感染性疾病病原體快速診斷課件

感染性疾病病原體快速診斷1概述感染性疾?。河赡撤N病原體所致，通過不同方式引起人體發(fā)生感染并出現(xiàn)臨床病癥的疾病,主要表現(xiàn)為發(fā)熱。病原體：細(xì)菌〔含TB〕、支原體、衣原體病毒真菌原蟲等2感染的診斷依據(jù)臨床表現(xiàn)：感染的全身中毒病癥：畏寒、發(fā)熱、皮疹等實驗室常規(guī)檢查：血常規(guī)：WBC、DC影像學(xué)檢查：X-RAY、B超病原學(xué)檢查：染色、培養(yǎng)血清學(xué)檢查：抗原或抗體檢測危重病人：臨床表現(xiàn)、WBC+DC不典型3感染的分類按病原學(xué)分類細(xì)菌感染〔包括結(jié)核〕真菌感染病毒感染支原體、衣原體按部位分類局部感染全身感染4臨床希望第一時間知道的信息感染或非感染細(xì)菌感染或非細(xì)菌感染是結(jié)核感染或普通細(xì)菌感染酵母樣真菌感染或絲狀真菌感染白色假絲酵母或其他念珠菌感染曲菌感染或毛霉菌感染因為上述感染治療方法不同5感染標(biāo)志物細(xì)菌感染標(biāo)志物白細(xì)胞計數(shù)與分類血沉C-反響蛋白〔CRP〕白介素-6降鈣素元內(nèi)毒素真菌感染標(biāo)志物:G試驗、GM試驗結(jié)核感染證據(jù)：夾層杯、T-SPOT6內(nèi)容提要1237降鈣素原檢測內(nèi)毒素檢測分子診斷8降鈣素原(ProcalcitoninPCT)降鈣素原是正常人血清中存在的含116個氨基酸組成的糖蛋白，最初由甲狀腺細(xì)胞產(chǎn)生，血清水平很低。在非感染或病毒性感染疾病時保持非常低的血清水平，在細(xì)菌性感染時含量升高，并與感染程度和預(yù)后呈正相關(guān)。PCT含量的變化穩(wěn)定，并出現(xiàn)在疾病的早期〔3-4h〕。短半衰期(24h)國外把PCT作為最敏感的感染標(biāo)志。正常血清水平:100-150pg/ml9降鈣素原PCT

:分子結(jié)構(gòu)血清降鈣素(CT)的前肽物質(zhì)分子量：14.5kDa由116個氨基酸組成的糖蛋白質(zhì)無激素活性11號染色體上的單拷貝基因轉(zhuǎn)錄甲狀腺濾泡細(xì)胞降鈣素原前體內(nèi)源多肽酶降鈣素原PCT分解細(xì)胞內(nèi)特殊蛋白酶正常情況下降鈣素10LinscheidP,etalCritCareMed04;32:1715-21

Endocrinology03;144:5578-84&05;146:2699-708在病毒感染時，大量產(chǎn)生的IFN-

，將會抑制PCT的激活及產(chǎn)生.因此，病毒感染時，PCT的濃度將會保持在較低的水平)IL-6IL-611細(xì)菌感染后PCT快速升高

Kineticsofprocalcitonininiatrogenicsepsis

BrunkhorstF.Metal,IntensCareMed1998,24:888-89212PCT來源LeftLane:正常組,在不存在感染的情況下，甲狀腺外CALCI表達(dá)被抑制，而主要局限于甲狀腺和肺的神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞有一定程度的表達(dá)RightLane:膿毒癥組,在細(xì)菌感染時可誘導(dǎo)全身各種組織多種類型細(xì)胞CALCI表達(dá)和PCT連續(xù)性釋放13PCT動力學(xué)2-3h開始增加；6-8h快速升高；12h-48到達(dá)峰值；2-3d正常血漿濃度在＜0.05ng/ml-1000ng/ml半衰為15-20h左右,且不受腎功能影響14PCT檢測方法快速半定量法〔PCT-Q〕全自動快速定量法〔VIDAS)15快速半定量法〔PCT-Q〕樣本：200μl血清/血漿結(jié)果：30min同膠體金免疫層析法，即在標(biāo)準(zhǔn)品上結(jié)合有膠體金的小鼠單克隆抗降鈣素抗體和綿羊多克隆抗降鈣素抗體，待檢標(biāo)本加上后，示蹤元素即與標(biāo)本中的PCT結(jié)合，形成一個“三明治式〞的復(fù)合物，然后通過發(fā)光比色判斷PCT濃度當(dāng)PCT濃度≥0.5μg/ml時，夾心復(fù)合物呈紅色帶，顏色深淺與樣品中的PCT濃度成正比例，未結(jié)合的示蹤物擴(kuò)散到對照區(qū)，結(jié)合并產(chǎn)生了紅色的對照帶。16全自動快速定量法儀器：法國梅里埃公司VIDAS全自動酶聯(lián)熒光分析儀及配套試劑標(biāo)本要求：靜脈抗凝血注意無菌操作，使用新鮮標(biāo)本，如果4小時內(nèi)不使用，應(yīng)將標(biāo)本放置-20℃保存。血漿中的PCT非常穩(wěn)定，收集標(biāo)本24h后，PCT濃度在室溫下大約下降12％，在4℃大約下降6％17PCT用于細(xì)菌感染和膿毒癥診斷是一種非常有價值的標(biāo)志物細(xì)菌感染/膿毒癥診斷及嚴(yán)重程度判斷膿毒癥治療效果監(jiān)測及預(yù)后評估抗生素的有效管理18細(xì)菌感染診斷及嚴(yán)重程度判斷膿毒性休克嚴(yán)重膿毒癥系統(tǒng)性感染(膿毒癥)局部感染正常值

PCT的濃度隨感染的擴(kuò)散和感染嚴(yán)重程度的加重而升高19膿毒癥患者治療效果及預(yù)后監(jiān)測(n=109)F.Stüber,UniversityBonn,LectureatISICEM,Brussels2001通過PCT不斷在體內(nèi)衰減，反映出抗生素治療策略的成功隨著患者對抗生素治療的響應(yīng)，引起了PCT血中濃度水平的典型變化過程AB-antibiotics20抗生素有效管理PCT濃度（ng/ml）臨床意義＜0.05無細(xì)菌感染0.05-0.1非細(xì)菌感染0.1-0.25可能是局部細(xì)菌感染，不建議使用抗生素，6-24小時內(nèi)復(fù)查0.25-0.5局部細(xì)菌感染，建議使用抗生素0.5-2.0嚴(yán)重細(xì)菌感染、膿毒癥2.0-10.0重癥膿毒癥＞10.0 重度膿毒癥、膿毒性休克或MODS21PCT的臨床應(yīng)用嚴(yán)重細(xì)菌感染或膿毒癥的檢測〔鑒別診斷〕疾病或治療反響的監(jiān)測局部與全身性感染膿毒癥的診斷和監(jiān)測新生兒膿毒癥的檢測22PCT水平增加但沒有系統(tǒng)細(xì)菌感染的幾種情況23感染早期(->6-12小時后重復(fù)檢測!)亞急性心內(nèi)膜炎局部感染細(xì)菌感染而PCT不升高的情況24對PCT檢測的影響受以下因素影響

*

甲狀腺功能

是功能性甲狀腺髓樣癌的腫瘤標(biāo)志物*

腎功能

嚴(yán)重腎功能受損者中水平較高不受以下因素影響*

類固醇藥物*自身免疫性疾病*

年齡、性別*免疫功能低下狀態(tài):肝硬化、HIV感染25細(xì)菌內(nèi)毒素革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁上的一種脂多糖（LPS）和蛋白的復(fù)合物，細(xì)菌死亡或自溶后釋放進(jìn)入機(jī)體將會出現(xiàn)發(fā)熱、血壓降低、寒顫、引起DIC、內(nèi)毒素敗血癥等一系列臨床反應(yīng)。2627細(xì)菌內(nèi)毒素檢測原理：儀器檢測試管內(nèi)反響物的光密度OD值，取當(dāng)OD上升到0.02的點的時間作為反響時間，該點在反響曲線上的位置為濁度開始快速變化的時期，該取值能夠快速、穩(wěn)定的獲得反響時間，從而判斷內(nèi)毒素的含量動態(tài)濁度法28儀器和試劑BET-24A細(xì)菌內(nèi)毒素分析儀

MB-80微生物快速動態(tài)監(jiān)測系統(tǒng)29標(biāo)本要求患者早上尚未進(jìn)行藥物靜脈治療時:MB-80：“無熱源真空采血管〞,靜脈抗凝血，采血量2-4ml，30min內(nèi)送檢BET-24A：抽取1mL靜脈抗凝血，配1mL1號處理液其它體液如腦脊液﹑胸腹水與血標(biāo)本要求相同。注意無菌操作30內(nèi)毒素活性定量檢測意義G-所致膿毒癥早期鑒別診斷指導(dǎo)抗生素正確使用判定抗感染治療效果幫助判斷患者的預(yù)后31內(nèi)毒素定量檢測的適應(yīng)癥32革蘭陽性球菌革蘭陰性桿菌mecA基因VanA/VanB基因PBP2b基因PCR擴(kuò)增耐藥基因特異性基因ESBLs基因AmpC基因碳青霉烯酶基因mecA：耐甲氧西林葡萄球菌屬〔MRS〕特異性基因VanAVanB：耐萬古霉素腸球菌〔VRA〕特異性基因PBP2b：青霉素不敏感肺炎鏈球菌〔pNSSp〕特異性基因ESBLs基因：主要包括TEM、SHV、CTX-M、OXAAmpC基因包括質(zhì)粒介導(dǎo)型和染色體誘導(dǎo)型。其中前者主要包括MOX、CMY、DHA、ACC、ACT、FOX等亞型，后者主要包括：ADC。碳青霉烯酶基因：A類酶，以KPC為代表；金屬酶，以IMP、VIM、NDM為代表；D類酶，以O(shè)XA-23、OXA-24、OXA-51和OXA-48為主。3316SrRNA具有多拷貝多信息的特點34結(jié)核分枝桿菌的快速診斷是引起結(jié)核病的病原菌。它可侵犯全身各器官，但以肺結(jié)核為最多見。結(jié)核病至今仍為重要的傳染病。估計世界人口中1/3感染結(jié)核分枝桿菌。結(jié)核分枝桿菌生長緩慢，一般需2-4周長成肉眼可見的落菌?？顾崛旧ㄊ菣z測TB的傳統(tǒng)方法，但存在假陽性因此，快速診斷對TB至關(guān)重要。35結(jié)核感染現(xiàn)狀全球范圍內(nèi)結(jié)核病疫情急劇惡化結(jié)核病與艾滋病同時流行結(jié)核菌耐藥現(xiàn)象益發(fā)嚴(yán)重人口大規(guī)模流動我國是世界上僅低于印度的第二結(jié)核病大國結(jié)核菌感染率44.5%新發(fā)活動性結(jié)核患者130萬/年死亡13萬/年早期快速診斷與治療成為制約結(jié)核病控制的關(guān)鍵常規(guī)實驗室診斷結(jié)核病方法陽性率不到60%36全球結(jié)核疫情37結(jié)核檢測方法38

結(jié)核夾層杯技術(shù)結(jié)核感染T細(xì)胞檢測技術(shù)分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)核分枝桿菌的快速診斷39原理：通過專用消化滅活液消化組織細(xì)胞和粘蛋白等，將結(jié)核桿菌裸露出來，并結(jié)合高速震蕩，使痰標(biāo)本充分液化而有利于其中的抗酸桿菌沉淀于特制彭氏杯底部的菌膜上，在夾層杯中直接抗酸染色、枯燥，并用取片針頂出內(nèi)底，經(jīng)封片等步驟后，鏡下檢測抗酸桿菌。40檢測流程示意圖41鏡下比較圖2.夾層杯法〔新方法〕：

菌量多，背景清晰，易于觀察圖1.直接涂片法〔傳統(tǒng)方法〕：菌量少，背景不清晰42陽性率高背景清晰，易于觀察易于標(biāo)準(zhǔn)化檢測速度快生物平安性好43標(biāo)本要求：〔1〕痰液要求新鮮，留取清晨深咳出的第一口痰液，留痰時，患者以清水漱口３次，然后用力咳出氣管深處的痰〔2〕用氫氧化鈉處理完全。臨床應(yīng)用：用于結(jié)核分枝桿菌的初篩4445原理結(jié)核感染的免疫應(yīng)答反響以細(xì)胞免疫為主，作為免疫應(yīng)答的一局部，T細(xì)胞受結(jié)核抗原刺激致敏，形成活化的效應(yīng)T細(xì)胞，包括CD4和CD8。結(jié)核桿菌感染者外周血單核細(xì)胞中存在結(jié)核特異的活化T淋巴細(xì)胞，這些淋巴細(xì)胞在體外再次受到結(jié)核桿菌特異抗原刺激后分泌γ-干擾素，通過檢測體外分泌的IFN-γ來診斷是否存在結(jié)核感染。46活動性結(jié)核與潛伏感染接觸活動性結(jié)核病患者暴露程度缺乏，結(jié)核桿菌被機(jī)體免疫力去除沒有病癥,結(jié)核桿菌仍舊存在而不能被發(fā)現(xiàn)X-光/CT掃描顯示正常沒有抗體應(yīng)答診斷困難傳統(tǒng)的結(jié)核感染檢測只有TST〔PPD〕機(jī)體被感染受機(jī)體免疫力抑制沒有臨床病癥終身處于感染狀態(tài)潛伏感染有臨床病癥具有傳染性結(jié)核桿菌可以通過涂片、培養(yǎng)檢測出胸部的X-光或CT掃描顯示異常

肺外結(jié)核難以診斷(特別是兒童)活動性結(jié)核5%5%再次激活47活動性結(jié)核與潛伏感染新發(fā)TB病例來自潛伏性結(jié)核感染人群潛伏性結(jié)核感染〔hiddenepidemic〕人群數(shù)量巨大——“定時炸彈〞假設(shè)想控制活動性TB，必須先控制潛伏性結(jié)核感染鑒別高危人群預(yù)防性治療免疫接種活動性TB–每年900萬新發(fā)病例僅為冰山一角LatentTB-“hiddenepidemic〞-2billionpeopleinfected48結(jié)核感染T細(xì)胞檢測4950結(jié)核感染者體內(nèi)存在特異的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，效應(yīng)T淋巴細(xì)胞再次受到結(jié)核抗原刺激時會分泌多種細(xì)胞因子〔IFN-γ〕。因此，檢測效應(yīng)T淋巴細(xì)胞可用于結(jié)核病或結(jié)核潛伏感染者的診斷。由于效應(yīng)T細(xì)胞存活時間很短，而且具有特異性，因此可以作為機(jī)體是否正處于被感染的指標(biāo)，無論是否有臨床病癥?；贗GRA原理的檢測工程目前已被美國、加拿大、英國、德國、意大利、瑞士、法國、荷蘭、日本等二十余個國家寫入本國的結(jié)核診療指南中γ-干擾素釋放實驗〔IGRA〕515253結(jié)核桿菌特異抗原ESAT-6與CFP10抗原由結(jié)核桿菌基因組RD1區(qū)相同的操縱子編碼的蛋白所有的卡介苗〔BCG〕均喪失該基因序列絕大多數(shù)的環(huán)境分枝桿菌也不存在RD1區(qū)54操作步驟①②55操作步驟⑤⑥④③孵育1小時56實際效果圖陰性結(jié)果陽性結(jié)果空白對照抗原AESAT-6抗原BCFP10陽性對照〔PHA〕57T-SPOT.TB特點特異性好，不受卡介苗〔BCG〕接種和環(huán)境分枝桿菌影響靈敏度高，在免疫力低下/受抑制人群中有很高的檢出率快速，24小時報告結(jié)果58寫入診療指南的國家〔Guidelines〕591、結(jié)核病輔助診斷/療效評價“菌陰〞結(jié)核病患者的輔助診斷肺外結(jié)核的鑒別診斷抗癆治療的療效評價2、免疫力低下/受抑制患者的結(jié)核診斷/感染篩查使用生物制劑/免疫抑制劑患者的結(jié)核感染篩查HIV感染者/腎透析患者/器官移植患者3、兒童結(jié)核病的輔助診斷4、結(jié)核密切接觸者/高危人群的結(jié)核感染篩查結(jié)核病患者的家屬/醫(yī)務(wù)工作者/監(jiān)獄囚犯5、接觸追蹤臨床應(yīng)用60結(jié)核相關(guān)疾病肺結(jié)核菌陽〔痰涂片、痰培養(yǎng)〕------結(jié)核?？漆t(yī)院菌陰------感染科、呼吸科、胸外科、結(jié)核科肺外結(jié)核淋巴結(jié)結(jié)核------外科、血液科、感染科結(jié)核性胸膜炎------感染科、呼吸科、結(jié)核科結(jié)核性腹膜炎------外科、消化科、感染科結(jié)核性腦膜炎------感染科、神經(jīng)科骨關(guān)節(jié)結(jié)核------骨科、風(fēng)濕科、感染科泌尿生殖系統(tǒng)結(jié)核------泌尿外科、腎臟科、感染科、性病科其他：如結(jié)核性心包炎、脾結(jié)核、胰腺結(jié)核等61評價不能夠提示臨床患者的病變部位不能夠根據(jù)斑點數(shù)量的多少來判斷受試者是活動性結(jié)核病患者或是潛伏感染者兒童結(jié)核的輔助診斷，需要結(jié)合臨床62基因診斷TB特異性位點：1.rRNA基因：高度保守，主要包括23S、16S及5S基因。其中最為常用的是16SrRNA基因。2.插入序列：IS6110和IS1081。3.蛋白編碼的基因：65KD熱休克蛋白基因(hsp65)、32KD蛋白基因、DnaJ蛋白基因、RNA聚合酶B(rpoB)和MPB64蛋白基因(mpb64〕等?；蛟\斷的意義主要表現(xiàn)在：a.區(qū)分TB與其它分枝桿菌；b.檢測TB耐藥基因；c.提高TB的陽性檢出率。63IS6110-RFLP〔插入序列6110限制性片段長度多態(tài)性分析〕方法目前依然被認(rèn)為是結(jié)核分枝桿菌基因分型的“金標(biāo)準(zhǔn)〞。直接重復(fù)片段及寡核苷酸多態(tài)性分型可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列及MLVA分型單核苷酸多態(tài)性和MLST分型64多重耐藥結(jié)核分枝桿菌檢測65臨床常見真菌的快速診斷G試驗GM試驗分子生物學(xué)技術(shù)661.1,3-β-D-葡聚糖-G試驗1，3-β-D-葡聚糖是酵母和絲狀真菌細(xì)胞壁的多聚糖成分，以假絲酵母菌屬含量最高，而其他微生物動物及人的細(xì)胞成分和細(xì)胞外液都不含這種成分。因此，血液及無菌體液中檢出1，3-β-D-葡聚糖在很大程度上可以視為IFI的標(biāo)志，如念珠菌、曲霉、鐮刀霉、酵母和絲孢酵母感染等。目前的檢測方法為G試驗，其原理是1，3-β-D-葡聚糖有特異性激活鱟變形細(xì)胞裂解物中的G因子引起裂解物凝固，故稱為G試驗。國內(nèi)已經(jīng)使用微生物快速動態(tài)檢測系統(tǒng)檢測。67標(biāo)本要求采樣過程要求無菌操作常規(guī)病人早上用藥治療前空腹采血取樣〔血透患者透析前采血〕標(biāo)本類型：抗凝靜脈血，使用無熱原真空采血管采血量：2-3ml，立即混勻半小時內(nèi)送檢。實驗前未翻開標(biāo)本在2-8℃可保存5天。翻開后標(biāo)本需在48小時內(nèi)完成檢測。如需長時間儲存，存儲溫度應(yīng)為-70℃。血清標(biāo)本最多可凍融四次。解凍標(biāo)本檢測之前要充分混勻68G試驗的臨床意義早期、快速診斷侵襲性真菌感染可用于真菌感染早期篩查，適用于念珠菌、曲霉、肺孢子菌、鐮刀菌、地霉、組織胞漿菌和毛孢子菌等，不能用于檢測隱球菌和接合菌感染。對真菌感染病癥進(jìn)行診斷，陽性結(jié)果代表存在侵襲性真菌感染692.半乳甘露聚糖(GM)半乳甘露聚糖(GM)是一種對熱穩(wěn)定的水溶性的物質(zhì)，是廣泛存在于曲霉和青霉細(xì)胞壁中的一類多糖。一般在曲霉感染者出現(xiàn)臨床病癥和影像學(xué)檢查異常前數(shù)天，其體內(nèi)循環(huán)中GM即可呈陽性表達(dá)，其靈敏度和特異度均可到達(dá)80%以上。原理：是一種微孔板雙抗體夾心法，采用小鼠單克隆抗體EBA-2，檢測人血清中的曲霉菌半乳甘露聚糖。70標(biāo)本要求標(biāo)本采集：靜脈采血5ml〔紅帽管〕。檢測標(biāo)本：血清標(biāo)本，密封，無菌操作。實驗前未翻開標(biāo)本在2-8℃可保存5天。翻開后標(biāo)本需在48小時內(nèi)完成檢測。如需長時間儲存，存儲溫度應(yīng)為-70℃。血清標(biāo)本最多可凍融四次。解凍標(biāo)本檢測之前要充分混勻20mg/L膽紅素，或2g/L甘油三酯的脂血，或165mg/L血紅蛋白的溶血標(biāo)本不影響檢測結(jié)果71GM試驗臨床意義1.診斷侵襲性真菌感染2.血清GM檢測能區(qū)分侵襲性