至少2x10人7個，最少一個10cm的dish，最好至少用兩個）PBS洗3次。.2.收集細(xì)胞，先將細(xì)胞用PBS收集，再離心，棄掉PBS。.3.收集沉淀，用1ml2mMHEPES勻漿，須在冰上操作，研磨30-40次。.4.40C,800g離心10min,收集上清于一新EP管中。.5.將上清以4。^11,000g離心15min,將得到的沉淀用RIPA緩沖液洗滌并重懸，放于冰上15min,4C10,000g離心10min，收集上清即為線粒體蛋白BSA的作用是為了去處內(nèi)生的游離脂肪酸，甘露醇和蔗糖是為了建立一定的滲透壓。組織線粒體的提?。ㄒ阅X組織為例）A液:甘露醇0.3mol/L，EDTA0.1mmol/L，PH=7.4，使用前加無脂肪酸的BSA1g/L.1.取新鮮腦組織，PBS沖洗，洗凈血水，冰浴中剪碎，加入入液，勻漿，組織研磨20次。.2.將組織勻漿物轉(zhuǎn)移到離心管，41,3000rpm離心10min,棄去沉淀。.3.取上清，轉(zhuǎn)移至新的離心管中，4^,10,000rpm再次離心10min，留取沉淀即為腦線粒體。還有一種提取組織線粒體的方法，但是需要用低溫超高速離心機，如果有的話可以可以選擇。組織線粒體提取2:A液：0.32mol/L蔗糖、10mmol/LEGTA、50mmol/LTris-HCl,PH=7.4B液:0.32mol/L蔗糠、50mmol/LTris-HCl,PH=7.4.取組織如前，加入入液勻漿，1000g離心10min,.取上清液17,000g離心20min，沉淀置于B液中，.在質(zhì)量濃度為75g/L,120g/L聚蔗糖組成的不同密度梯度上,以68,000g離心1h,其沉淀物即為線粒體，.置于B液中存于-80。。試劑盒提取線粒體：伽0020）組份：LysisBufferMito-WashBuffer.StoreBuffer.1.樣本處理.a.組織勻漿：稱取100-200mg新鮮組織腦組織，PBS沖洗3次，洗凈血水，濾紙吸干，用剪刀剪為碎塊放入小容量玻璃勻漿器內(nèi)。加入1.0ml冰預(yù)冷的LysisBuffer,0^冰浴上下研磨組織20次；.b.培養(yǎng)細(xì)胞勻漿：PBS洗滌，800g離心10min收集細(xì)胞，計數(shù)。每次提取需要5x107（至少2盤10cmdish是細(xì)胞）個細(xì)胞，加入1.0ml冰預(yù)冷的LysisBuffer重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到小容量玻璃勻漿器內(nèi)，0^冰浴研磨30-40次（與組織塊相比，培養(yǎng)細(xì)胞特別是貼壁培養(yǎng)細(xì)胞在用玻璃勻漿器勻漿時較難破壁，因而要選用小容量玻璃勻漿器、間隙嚴(yán)密的研杵上下研磨培養(yǎng)細(xì)胞）。.2.將組織或細(xì)胞勻漿物轉(zhuǎn)移到離心管，4。。1000g離心5min。.3.取上清，轉(zhuǎn)移至新的離心管中，4。，1000g再次離心5min。.4.取上清，轉(zhuǎn)移至新的離心管中，4。，12,000g離心10min。離心后的上清含胞漿成分，可從中提取胞漿蛋白。將上清轉(zhuǎn)移到新離心管，線粒體沉淀在管底。.5.往線粒體沉淀中加入0.5mlWashBuffer重懸線粒體沉淀，4。,1000g離心5min。.6.取上清，轉(zhuǎn)移至新的離心管中，4。，12,000g離心10min。棄上清，高純度的線粒體沉淀在管底。.7.用50-100ulStoreBuffer或合適的反應(yīng)緩沖液重懸線粒體沉淀，立即使用或-80。保存。最好用Bradford法測定線粒體濃度，對比Bradford法（考馬斯亮藍(lán)）和BCA法，兩者都有干擾物質(zhì)，但相比之下Bradford法的干擾物質(zhì)影響更小一