6江南大學(xué)微生物綜合課件

第六章微生物菌種的篩選與保藏第一節(jié)從自然界中分離篩選菌種6江南大學(xué)微生物綜合生產(chǎn)菌株來源

1、索取或購買2、自己選育(1)用原有菌株進(jìn)行遺傳改造進(jìn)行育種①

誘變育種②

基因重組育種(2)向菌種保藏機(jī)構(gòu)索取、購買出發(fā)菌株進(jìn)行選育(3)從自然界中分離菌種從自然界中分離菌種就是從自然界微生物資源中有目的、快速、準(zhǔn)確地選出所需要的菌種。6江南大學(xué)微生物綜合

設(shè)計(jì)方案→采樣→增殖培養(yǎng)*→平板分離→篩選(初篩、復(fù)篩)→單株純種分離→性能考察(生產(chǎn)性能試驗(yàn)、毒性試驗(yàn)、菌種鑒定）從自然界中分離篩選菌種的一般步驟采樣

從自然界種采集含目的菌的樣品6江南大學(xué)微生物綜合1 環(huán)境條件對土樣本中微生物分布的影響（1） 營養(yǎng)環(huán)境①高糖環(huán)境（加工蜜餞、糖果、蜂蜜的環(huán)境）土壤中：耐滲透壓酵母，檸檬能產(chǎn)生菌，氨基能產(chǎn)生菌；②富含淀粉環(huán)境污泥、水溝旁土壤中：淀粉酶產(chǎn)生菌；③森林中腐葉爛草下土壤：纖維素酶產(chǎn)生菌；④含蛋白質(zhì)（蠶絲、豆餅、生皮曬廠）土壤中：蛋白酶產(chǎn)生菌；⑤油田土：石油分解菌；6江南大學(xué)微生物綜合（2） 水分①離地表5-15cm土樣②含水過多、過少都不理想（3） 溫度：采樣以秋季為好（4） 通風(fēng)（5）酸堿度：細(xì)菌、放線菌：中性或偏堿；霉菌、酵母：偏酸6江南大學(xué)微生物綜合2 采樣方法（1） 去除表層土（2） 取5-15cm土樣幾十克，裝入無菌牛皮低袋或逆料袋中3 注意（1） 記錄：時(shí)間，地點(diǎn)，環(huán)境情況等（2） 樣品袋應(yīng)封好口，防止水分失去（3） 土樣應(yīng)在分離前破碎（4） 盡快分離6江南大學(xué)微生物綜合二.增殖培養(yǎng)（富集培養(yǎng)）1 適用：樣品中目的菌數(shù)量不夠多時(shí)2 目的：提高樣品中目的菌的數(shù)量和比例3 原理：通過控制營養(yǎng)成分或培養(yǎng)條件，使目的菌得以繁殖和/或非目的菌的生長受到抑制6江南大學(xué)微生物綜合4 方法（1） 控制營養(yǎng)成分

①

纖維素為唯一碳源，可增殖分解纖維素的菌②可溶性淀粉為唯一碳源，可增殖產(chǎn)淀粉酶的菌種③酒精廢水，可以增殖廢水利用菌但：多種微生物所利用的碳源、氮源不能作控制因素（2） 控制培養(yǎng)基pH細(xì)菌、放線菌：中性偏堿，真菌：偏酸但非目的菌的生長不能被完全抑制6江南大學(xué)微生物綜合（3）控制培養(yǎng)溫度30℃左右培養(yǎng)，可培殖嗜溫微生物50~60℃培養(yǎng)，可培殖嗜熱微生物，篩選耐熱菌株（4）熱處理——增殖芽孢細(xì)菌樣品懸浮液經(jīng)80℃、10分鐘處理，殺死營養(yǎng)體，再添加營養(yǎng)培養(yǎng)后可增殖產(chǎn)芽孢細(xì)菌6江南大學(xué)微生物綜合（5）添加抑制劑10%酚數(shù)滴：抑制細(xì)菌霉菌生長，增殖放線菌抗生素：抑制細(xì)菌放線菌，增殖酵母、霉菌多粘菌素B：抑制G-細(xì)菌青霉素：抑制G+細(xì)菌制毒菌素：抑制真菌放線菌酮：抑制真菌6江南大學(xué)微生物綜合三.純種分離目的：將目的菌從混雜的微生物中分離出來，獲得純培養(yǎng)1 純種分離的一般方法（1）稀釋平板法：傾注平板或涂布平板（2）劃線法6江南大學(xué)微生物綜合6江南大學(xué)微生物綜合6江南大學(xué)微生物綜合6江南大學(xué)微生物綜合（3）組織培養(yǎng)法：適用于分離高等真菌及植物病原菌高等真菌：如香菇→切1小塊菌蓋→10%漂白粉消毒處理→無菌水沖洗→置瓊脂平板上→培養(yǎng)→長出菌絲體或：→懸掛在有瓊脂培養(yǎng)基的三角瓶內(nèi)→培養(yǎng)→長出菌絲體注意：對蔓延性霉菌：①

加1%去氧膽酸鈉②

察氏培養(yǎng)基：0.01%蔗糖，0.1%山梨糖6江南大學(xué)微生物綜合2、平皿反應(yīng)快速檢出法——定性或半定量（1）紙片培養(yǎng)顯色法濾紙飽浸含有指示劑的液體培養(yǎng)基用接種環(huán)接種保濕恒溫培養(yǎng)據(jù)菌落周圍變色圈和菌落直徑比值判別目的物產(chǎn)量6江南大學(xué)微生物綜合（2）透明圈法：根據(jù)瓊脂培養(yǎng)上透明圈/菌落直徑大小判別目的產(chǎn)物的產(chǎn)量淀粉平板透明圈：淀粉酶碳酸鈣平板透明圈：產(chǎn)酸酪素（蛋白）透明圈：蛋白酶6江南大學(xué)微生物綜合（3）變色圈法淀粉平板噴稀碘液：透明圈，液化型淀粉酶支鏈淀粉平板噴稀碘液：藍(lán)色圈：異淀粉酶無色圈：液化型淀粉酶葡聚糖平板加剛果紅：葡聚糖酶木聚糖平板加剛果紅：木聚糖酶6江南大學(xué)微生物綜合（4）生長圈法工具菌：營養(yǎng)缺酸型，不能合成的物質(zhì)（生長因素）為目的菌積累的產(chǎn)物菌落形態(tài)明顯不同于目的菌方法：106~107工具菌與樣品稀釋液一起涂布至瓊脂培養(yǎng)基表面，具有生長圈的菌落即為目的菌適用：氨基酸，核苷酸，維生素產(chǎn)生菌的選育6江南大學(xué)微生物綜合（5）抑制圈適用：抗生素產(chǎn)生菌的選育工具菌：對目的抗生素敏感的微生物例：目的菌為產(chǎn)生抗G+細(xì)菌的抗生素的菌株工具菌可使用金黃色葡萄球菌6江南大學(xué)微生物綜合方法：目的菌分離：稀釋分離法，培養(yǎng)長出菌落代謝物積累：用打孔器（6CM）將菌落連同周圍瓊脂培養(yǎng)基一起取下，放一無菌空培養(yǎng)皿內(nèi)，保濕培養(yǎng)4-5天，使新產(chǎn)生抗生素積累于小瓊脂塊中測定：取107工具菌涂布于球脂培養(yǎng)基，將小瓊脂塊放于上面培養(yǎng)過夜，抑菌圈的出現(xiàn)，說明瓊脂塊中有抗生素，大小說明抗生素單位的高低6江南大學(xué)微生物綜合6江南大學(xué)微生物綜合3、厭氧性微生物的分離法厭氧培養(yǎng)法去除培養(yǎng)基中溶解氧，降低Eh除去環(huán)境中的O26江南大學(xué)微生物綜合（1）去除培養(yǎng)基中的溶解氧，降低Eh煮沸法：將培養(yǎng)基置沸水中煮沸15分鐘，驅(qū)除其中的溶解氧，用冷水急驟冷卻，勿再搖動，Eh可降至0.1V以下培養(yǎng)基預(yù)還原：將培養(yǎng)基中加入還原性物質(zhì)：半胱氨酸，巰基化生物，Na2S，抗壞血酸等降低Eh6江南大學(xué)微生物綜合（2）創(chuàng)造無氧環(huán)境物理除氧空氣置換法：干燥器或厭氧培養(yǎng)罐抽真空76mmHg→充入N2（反復(fù)3次）→充入CO210%+H210%+N280%化學(xué)除氧

H2+O2→H2O(鈀作催化劑）GASPAK罐除氧：硼氫化鈉、檸檬酸，碳酸氧鈉化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生H2

和CO2，H2與O2反應(yīng)生成水厭氧指示劑6江南大學(xué)微生物綜合（3）厭氧分離（培養(yǎng)）技術(shù)高層瓊脂柱技術(shù)厭氧罐技術(shù)厭氧手套箱技術(shù)6江南大學(xué)微生物綜合厭氧培養(yǎng)裝置GasPak6江南大學(xué)微生物綜合6江南大學(xué)微生物綜合6江南大學(xué)微生物綜合6江南大學(xué)微生物綜合四

、篩選1、初篩：通風(fēng)發(fā)酵菌種，通過搖瓶發(fā)酵進(jìn)行，每株一瓶目的：淘汰80%-90%的分離菌株中的低產(chǎn)菌（1）培養(yǎng)條件：主要通過查閱資料及需要而預(yù)先決定：如培養(yǎng)基組成，通風(fēng)量（裝液量，搖瓶機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)），pH、溫度、培養(yǎng)時(shí)間等。（2）分析測定：最好定量，如較困難時(shí)可采取半定量方法6江南大學(xué)微生物綜合2、復(fù)篩：每株3~5瓶，可提前培養(yǎng)種子，使接種量比較一致，3~5%接種量，培養(yǎng)條件可同初篩分析測定：定量，注意副產(chǎn)物復(fù)篩可進(jìn)行多次，逐步淘汰，留下3~5株甚至最好的1株6江南大學(xué)微生物綜合

初篩和復(fù)篩的比較6江南大學(xué)微生物綜合好氧培養(yǎng)6江南大學(xué)微生物綜合五、培養(yǎng)工藝條件試驗(yàn)與生產(chǎn)試驗(yàn)1、搖瓶發(fā)酵條件

培養(yǎng)基組成，初始pH，通風(fēng)量（裝液量），接種量，培養(yǎng)溫度…2、小型臺式發(fā)酵罐發(fā)酵工藝條件溶解氧控制，pH值控制，原料添加模式，消泡劑…6江南大學(xué)微生物綜合第二節(jié)菌種退化、復(fù)壯與保藏

在生物進(jìn)化中：遺傳性的變異是絕對的，穩(wěn)定性是相對的；在變異中：退化性的變異是大量的，進(jìn)化性的變異是個(gè)別的。6江南大學(xué)微生物綜合一.菌種的退化菌種退化degeneration的表現(xiàn)生產(chǎn)形狀的劣化,遺傳標(biāo)記的丟失,原有的典型形狀的不典型等菌落及細(xì)胞形態(tài)的改變生長速度緩慢代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力下降，即負(fù)突變致病菌對宿主侵染力下降抗不良環(huán)境條件（抗噬菌體，抗低溫）能力減弱6江南大學(xué)微生物綜合2.菌種退化的原因：基因自發(fā)突變退化是發(fā)生在群體細(xì)胞中的一個(gè)從量變到質(zhì)變的逐步演變過程。自發(fā)突變率10-8~10-9

加速退化的因素傳代次數(shù)過多不適宜的培養(yǎng)條件6江南大學(xué)微生物綜合3.防止退化的措施（1）控制傳代次數(shù)（2）創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件：培養(yǎng)基；培養(yǎng)溫度等保藏培養(yǎng)基：細(xì)菌：營養(yǎng)瓊脂放線菌：高氏一號霉菌：察氏培養(yǎng)基酵母菌：YEPD。（3）利用不易衰退的細(xì)胞傳代：霉菌、放線菌：無性孢子或有性孢子（4）采用有效的菌種保藏方法

6江南大學(xué)微生物綜合二.菌種的復(fù)壯rejuvenation狹義復(fù)壯

在菌種已發(fā)生衰退的情況下，通過純種分離和測定典型性狀、生產(chǎn)性能等指標(biāo)，從已衰退的群體中篩選出少數(shù)尚未退化的個(gè)體，以達(dá)到恢復(fù)原菌株固有性狀的相應(yīng)措施；廣義復(fù)壯在菌種的典型特征或生產(chǎn)性狀尚未衰退前，就經(jīng)常有意識地采取純種分離和生產(chǎn)性狀的測定工作，以期從中選擇到自發(fā)的正突變個(gè)體。也稱生產(chǎn)育種6江南大學(xué)微生物綜合1、純種分離法平板表面涂布法平板劃線分離法瓊脂培養(yǎng)基澆注法用“分離小室”進(jìn)行單細(xì)胞分離用顯微操縱器進(jìn)行單細(xì)胞分離用菌絲尖端切割法進(jìn)行單細(xì)胞分離菌落純（菌種純）細(xì)胞純（菌株純）純種分離法6江南大學(xué)微生物綜合小滴分離法6江南大學(xué)微生物綜合2、通過宿主體復(fù)壯：病原菌3、淘汰已衰退的個(gè)體對S.microflavus“5406”農(nóng)用抗生菌的分生孢子采用-10~-30℃的低溫處理5~7天，使其死亡率達(dá)到80%左右，結(jié)果會在抗低溫的存活個(gè)體中留下未退化的個(gè)體，從而達(dá)到復(fù)壯的效果。6江南大學(xué)微生物綜合三.菌種的保藏（一）目的

使微生物菌種保持原來的形狀和活力不退化、不死亡、不被污染，便于研究、交換和使用。（二）原理挑選典型培養(yǎng)物（typicalculture）的優(yōu)良純種，并創(chuàng)造最有利于休眠的環(huán)境條，件使微生物處于代謝不活潑、生長受抑制的休眠狀態(tài)。6江南大學(xué)微生物綜合措施：低溫：生長溫度低限約為-30℃，水溶液中酶促反應(yīng)溫度低限-140℃

干燥缺氧避光缺乏營養(yǎng)添加保護(hù)劑：甘油、脫脂牛奶、血清白蛋白添加酸度中和劑6江南大學(xué)微生物綜合（三）菌種保藏方法1、斜面保藏法方法：接種適宜斜面培養(yǎng)基→培養(yǎng)→4℃保藏措施：低溫：4℃適用：各大類保藏期：1~6個(gè)月用橡皮塞代替棉塞，可適當(dāng)延長保藏時(shí)間6江南大學(xué)微生物綜合2、石蠟油封藏法方法：斜面或半固體接種→培養(yǎng)→加無菌液蠟高出培養(yǎng)基1cm→4~15℃保藏措施：低溫，隔氧適用：不能利用石油的各大類保藏期：1~2年優(yōu)點(diǎn)：簡便6江南大學(xué)微生物綜合3、砂土管保藏法方法：孢子或芽孢懸液→加入無菌砂土管中→干燥→封口→保藏措施：無營養(yǎng)，缺氧，干燥適用：產(chǎn)孢子（芽孢）微生物保藏期：1~10年6江南大學(xué)微生物綜合4、冷凍干燥保藏方法：菌種培養(yǎng)→用保護(hù)劑懸浮→加入安醅管中→低溫凍結(jié)（-25—-40℃）→抽真空（至0.01mmHg）→真空封口→檢查真空度→保藏措施：低溫、干燥，缺氧，有保護(hù)劑適用：各大類保藏期：5~15年或更長6江南大學(xué)微生物綜合5、甘油懸液低溫冷凍保藏法方法：菌種培養(yǎng)→15~30%甘油緩沖液懸浮→加入保藏管中→置-70℃冰箱保藏措施：低溫（-70℃）、保護(hù)劑（15~50%甘油）適用：細(xì)菌、酵母菌保藏期：約10年6江南大學(xué)微生物綜合6、液氮保藏法方法：菌種培養(yǎng)→保護(hù)劑懸浮→加入保藏管中→置液氮瓶中措施：超低溫（-196℃）、保護(hù)劑適用：各大類保藏期：>15年6江南大學(xué)微生物綜合（四）菌種保藏機(jī)構(gòu)1、中國微生物菌種保藏管理委員會CCCCM中國普通微生物菌種保藏中心CGMCC(歸口中國科學(xué)院)

中國科學(xué)院微生物研究所(AS)

中國科學(xué)院武漢病毒研究所(AS-IV)