果蠅胚胎準(zhǔn)備技術(shù)

果蠅胚胎準(zhǔn)備技術(shù)邵素娟（果蠅資源與技術(shù)平臺）—:概述黑腹果蠅（Drosophilamelanogaste是被人類研究得最徹底的經(jīng)典模式生物之一。顯微注射（microinjection）技術(shù)是制備轉(zhuǎn)基因果蠅、RNAi（RNA干擾）果蠅、基因敲除（knock-out）果蠅等的非常重要的一項(xiàng)技術(shù)。果蠅顯微注射主要包括以下幾個步驟：1、背景果蠅胚胎的準(zhǔn)備；2、注射用混合物（DNA、RNA）的準(zhǔn)備；3、顯微注射；4、G0代幼蟲培養(yǎng)和雜交；5、G1代成蟲篩選。果蠅胚胎的質(zhì)量是整個顯微注射的基礎(chǔ)，是轉(zhuǎn)基因等實(shí)驗(yàn)?zāi)芊癯晒Φ闹匾绊懸蛩亍Ｏ旅嫖揖凸壟咛サ臏?zhǔn)備技術(shù)做一個詳細(xì)探討。二：實(shí)驗(yàn)材料和方法實(shí)驗(yàn)材料均由果蠅資源與技術(shù)平臺提供。以下以W1118為例闡述顯微注射時果蠅胚胎的準(zhǔn)備過程。1、 果蠅的擴(kuò)繁。W1118果蠅的繁殖力強(qiáng)，每周一、三、五擴(kuò)大瓶培養(yǎng)，每次4瓶，一般3周后就能持續(xù)得到足夠數(shù)量的W1118果蠅。在擴(kuò)繁的過程中，需要注意三點(diǎn)：一是要及時清瓶。一般瓶中幼蟲發(fā)育到二齡時就需要把老果蠅清空，否則大瓶中果蠅產(chǎn)卵太多導(dǎo)致瓶中環(huán)境過濕，進(jìn)而導(dǎo)致果蠅翅膀被粘而活力降低；二是在三齡幼蟲爬上瓶壁后加紙（Kimwipers）。一般每瓶加入2~3張。這樣不僅可以增加每瓶果蠅的產(chǎn)量，還可以使瓶內(nèi)的環(huán)境干燥。三是大瓶內(nèi)新一代的果蠅孵化后要及時將果蠅收集，否則，該大瓶會因其中的果蠅太多而粘濕，為以后收集果蠅帶來不便。新收的果蠅一般繼續(xù)培養(yǎng)2~3天后使用。2、 果蠅胚胎的收集。果蠅在25°C的環(huán)境中產(chǎn)卵。要想在做轉(zhuǎn)基因注射時得到足夠數(shù)量的胚胎，預(yù)產(chǎn)是必須的。在做顯微注射前一天，將收集的果蠅放入胚胎收集器中，給予避光環(huán)境，使其在涂上新配酵母膏的果汁板上產(chǎn)卵。每隔一個小時換一塊板。這樣做能調(diào)整果蠅的晝夜節(jié)律，讓他們適應(yīng)白天產(chǎn)卵。如果預(yù)產(chǎn)卵時胚胎數(shù)量足夠，就能準(zhǔn)備做顯微注射了。中午時將預(yù)產(chǎn)過的果蠅放入胚胎收集器中，之后每隔一小時左右收一次卵。果蠅的卵外層有比較堅(jiān)硬的外殼，在注射前，需先去除外殼。將板上的卵先收集到漏斗中，用水將其中的酵母等雜質(zhì)沖洗干凈，然后用漂水去殼，接著用自來水沖洗1分鐘，再用純水沖洗半分鐘后就完成了。在漂卵去殼過程中，漂水漂卵的時間是至關(guān)重要的因素。漂的時間過長，則胚胎容易破裂，而太短，則殼去除不干凈，都影響接下來的顯微注射。影響漂卵時間的因素主要有以下幾個：一是漂水溫度，漂水溫度越高，需要漂的時間越短；二是漂水質(zhì)量，不同批次的漂水，去殼的能力也不一樣；三是果蠅卵的數(shù)量，一般卵的數(shù)量多，需要漂的時間也會長一些。3、 排卵。排卵最好在低溫下完成，能延緩胚胎發(fā)育速度。在載玻片上貼一層雙面膠（3M膠），將漂好的卵掃到雙面膠下方，吸干水。在顯微鏡下將胚胎后端朝上依次排列成行。排好后，在環(huán)境中自然晾干。胚胎干濕度的控制是轉(zhuǎn)基因能否成功的重要因素之一。胚胎過濕，在做顯微注射時，容易爆；胚胎過干則會影響胚胎的成活率。4、 顯微注射。胚胎排好后，在胚胎上方滴上一層礦物油保濕。為了及時調(diào)整胚胎的干濕度，每次只滴一小段胚胎，然后注射。當(dāng)發(fā)現(xiàn)胚胎太干則會在下一次滴油的時候多滴一些，當(dāng)發(fā)現(xiàn)胚胎太濕時，則會再多等幾分鐘后滴油，直到摸索出適合當(dāng)天環(huán)境的時間為止。三總結(jié)顯微注射時胚胎的準(zhǔn)備過程中每一個步驟中都有技術(shù)要點(diǎn)。不管是哪一個步驟沒有做好都會影響到胚胎的質(zhì)量。其技術(shù)要點(diǎn)主要包括：1、 收集的果蠅量合適而且成熟度適宜，使顯微注射時能夠收集到足夠的胚胎。2、 漂卵的時間控制得當(dāng)，能夠去除胚胎外面的殼且盡可能減少對胚胎的傷害。3、 排卵的時間控制得當(dāng)，使胚胎干濕度適宜。4、 每次收卵的時間在一個小時