高效液相色譜分析(福建師范大學(xué))

第三章

高效液相色譜分析highperformanceliquidchromatograph2024/1/13教學(xué)目標(biāo)及要求：1.掌握液相色譜的特點(diǎn)；2.掌握液相色譜法的分類；3.了解影響液相色譜峰擴(kuò)展及色譜別離的因素；4.理解液相色譜別離的原理；5.了解液相色譜的固定相和流動(dòng)相；6.了解液相色譜儀的組成和結(jié)構(gòu)原理及主要部件；7.了解液相色譜別離類型的選擇；8.了解液相色譜的應(yīng)用。教學(xué)重點(diǎn)、教學(xué)難點(diǎn)：1.高效液相色譜與氣相色譜的異同點(diǎn)

2.高效液相色譜速率理論方程式在實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化中的應(yīng)用

3.別離柱和流動(dòng)相的選擇和匹配

4.不同種類液相色譜別離的原理上的差異2024/1/13第一節(jié)

高效液相色譜法概述Generalizationofhighperformanceliquidchromatograph一、概述Generalization二、高效液相色譜儀HPLC三、高效液相色譜法的特點(diǎn)featureofHPLC四、流程及主要部件generalprocessandmainassemblyofHPLC2024/1/13一、概述Generalization2024/1/13(一)、HPLC與經(jīng)典LC區(qū)別經(jīng)典液相色譜高效液相色譜

常壓或減壓

填料顆粒大

柱效低

分析速度慢

色譜柱只用一次不能在線檢測(cè)

高壓，40～50MPa

填料顆粒小，2～50μm

柱效高,40000～60000塊/m

分析速度快

色譜柱可重復(fù)多次使用

能在線檢測(cè)2024/1/13(二)、HPLC與GC異同點(diǎn)氣相色譜高效液相色譜只能分析揮發(fā)性物質(zhì)，只能分析20%的化合物不能用于熱不穩(wěn)定物質(zhì)的分析用毛細(xì)管色譜可得到很高的柱效有很靈敏的檢測(cè)器如ECD和較靈敏的通用檢測(cè)器（FID和TCD）流動(dòng)相為氣體，無(wú)毒，易于處理運(yùn)行和操作容易儀器制造難度較小幾乎可以分析各種物質(zhì)

可以用于熱不穩(wěn)定物質(zhì)的分析色譜柱不能很長(zhǎng)，柱效不會(huì)很高沒(méi)有較高靈敏的通用檢測(cè)器①

流動(dòng)相有毒，費(fèi)用較高運(yùn)行和操作比GC難一些儀器制造難度大①近來(lái)出現(xiàn)的蒸發(fā)激光光散射檢測(cè)器〔ELSD〕是靈敏度較高的通用檢測(cè)器2024/1/13流動(dòng)相差異GC：流動(dòng)相為惰性氣體組分與流動(dòng)相無(wú)親合作用力，只與固定相作用。HPLC：流動(dòng)相為液體組分與流動(dòng)相和固定間有親合作用力，為提高柱的選擇性、改善別離度增加了因素，對(duì)別離起很大作用。流動(dòng)相種類較多，選擇余地廣流動(dòng)相極性和pH值的選擇也對(duì)別離起到重要作用選用不同比例的兩種或兩種以上液體作為流動(dòng)相可以增大別離選擇性操作條件差異GC：加溫操作HPLC：室溫；高壓〔液體粘度大，峰展寬小〕2024/1/13二、液相色譜儀器

highperformanceliquidchromatograph——2004年市場(chǎng)調(diào)查報(bào)告2024/1/13液相色譜儀〔1〕2024/1/13液相色譜儀〔2〕2024/1/13液相色譜儀〔3〕2024/1/13液相色譜儀〔4〕2024/1/13美.瓦里安

Prostar210高效液相色譜儀2024/1/13三、高效液相色譜法的特點(diǎn)和應(yīng)用特點(diǎn)：“三高〞“一快〞“一廣〞高柱效——n=104片/米，柱效高〔遠(yuǎn)高于一般LC〕高靈敏度(紫外：10-9g；熒光：10-11g)高選擇性分析速度快(＜1h)應(yīng)用范圍廣泛〔可分析80%有機(jī)化合物〕〔是高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定有機(jī)及生化試樣的高效別離分析方法?！?024/1/13四、流程及主要部件

processandmainassemblyofHPLC1.流程液相色譜流程圖PUMPDetectorWDatastation(Recorder)orCollection2024/1/132.主要部件P83(1)高壓輸液泵主要部件之一，壓力：150～350×105Pa。為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相〔<10μm〕，液體的流動(dòng)相高速通過(guò)時(shí)，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點(diǎn)之一。應(yīng)具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕往復(fù)式柱塞泵死體積小，很適用于梯度洗提等特性。2024/1/13(2)梯度淋洗裝置外梯度:〔低壓梯度〕將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進(jìn)入色譜柱。內(nèi)梯度：〔高壓梯度〕一臺(tái)高壓泵,通過(guò)比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。2024/1/132024/1/13(3)進(jìn)樣裝置流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高壓的六通閥進(jìn)樣裝置，其結(jié)構(gòu)如下圖：裝入樣品出口進(jìn)樣采樣環(huán)泵入溶劑進(jìn)色譜柱2024/1/13(4)高效別離柱柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑1～6mm，柱長(zhǎng)5～40cm。開(kāi)展趨勢(shì)是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。2024/1/13理想的HPLC檢測(cè)器應(yīng)具有如下特性：

第一，具有高靈敏度和可預(yù)測(cè)的響應(yīng)；第二，對(duì)樣品所有組分都有響應(yīng)，或具有可預(yù)測(cè)的特異性，適用范圍廣；第三，溫度和洗脫液流速的變化對(duì)響應(yīng)沒(méi)有影響；第四，響應(yīng)與洗脫液組成無(wú)關(guān)，因此可作梯度洗脫；第五，死體積小，不造成柱外譜帶擴(kuò)展；第六，使用方便、可靠、耐用，易清洗和檢修；第七，響應(yīng)值隨樣品組分量的增加而線性增加，線性范圍寬；第八，不破壞樣品組分；第九，能對(duì)被檢測(cè)的峰提供定性和定量信息；第十，響應(yīng)時(shí)間快。(5)液相色譜檢測(cè)器2024/1/13分類標(biāo)準(zhǔn)種類響應(yīng)原理特點(diǎn)常用類型按檢測(cè)

器性質(zhì)

或應(yīng)用

范圍分

類總體性能檢測(cè)器響應(yīng)值取決于流出物（包括樣品和流動(dòng)相）某些物理性質(zhì)的總的變化的檢測(cè)器有廣泛的適用范圍，基線噪音和漂移較大，靈敏度低，不適于痕量分析，不能用于梯度洗脫示差折光率檢測(cè)器介電常數(shù)檢測(cè)器電導(dǎo)檢測(cè)器溶質(zhì)性能檢測(cè)器響應(yīng)值取決于流動(dòng)相中溶質(zhì)的物理或化學(xué)特性的檢測(cè)器檢測(cè)靈敏度高，受操作條件和外界環(huán)境影響小，可用于梯度洗脫，應(yīng)用范圍受限制紫外-可見(jiàn)檢測(cè)器熒光檢測(cè)器化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器安培檢測(cè)器手性檢測(cè)器按測(cè)量

信號(hào)性

質(zhì)分濃度敏感性檢測(cè)器響應(yīng)值正比于溶質(zhì)在流動(dòng)相中的濃度，測(cè)量的是流動(dòng)相中溶質(zhì)濃度瞬間的變化樣品量一定時(shí)，檢測(cè)器瞬間響應(yīng)即峰高響應(yīng)值和流動(dòng)相流速無(wú)關(guān)，峰面積與流速成反比，峰面積與流速乘積為常數(shù)大部分常用的液相色譜檢測(cè)器都屬于該類檢測(cè)器質(zhì)量敏感性檢測(cè)器響應(yīng)值正比于單位時(shí)間內(nèi)通過(guò)檢測(cè)器的物質(zhì)的質(zhì)量即正比于質(zhì)量流速峰面積與流動(dòng)相流速無(wú)關(guān)，峰響應(yīng)值與流速成正比庫(kù)侖檢測(cè)器檢測(cè)器的分類：2024/1/13按

測(cè)

量

原

理

分光學(xué)性質(zhì)檢測(cè)器根據(jù)被測(cè)物質(zhì)對(duì)光的吸收、發(fā)射和散射等性質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)的應(yīng)用范圍廣，靈敏度高紫外-可見(jiàn)檢測(cè)器，示差折光率檢測(cè)器，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，熒光檢測(cè)器，化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器，手性檢測(cè)器電學(xué)及電化學(xué)性質(zhì)檢測(cè)器根據(jù)被測(cè)物電化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)

安培檢測(cè)器，電導(dǎo)檢測(cè)器，庫(kù)侖檢測(cè)器，介電常數(shù)檢測(cè)器，極譜檢測(cè)器熱學(xué)性質(zhì)檢測(cè)器利用熱學(xué)原理進(jìn)行檢測(cè)

光聲檢測(cè)器，熱透鏡和光熱偏轉(zhuǎn)檢測(cè)器按信號(hào)

記錄方

式分積分型檢測(cè)器顯示的信號(hào)是指在給定時(shí)間內(nèi)物質(zhì)通過(guò)檢測(cè)器的總量靈敏度低，定性困難，應(yīng)用少

微分型檢測(cè)器顯示的信號(hào)表示在給定時(shí)間內(nèi)每一瞬間時(shí)通過(guò)檢測(cè)器的量靈敏度高

2024/1/13a.紫外檢測(cè)器應(yīng)用最廣，對(duì)大局部有機(jī)化合物有響應(yīng)。特點(diǎn)：靈敏度高；線形范圍高；流通池可做的很小〔1mm×10mm，容積8μL〕；對(duì)流動(dòng)相的流速和溫度變化不敏感；波長(zhǎng)可選，易于操作；可用于梯度洗脫。

2024/1/13b.光電二極管陣列檢測(cè)器紫外檢測(cè)器的重要進(jìn)展；光電二極管陣列檢測(cè)器：1024個(gè)二極管陣列，各檢測(cè)特定波長(zhǎng)，計(jì)算機(jī)快速處理，三維立體譜圖，如下圖。2024/1/132024/1/13光電二極管陣列檢測(cè)器2024/1/13c.示差折光檢測(cè)器

〔differentialrefractiveindexdetector〕

除紫外檢測(cè)器之外應(yīng)用最多的檢測(cè)器；可連續(xù)檢測(cè)參比池和樣品池中流動(dòng)相之間的折光指數(shù)差值。差值與濃度呈正比；通用型檢測(cè)器〔每種物質(zhì)具有不同的折光指數(shù)〕；靈敏度低、對(duì)溫度敏感、不能用于梯度洗脫；偏轉(zhuǎn)式、反射式和干預(yù)型三種；2024/1/13示差折光檢測(cè)器2024/1/13d.熒光檢測(cè)器

〔fluorescencedetector〕高靈敏度、高選擇性的檢測(cè)器。對(duì)多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應(yīng)；e.其它檢測(cè)器：

電化學(xué)檢測(cè)器(電導(dǎo)檢測(cè)器、伏安檢測(cè)器等)

電導(dǎo)檢測(cè)器直接測(cè)定柱后洗脫液的電導(dǎo)變化。將被測(cè)洗脫液置于施加電場(chǎng)的兩個(gè)電極間，電導(dǎo)值1／R〔R為兩電極間電阻值〕與電極截面積A，兩電極間距離L和各離子的電導(dǎo)總和∑Cⅰλⅰ之間有如下關(guān)系:

式中Cⅰ為i離子的摩爾濃度，λⅰ為i離子的摩爾電導(dǎo)。2024/1/13一、液-固吸附色譜liquid-solidadsorptionchromatograph二、液-液分配色譜liquid-liquidpartitionchromatograph三、離子交換色譜ion-exchangechromatograph四、離子色譜ionchromatograph五、離子對(duì)色譜ion-pairchromatograph六、排阻色譜size-exclusionchromatograph七、親和色譜(AC)Affinity

chromatograph第二節(jié)

主要?jiǎng)e離類型與原理P70basicprincipleandmainseparatingtypes2024/1/13一、液-固吸附色譜

liquid-solidadsorption

chromatography固定相：固體吸附劑：如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是5～10μm的硅膠吸附劑；流動(dòng)相：各種不同極性的一元或多元溶劑，“相似相溶〞原理根本原理：組分在固定相吸附劑上的吸附與解吸；適用于別離相對(duì)分子質(zhì)量中等的油溶性試樣，對(duì)具有不同官能團(tuán)的化合物和異構(gòu)體有較高選擇性；缺點(diǎn)：非線形等溫吸附常引起峰的拖尾；2024/1/13二、液-液分配色譜

liquid-liquidpartition

chromatography固定相與流動(dòng)相均為液體〔互不相溶〕；根本原理：組分在固定相和流動(dòng)相上的分配；流動(dòng)相：對(duì)于親水性固定液，采用疏水性流動(dòng)相，即流動(dòng)相的極性小于固定液的極性〔正相normalphase〕，別離極性化合物，極性小的先出峰。反之，流動(dòng)相的極性大于固定液的極性〔反相reversephase〕。正相與反相的出峰順序相反。

aqorgii

KiStationaryphaseMobilephase2024/1/13固定相：早期涂漬固定液，固定液流失，較少采用；

化學(xué)鍵合固定相：〔將各種不同基團(tuán)通過(guò)化學(xué)反響鍵合到硅膠〔擔(dān)體〕外表的游離羥基上)。2024/1/13三、離子交換色譜

ion-exchange

chromatography鍵合相離子交換劑是以硅膠為基質(zhì)，在它上面覆蓋一層如下圖的離子交換樹(shù)脂涂層，或者在硅膠上直接鍵合離子交換基團(tuán)。固定相：陰離子離子交換樹(shù)脂或陽(yáng)離子離子交換樹(shù)脂；2024/1/13流動(dòng)相：陰離子離子交換樹(shù)脂作固定相，采用酸性水溶液；陽(yáng)離子離子交換樹(shù)脂作固定相，采用堿性水溶液；根本原理：組分在固定相上發(fā)生的反復(fù)離子交換反響；組分與離子交換劑之間親和力的大小與離子半徑、電荷、存在形式等有關(guān)。親和力大，保存時(shí)間長(zhǎng)。陽(yáng)離子交換：陰離子交換：離子交換反響到達(dá)平衡時(shí)，保存值決定于平衡常數(shù)。容量因子k’與平衡常數(shù)K成正比，且與流動(dòng)相中的反離子濃度〔M+、X-〕成反比。應(yīng)用：離子及可離解的化合物，氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等。2024/1/13四、離子色譜P74

ionchromatography

離子交換色譜法由于沒(méi)有與之相匹配的檢測(cè)器，難以發(fā)揮更大的作用。無(wú)機(jī)離子與大多數(shù)有機(jī)離子不同，只有在遠(yuǎn)紫外區(qū)才有吸收，光度檢測(cè)器不適于檢測(cè)無(wú)機(jī)離子，而電導(dǎo)檢測(cè)器卻是可檢測(cè)電解質(zhì)溶液的通用型檢測(cè)器，這種檢測(cè)器簡(jiǎn)單易于操作，但是長(zhǎng)時(shí)間以來(lái)沒(méi)有一種可以和電導(dǎo)檢測(cè)器相適應(yīng)的別離模式。直到1975年Small才提出把電導(dǎo)檢測(cè)器用于離子交換色譜，他為了克服洗脫液中的離子對(duì)電導(dǎo)檢測(cè)器的干擾。在分析柱和檢測(cè)器之間增加一個(gè)“抑制柱〞，消除洗脫液中離子本身帶來(lái)的本底電導(dǎo)，他把這一方法叫做“離子色譜〞〔IonChromtatography〕。這一方法提出之后受到普遍的重視，20多年來(lái)得到了長(zhǎng)足的開(kāi)展，成為分析無(wú)機(jī)和有機(jī)離子十分重要的方法，在各領(lǐng)域中得到廣泛的應(yīng)用。2024/1/13離子色譜儀2024/1/13離子色譜法原理

principleofIC(IonChromatography,簡(jiǎn)稱IC)以無(wú)機(jī)、特別是無(wú)機(jī)陰離子混合物為主要分析對(duì)象,在七十年代出現(xiàn)、八十年代迅速開(kāi)展。

傳統(tǒng)離子交換色譜存在著兩個(gè)難于解決的問(wèn)題：(1)需要高濃度淋洗液洗脫且洗脫時(shí)間很長(zhǎng)；(2)洗脫后的組分缺乏靈敏、快速的在線檢測(cè)方法。2024/1/13離子交換原理，與傳統(tǒng)離子交換的不同點(diǎn)：采用交換容量非常低的特制離子交換樹(shù)脂為固定相；細(xì)顆粒柱填料，高柱效；采用高壓輸液泵；低濃度淋洗液或本底電導(dǎo)抑制〔在別離柱后，采用抑制柱來(lái)消除淋洗液的高本底電導(dǎo)〕；可采用電導(dǎo)檢測(cè)器，快速別離分析微量無(wú)機(jī)離子混合物；各種抑制裝置及無(wú)抑制方法的出現(xiàn)，開(kāi)展迅速。2024/1/13離子色譜具有以下優(yōu)點(diǎn)〔1〕分析速度快可在數(shù)分鐘內(nèi)完成一個(gè)試樣的分析；〔2〕別離能力高在適宜的條件下，可使常見(jiàn)的各種陰離子混合物別離；例：使用雙柱法，在十幾分鐘內(nèi)，可使七種陰離子完全別離?！?〕別離混合陰離子的最有效方法〔4〕耐腐蝕，儀器流路采用全塑件，玻璃柱2024/1/13離子色譜裝置類型

suppressedapparatusofIC抑制型：抑制柱型、連續(xù)抑制型別離柱中離子交換樹(shù)脂的交換容量通常在0.01～0.05毫摩爾/克干樹(shù)脂。用NaOH洗脫，但高電導(dǎo)背景，靈敏度差增加抑制柱解決解決方法？2024/1/13抑制柱為高容量的強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換劑。當(dāng)試樣經(jīng)陰離子交換劑的別離往后，隨流動(dòng)相進(jìn)入抑制柱，在抑制柱中發(fā)生兩個(gè)重要反響：由反響可見(jiàn)：經(jīng)抑制柱后，一方面將大量堿轉(zhuǎn)變?yōu)殡妼?dǎo)很小的水，消除了流動(dòng)相本底電導(dǎo)的影響。同時(shí)，又將樣品陰離子OH-轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的酸，由于H+離子的淌度為Na+離子的7倍，提高了所測(cè)陰離子電導(dǎo)的檢測(cè)靈敏度。對(duì)于陰離子樣品也有相似的作用機(jī)理。淌度：在單位電場(chǎng)強(qiáng)度下,某種離子i在一定溫度和一定介質(zhì)中移動(dòng)的速率2024/1/13離子色譜連續(xù)抑制裝置圖2024/1/13假設(shè)樣品為陽(yáng)離子，用無(wú)機(jī)酸作流動(dòng)相，抑制柱為高容量的強(qiáng)堿性陰離子交換劑。當(dāng)試樣經(jīng)陽(yáng)離子交換劑的別離往后，隨流動(dòng)相進(jìn)入抑制柱，在抑制柱中發(fā)生兩個(gè)重要反響：由反響可見(jiàn)：經(jīng)抑制柱后，一方面將大量酸轉(zhuǎn)變?yōu)殡妼?dǎo)很小的水，消除了流動(dòng)相本底電導(dǎo)的影響。同時(shí)，又將樣品陽(yáng)離子M+轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的堿，由于OH-離子的淌度為Cl-離子的2.6倍，提高了所測(cè)陽(yáng)離子電導(dǎo)的檢測(cè)靈敏度。對(duì)于陰離子樣品也有相似的作用機(jī)理。2024/1/13在別離柱后加一個(gè)抑制柱的離子色譜亦稱為抑制型離子色譜或稱雙柱離子色譜。由于抑制柱要定期再生，而且譜帶在通過(guò)抑制柱后會(huì)加寬，降低了別離度。后來(lái)，F(xiàn)rits等人提出采用抑制柱的離子色譜體系，而采用了電導(dǎo)率極低的溶液，例如1×10-4～5×10-4mol·dm-3苯甲酸鹽或鄰苯二甲酸鹽的稀溶液作流動(dòng)相，稱為非抑制型離子色譜或單柱離子色譜。為了提高信噪比，洗脫液必須要用低電導(dǎo)物質(zhì)，而且它的濃度要低，固定相的離子交換容量也降低，這樣可使被測(cè)離子的保存時(shí)間在合理的范圍之內(nèi)。2024/1/13離子色譜連續(xù)抑制原理圖非抑制型:當(dāng)進(jìn)一步降低別離柱中樹(shù)脂的交換容量(0.007～0.07毫摩爾/克干樹(shù)脂),使用低濃度、低電離度的有機(jī)弱酸及弱酸鹽作淋洗液，如苯甲酸、苯甲酸鹽等。檢測(cè)器可直接與別離柱相連，不需抑制柱。2024/1/13離子色譜的應(yīng)用

applicationofIC陰離子分析:雙柱；薄殼型陰離子交換樹(shù)脂別離柱(3×250mm),流動(dòng)相：0.003mol·L-1NaHCO3/0.0024mol·L-1Na2CO3，流量138mL/hr。七種陰離子在20分鐘內(nèi)根本上得到完全別離，各組分含量在3～50ppm。2024/1/13五、離子對(duì)色譜

ionpairchromatography原理：將一種〔或多種〕與溶質(zhì)離子電荷相反的離子〔對(duì)離子或反離子〕加到流動(dòng)相中使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成疏水性離子對(duì)化合物，使其能夠在兩相之間進(jìn)行分配；

圖離子對(duì)色譜別離過(guò)程示意圖2024/1/13陰離子別離：常采用烷基銨類，如氫氧化四丁基銨或氫氧化十六烷基三甲銨作為對(duì)離子；陽(yáng)離子別離：常采用烷基磺酸類，如己烷磺酸鈉作為對(duì)離子；反相離子對(duì)色譜：非極性的疏水固定相(C-18柱)，含有對(duì)離子B+的甲醇-水或乙腈-水作為流動(dòng)相，試樣離子A-進(jìn)入流動(dòng)相后，生成疏水性離子對(duì)B+A-后；在兩相間分配。根據(jù)離子對(duì)生成反響式，平衡常數(shù)KAB可表示為:根據(jù)定義，溶質(zhì)的分配系數(shù):得：2024/1/13六、排阻色譜色譜

size-exclusionchromatography

固定相：凝膠(具有一定大小孔隙分布)；

原理：按分子大小別離。小分子可以擴(kuò)散到凝膠空隙，由其中通過(guò)，出峰最慢；中等分子只能通過(guò)局部凝膠空隙，中速通過(guò)；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶劑分子小，故在最后出峰。全部在死體積前出峰；可對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量在100-105范圍內(nèi)的化合物按質(zhì)量別離2024/1/13排阻色譜示意圖：M.W.tR2024/1/13M.W.tR2024/1/13M.W.tR2024/1/13M.W.tR2024/1/13M.W.tR2024/1/13七、親和色譜(AC)

Affinitychromatograph原理：利用生物大分子和固定相外表存在的某種特異性親和力，進(jìn)行選擇性別離。2024/1/13一、液相色譜固定相stationaryphaseofHPLC二、液相色譜流動(dòng)相

mobilephaseofHPLC第四節(jié)

液相色譜的固定相與流動(dòng)相stationaryphaseandmobilephaseofHPLC2024/1/13一、液相色譜固定相

stationaryphasesofLC1.液-液分配及離子對(duì)色譜別離固定相〔1〕全多孔型擔(dān)體由氧化硅、氧化鋁、硅藻土等制成的多孔球體；早期采用100μm的大顆粒，外表涂漬固定液，性能不佳已不多見(jiàn)；現(xiàn)采用10μm以下的小顆粒，化學(xué)鍵合制備柱填料；〔2〕外表多孔型擔(dān)體〔薄殼型微珠擔(dān)體〕30～40μm的玻璃微球，外表附著一層厚度為1～2μm的多孔硅膠。外表積小，柱容量低；2024/1/13〔3〕化學(xué)鍵合固定相2024/1/13硅氧硅碳鍵型：≡Si—O—Si—

C

穩(wěn)定，耐水、耐光、耐有機(jī)溶劑，應(yīng)用最廣

2024/1/13化學(xué)鍵合固定相的特點(diǎn)〔1〕傳質(zhì)快，外表無(wú)深凹陷，比一般液體固定相傳質(zhì)快；〔2〕壽命長(zhǎng)，化學(xué)鍵合，無(wú)固定液流失，耐流動(dòng)相沖擊；〔3〕穩(wěn)定性好，耐水、耐光、耐有機(jī)溶劑，穩(wěn)定；〔4〕選擇性好，可鍵合不同官能團(tuán)，提高選擇性；〔5〕有利于梯度洗脫；存在著雙重別離機(jī)制：(鍵合基團(tuán)的覆蓋率決定別離機(jī)理)高覆蓋率：分配為主；低覆蓋率：吸附為主；〔封尾〕2024/1/132.液-固吸附別離固定相2024/1/133.離子交換色譜別離固定相結(jié)構(gòu)類別：〔1〕薄殼型離子交換樹(shù)脂薄殼玻璃珠為擔(dān)體，外表涂約1%的離子交換樹(shù)脂；〔2〕離子交換鍵合固定相薄殼鍵合型；微粒硅膠鍵合型〔鍵合離子交換基團(tuán)〕樹(shù)脂類別：〔1〕陽(yáng)離子交換樹(shù)脂〔強(qiáng)酸性、弱酸性〕〔2〕陰離子交換樹(shù)脂〔強(qiáng)堿性、弱堿性〕2024/1/134.空間排阻別離固定相〔1〕軟質(zhì)凝膠葡聚糖凝膠、瓊脂凝膠等。多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；水為流動(dòng)相。適用于常壓排阻別離?！?〕半硬質(zhì)凝膠苯乙烯-二乙烯基苯交聯(lián)共聚物，有機(jī)凝膠；非極性有機(jī)溶劑為流動(dòng)相，不能用丙酮、乙醇等極性溶劑〔3〕硬質(zhì)凝膠多孔硅膠、多孔玻珠等；化學(xué)穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性好、機(jī)械強(qiáng)度大，流動(dòng)相性質(zhì)影響小，可在較高流速下使用?？煽乜讖讲Ａ⑶?，具有恒定孔徑和窄粒度分布。2024/1/13二、液相色譜的流動(dòng)相

mobilephasesofLC1.流動(dòng)相特性〔1〕液相色譜的流動(dòng)相又稱為：淋洗液，洗脫劑。流動(dòng)相組成改變，極性改變，可顯著改變組分別離狀況；〔2〕親水性固定液常采用疏水性流動(dòng)相，即流動(dòng)相的極性小于固定相的極性，稱為正相液液色譜法，極性柱也稱正相柱。〔3〕假設(shè)流動(dòng)相的極性大于固定液的極性，那么稱為反相液液色譜，非極性柱也稱為反相柱。組分在兩種類型別離柱上的出峰順序相反。2024/1/132.流動(dòng)相類別按流動(dòng)相組成分：?jiǎn)谓M分和多組分；按極性分：極性、弱極性、非極性；按使用方式分：固定組成淋洗和梯度淋洗。常用溶劑：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元組合溶劑作為流動(dòng)相可以靈活調(diào)節(jié)流動(dòng)相的極性或增加選擇性，以改進(jìn)別離或調(diào)整出峰時(shí)間。2024/1/133.流動(dòng)相選擇2024/1/134.選擇流動(dòng)相時(shí)應(yīng)注意的幾個(gè)問(wèn)題〔1〕盡量使用高純度試劑作流動(dòng)相，防止微量雜質(zhì)長(zhǎng)期累積損壞色譜柱和使檢測(cè)器噪聲增加?！?〕防止流動(dòng)相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等?！?〕試樣在流動(dòng)相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。〔4〕流動(dòng)相同時(shí)還應(yīng)滿足檢測(cè)器的要求。當(dāng)使用紫外檢測(cè)器時(shí)，流動(dòng)相不應(yīng)有紫外吸收。選擇高效液相中溶劑的示意圖2024/1/13一、影響別離的因素factorsinfluencedseparation二、別離類型的選擇choiceofseparationtypes三、液相色譜的應(yīng)用applicationofHPLC四、液相制備色譜preparativeliquidchromatography第五節(jié)

影響別離的因素與操作條件的選擇

factorsinfluencedseparationandchoiceofoperationcondition2024/1/13一、影響別離的因素

factorsinfluencedseparation影響別離的因素與提高柱效的途徑在高效液相色譜中,液體的擴(kuò)散系數(shù)僅為氣體的萬(wàn)分之一，那么速率方程中的分子擴(kuò)散項(xiàng)B/U較小，可以忽略不計(jì)，即：H=A+Cu故液相色譜H-u曲線與氣相色譜的形狀不同，如下圖。2024/1/13

液體的黏度比氣體大一百倍，密度為氣體的一千倍，故降低傳質(zhì)阻力是提高柱效主要途徑。由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。液相色譜中，不可能通過(guò)增加柱溫來(lái)改善傳質(zhì)。恒溫改變淋洗液組成、極性是改善別離的最直接的因素。2024/1/132.流速流速大于0.5cm/s時(shí),H～u曲線是一段斜率不大的直線。降低流速，柱效提高不是很大。但在實(shí)際操作中，流量仍是一個(gè)調(diào)整別離度和出峰時(shí)間的重要可選擇參數(shù)。2024/1/13速率方程可簡(jiǎn)化為：

Dm、Ds—試樣分子在流動(dòng)相、固定液中的擴(kuò)散系數(shù)

關(guān)鍵是將H變小，而H變小關(guān)鍵是使dp變小，df變小。因此采用3～5m固定相顆粒，且鍵合相層薄，因此df就小，由于H很小，n很多，R大改進(jìn)，實(shí)現(xiàn)了高效。在別離良好的根底上，才可提高流動(dòng)相線速，節(jié)省了分析時(shí)間，從而實(shí)現(xiàn)了高速別離。如何實(shí)現(xiàn)高速別離？2024/1/13影響色譜峰擴(kuò)展的因素2024/1/13二、別離類型選擇

choiceofseparationtypes2024/1/13三、HPLC的應(yīng)用

applicationofHPLC

1.環(huán)境中有機(jī)氯農(nóng)藥殘留量分析

固定相：薄殼型硅膠(37～50m)流動(dòng)相：正己烷流速：1.5mL/min色譜柱：50cm2.5mm(內(nèi)徑)檢測(cè)器：差示折光檢測(cè)器2024/1/132.稠環(huán)芳烴的分析

稠環(huán)芳烴多為致癌物質(zhì)。

固定相：十八烷基硅烷化鍵合相流動(dòng)相：20%甲醇-水～100%甲醇線性梯度淋洗，2%/min

流速：1mL/min

柱溫：50oC柱壓：70104Pa

檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器2024/1/13四、制備型液相色譜

preparativeliquidchromatography獲得高純物質(zhì)〔色譜純〕的有效方法。半制備柱〔內(nèi)徑8mm，長(zhǎng)度15～30cm〕，一次制備量０.1～１mg；1.色譜柱的柱容量〔柱負(fù)荷〕對(duì)分析柱：不影響柱效時(shí)的最大進(jìn)樣量；對(duì)制備柱：不影響收集物純度時(shí)的最大進(jìn)樣量；超載：進(jìn)樣量超過(guò)柱容量。柱效迅速下降，峰變寬。超載可提高制備效率，以柱效下降一半或容量因子k降低10%為宜。2024/1/132.液相制備色譜的方法收集組分時(shí)，通常有以下情況：〔1〕可獲得良好別離，主峰使用制備柱，超載提高效率；〔2〕兩主成分之間的小組分；超載，別離切分使待別離組分成為主成分〔富集〕后，再次別離制備。2024/1/133.制備型液相色譜

制備型液相色譜：結(jié)構(gòu)與分析型一樣，但泵流量大、進(jìn)樣量大、采用制備柱；柱后餾分收集器。制備柱：內(nèi)徑20～50mm，柱長(zhǎng)50cm。2024/1/13一、超臨界流體色譜的特點(diǎn)與原理featureandprincipleofSFC二、超臨界流體色譜儀的結(jié)構(gòu)流程structureandgeneralprocessofSFC三、超臨界流體色譜的應(yīng)用applicationofSFC第七節(jié)

超臨界色譜supercriticalfluidchromatograph,SFC2024/1/13一、超臨界流體色譜的特點(diǎn)與原理

principleandcharacterofsupercriticalfluidchromatography1.概述超臨界流體：在高于臨界壓力與臨界溫度時(shí)，物質(zhì)的一種狀態(tài)。性質(zhì)介于液體和氣體之間。超臨界流體色譜(SFC)，80年代快速開(kāi)展，具有液相、氣相色譜不具有的優(yōu)點(diǎn):〔1〕可處理高沸點(diǎn)、不揮發(fā)試樣；〔2〕比LC有更高的柱效和別離效率。2024/1/132.超臨界流體性質(zhì)〔1〕性質(zhì)介于液體和氣體之間;具有氣體的低黏度、液體的高密度，擴(kuò)散系數(shù)位于兩者之間?！?〕可通過(guò)改變超臨界流體的密度〔程序改變〕調(diào)節(jié)組分別離〔類似于氣相色譜的程序升溫，液相色譜中的梯度淋洗〕。超臨界流體的密度與壓力有關(guān)。2024/1/133.原理SFC的流動(dòng)相：超臨界流體；CO2、N2O、NH3SFC的固定相：固體吸附劑〔硅膠〕或鍵合到載體〔或毛細(xì)管壁〕上的高聚物；可使用液相色譜的柱填料。填充柱SFC和毛細(xì)管柱SFC；別離機(jī)理：吸附與脫附。組分在兩相間的分配系數(shù)不同而被別離；通過(guò)調(diào)節(jié)流動(dòng)相的壓力〔調(diào)節(jié)流動(dòng)相的密度〕，調(diào)整組分保存值；2024/1/13壓力效應(yīng)：SFC的柱壓降大〔比毛細(xì)管色譜大30倍〕，對(duì)別離有影響〔柱前端與柱尾端分配系數(shù)相差很大，產(chǎn)生壓力效應(yīng)〕；超臨界流體的密度受壓力在臨界壓力處最大，超過(guò)該點(diǎn)，影響小，超過(guò)臨界壓力20%，柱壓降對(duì)別離的影響?。粔毫π?yīng)：在SFC中，壓力變化對(duì)容量因子產(chǎn)生顯著影響，超流體的密度隨壓力增加而增加，密度增加提高溶劑效率，淋洗時(shí)間縮短。CO2流動(dòng)相，當(dāng)壓力改變：7.0→9.0×106Pa，那么：C16H34的保存時(shí)間25min→5min。2024/1/13程

序

升

壓2024/1/13HPLC與SFC

比較2024/1/13二、超臨界流體色譜的結(jié)構(gòu)與流程

instrument

structureandthegeneralprocessofSFC1.結(jié)構(gòu)流程

2024/1/132.主要部件〔1〕SFC的高壓泵無(wú)脈沖的注射泵；通過(guò)電子壓力傳感器和流量檢測(cè)器，計(jì)算機(jī)控制流動(dòng)相的密度和流量；〔2〕SFC的色譜柱和固定相可以采用液相色譜柱和交聯(lián)毛細(xì)管柱；SFC的固定相：固體吸附劑〔硅膠〕或鍵合到載體〔或毛細(xì)管壁〕上的高聚物；專用的毛細(xì)管柱SFC；2024/1/13主要部件〔3〕流動(dòng)相SFC的流動(dòng)相：超臨界流體；CO2、N2O、NH3CO2應(yīng)用最廣泛；無(wú)色、無(wú)味、無(wú)毒、易得、對(duì)各類有機(jī)物溶解性好，在紫外光區(qū)無(wú)吸收；缺點(diǎn)：極性太弱；加少量甲醇等改性；〔4〕檢測(cè)器可采用液相色譜檢測(cè)器，也可采用氣相色譜的FID檢測(cè)器2024/1/13三、超臨界流體色譜的應(yīng)用

applicationofSFC1.聚苯醚低聚物的分析色譜柱：10m×63μmi.d.

毛細(xì)管柱，固定相：鍵合二甲基聚硅氧烷；流動(dòng)相：CO2；柱溫：120

C；程序升壓；2024/1/132.甘油三酸酯的分析四種組分僅雙鍵數(shù)目和位置不同，難別離；色譜柱：DB-225SFC毛細(xì)管柱；流動(dòng)相：CO2；從15MPa程序升壓到27MPa；2.5hr完全別離。2024/1/13第七節(jié)毛細(xì)管電泳

〔Capillaryelectrophoresis，CE〕電滲流現(xiàn)象：玻璃外表存在硅羥基,pH＞3時(shí),形成雙電層，在高電場(chǎng)的作用下引起柱中的溶液整體向負(fù)極移動(dòng)，速度。2024/1/13別離過(guò)程

電場(chǎng)作用下，柱中出現(xiàn)：電泳現(xiàn)象和電滲流現(xiàn)象。帶電粒子的遷移速度=電泳和電滲流兩種速度的矢量和。正離子：兩種效應(yīng)的運(yùn)動(dòng)方向一致，在負(fù)極最先流出；中性粒子無(wú)電泳現(xiàn)象，受電滲流影響，在陽(yáng)離子后流出；陰離子：兩種效應(yīng)的運(yùn)動(dòng)方向相反，時(shí),陰離子在負(fù)極最后流出,在這種情況下,不但可以按類分離,除中性粒子外,同種類離子由于受到的電場(chǎng)力大小不一樣也同時(shí)被相互分離。2024/1/13高效毛細(xì)管電泳儀器〔1〕2024/1/13高效毛細(xì)管電泳儀器〔2〕2024/1/13高效毛細(xì)管電泳儀器〔3〕2024/1/13三維毛細(xì)管電泳系統(tǒng)〔AgilentCE，美國(guó)Agilent公司〕高效毛細(xì)管電泳儀器〔4〕2024/1/13特點(diǎn)：使用散熱效率很高的毛細(xì)管〔25~50μm〕可以減少電泳時(shí)產(chǎn)生的焦耳熱而導(dǎo)致的區(qū)域展寬，因而可以采用較高的電壓〔20~30kV〕，有利于獲得很高的別離效率，每米塔板數(shù)可達(dá)幾十萬(wàn)，高者可達(dá)106，分析時(shí)間一般小于30min，試樣分析范圍寬，檢測(cè)限低。進(jìn)樣量少，可達(dá)nl級(jí)，極微量的成分也可檢出，且樣品無(wú)需進(jìn)行復(fù)雜的前處理，就可別離分析。高分辨率：理論塔板數(shù)高達(dá)數(shù)百萬(wàn)塊，甚至數(shù)千萬(wàn)塊。高靈敏度：可檢測(cè)出低至10-21mol/L濃度的物質(zhì)。高分析速度：可在3分鐘內(nèi)別離30種陰離子；1.7分鐘別離19種陽(yáng)離子；4分鐘可別離10種蛋白質(zhì).試樣用量少：僅需幾nL〔10-9L〕的試樣儀器簡(jiǎn)單，操作本錢低：分析一個(gè)試樣僅需幾毫升流動(dòng)液。2024/1/13應(yīng)用范圍：

在中、西藥物等分析領(lǐng)域廣泛地被應(yīng)用，同時(shí)也廣泛地向生命科學(xué)領(lǐng)域的各個(gè)方面滲透，大量用于氨基酸、蛋白質(zhì)、肽、低聚核苷的別離，對(duì)糖蛋白、糖肽型化合物的研究也正在進(jìn)行之中。其中生物堿、有機(jī)酸等所有帶電或不帶電的化合物均可進(jìn)行定量檢測(cè),蛋白質(zhì)、糖肽、糖蛋白那么可得到很好的別離分析。2024/1/13二、構(gòu)造

主要包括高壓電源、毛細(xì)管、檢測(cè)器和貯液槽四個(gè)局部。2024/1/13三、CE的別離模式1、毛細(xì)管區(qū)帶電泳〔capillaryzoneelectrophoresisCZE〕2、毛細(xì)管凝膠電泳〔capillarygelelectrophoresisCGE〕3、膠束電動(dòng)力學(xué)毛細(xì)管電泳〔micellarelectrokineticcapillarychromatography，MECC或MEKC〕4、毛細(xì)管等電聚焦〔capillaryisoelectricfocusingCIEF〕5、毛細(xì)管等速電泳〔capillaryisotachoporesis，CITP〕6、毛細(xì)管電滲色譜〔capillaryelectroosmoticchromatography，CEC)種類較多，實(shí)際應(yīng)用不多，多用于科學(xué)研究——主要原因重現(xiàn)性不高2024/1/132024/1/13第八節(jié)薄層色譜法TLC〔一〕概述1．定義：將固定相均勻涂布在外表光滑的平板上，形成薄層而進(jìn)行色譜別離和分析的方法2．操作過(guò)程：鋪板→活化→點(diǎn)樣→展開(kāi)→定位(定性)/洗脫(定量)3．別離機(jī)制：吸附〔分配，離子交換，空間排阻〕4．特點(diǎn)：分析快速、靈敏、顯色方便5．應(yīng)用：藥物雜質(zhì)檢查、純度測(cè)定2024/1/132024/1/13〔二〕定性參數(shù)1.比移值RfRf與K有關(guān)，即與組分性質(zhì)〔溶解度〕以及薄層板和展開(kāi)劑的性質(zhì)有關(guān)色譜條件一定，Rf只與組分性質(zhì)有關(guān)，是薄層色譜根本定性參數(shù)，說(shuō)明組分的色譜保留行為。2024/1/131〕K↑大，Rf↓小2〕薄層板一定，對(duì)于極性組分展開(kāi)劑極性↑大，Rf↑大〔容易洗脫〕展開(kāi)劑極性↓小，Rf↓小〔不容易洗脫〕3〕Rf范圍：0<Rf<1〔組分遷移速度和距離小于展開(kāi)劑遷移速度和距離〕Rf=0.2——0.8〔常用〕0.3——0.5〔最正確〕2024/1/13參考物與被測(cè)組分在完全相同條件下展開(kāi)，可以消除系統(tǒng)誤差，大大提高重現(xiàn)性和可靠性；參考物可以是后參加純物質(zhì)，也可是樣品中組分相比照移值Rs與組分、參考物性質(zhì)及色譜條件有關(guān)，范圍可以大于或小于12.相比照移值Rs2024/1/13〔三〕吸附劑的選擇

根據(jù)被測(cè)物極性和吸附劑的吸附能力

被測(cè)物極性強(qiáng)——弱極性吸附劑

被測(cè)物極性弱——強(qiáng)極性吸附劑〔四〕展開(kāi)劑的選擇〔同液固吸附色譜流動(dòng)相的選擇〕根據(jù)被測(cè)組分、吸附劑和展開(kāi)劑本身的極性2024/1/132024/1/13〔五〕薄層板的制備定性分析——窄條定量分析——10×20cm〔六〕定性與定量分析定性分析——日光，紫外光，顯色