生物化學(xué)-第二章 蛋白質(zhì)化學(xué)-物大分子分離純化主要方法

生物大分子別離純化主要方法1/17/20241生物大分子別離純化的一般步驟

層析法電泳法超離心法超濾鹽析〔硫酸銨鹽析〕等點電沉淀有機溶劑沉淀透析│←前處理→│←粗分級→│←細(xì)分級→│材料選擇與處理細(xì)胞破碎〔機械破碎、溶漲和自溶、酶解、化學(xué)處理〕生物組織→無細(xì)胞提取液→粗產(chǎn)品→→結(jié)晶1/17/20242鹽析法、有機溶劑沉淀法、重金屬鹽沉淀法、生物堿或酸類沉淀法、加熱變性沉淀法離子交換層析吸附層析凝膠過濾〔分子篩〕親和層析等電聚集層析別離純化方法沉淀法層析法電學(xué)法電泳法等電聚焦透析超濾離心法1/17/20243純度鑒定分子量測定層析法：凝膠過濾;高效液相色譜法(HPLC)電泳法：PAGE、梯度凝膠電泳、等電聚焦電泳等免疫化學(xué)法：專一的沉淀線SDS-PAGE電泳法：測定亞基數(shù)超速離心：成分均一其它：如,結(jié)晶法……1/17/20244定義：利用半透膜把大小分子分開的方法。操作蛋白質(zhì)溶液置半透膜袋中，置流動溶劑〔如蒸餾水〕中，使小分子雜質(zhì)〔如無機鹽、單糖、雙糖、AA、小肽等透出〕蛋白質(zhì)留于袋中而得到別離。透析1/17/20245透析工作圖半透膜原理1/17/202461/17/202471/17/20248樣品在層析時的移動速度可用遷移率Rf值表示：

樣品原點到斑點中心的距離

Rf=——————————————樣品原點到溶劑前沿的距離1/17/20249(一)層析相關(guān)概念1.固定相：固定相是層析的一個基質(zhì)。它可以是固體物質(zhì)〔如吸附劑，凝膠，離子交換劑等〕，也可以是液體物質(zhì)〔如固定在硅膠或纖維素上的溶液〕，這些基質(zhì)能與待別離的化合物進(jìn)行可逆的吸附，溶解，交換等作用。它對層析的效果起著關(guān)鍵的作用。1/17/2024102.流動相：在層析過程中，推動固定相上待別離的物質(zhì)朝著一個方向移動的液體、氣體或超臨界體等，都稱為流動相。柱層析中一般稱為洗脫劑，薄層層析時稱為展層劑。它也是層析別離中的重要影響因素之一。1/17/2024113.分配系數(shù)及遷移率〔或比移值〕：分配系數(shù)是指在一定的條件下，某種組分在固定相和流動相中含量〔濃度〕的比值，常用K來表示。分配系數(shù)是層析中別離純化物質(zhì)的主要依據(jù)。K=Cs/CmCs:固定相中的濃度，Cm:流動相中的濃度。遷移率〔或比移值〕是指：在一定條件下，在相同的時間內(nèi)某一組分在固定相移動的距離與流動相本身移動的距離之比值。常用Rf來表示。1/17/202412相對遷移率：是指在一定條件下，在相同時間內(nèi)，某一組分在固定相中移動的距離與某一標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在固定相中移動的距離之比值。它可以小于等于1，也可以大于1。用Rx來表示。分配系數(shù)主要與以下因素有關(guān)：①被別離物質(zhì)本身的性質(zhì)；②固定相和流動相的性質(zhì)；③層析柱的溫度。1/17/2024134.分辨率〔或別離度〕分辨率一般定義為：相鄰兩個峰的分開程度。用Rs來表示。Rs值越大，兩種組分別離的越好。當(dāng)Rs=1時，兩組分具有較好的別離，互相沾染約2%，即每種組分的純度約為98%。當(dāng)Rs=1.5時，兩組分根本完全分開，每種組分的純度可到達(dá)99.8%。如果兩種組分的濃度相差較大時，尤其要求較高的分辨率。1/17/2024145.正相色譜與反相色譜正相色譜是指固定相的極性高于流動相的極性，因此，在這種層析過程中非極性分子或極性小的分子比極性大的分子移動的速度快，先從柱中流出來。反相色譜是指固定相的極性低于流動相的極性，在這種層析過程中，極性大的分子比極性小的分子移動的速度快而先從柱中流出。一般來說，別離純化極性大的分子〔帶電離子等〕采用正相色譜〔或正相柱〕，而別離純化極性小的有機分子〔有機酸、醇、酚等〕多采用反相色譜〔或反相柱〕1/17/2024156.操作容量〔或交換容量〕在一定條件下，某種組分與基質(zhì)〔固定相〕反響到達(dá)平衡時，存在于基質(zhì)上的飽和容量，我們稱為操作容量〔或交換容量〕。它的單位是毫摩爾〔或毫克〕/克〔基質(zhì)〕或毫摩爾〔或毫克〕/毫升〔基質(zhì)〕1/17/202416數(shù)值越大，說明基質(zhì)對該物質(zhì)的親合力越強。應(yīng)當(dāng)注意，同一種基質(zhì)對不同種類分子的操作容量是不相同的，這主要是由于分子大小〔空間效應(yīng)〕、帶電荷的多少、溶劑的性質(zhì)等多種因素的影響。因此，實際操作時，參加的樣品量要盡量少些，特別是生物大分子，樣品的參加量更要進(jìn)行控制，否那么用層析方法不能得到有效的別離。1/17/202417二、層析法分類〔按別離原理分類〕分配層析吸附層析凝膠過濾〔分子篩層析〕離子交換層析親和層析聚焦層析1/17/202418層析法分類〔按裝置分類〕

紙層析薄膜層析

柱層析1/17/202419填充物分部收集玻璃柱洗脫液樣品1/17/202420各類層析的原理和載體類別別離原理基質(zhì)或載體吸附層析化學(xué)、物理吸附硅膠、氧化鋁、羥基磷酸分配層析兩溶劑相中的溶解效應(yīng)纖維素、硅藻土、硅膠凝膠層析分子篩效應(yīng)的排阻效應(yīng)sepharose、sephadex離子交換層析離子基團(tuán)的交換反響離子交換樹脂、纖維素、葡聚糖親和層析別離物與配體之間有帶配基的sepharose特殊親和力或sephadex聚焦層析等電點和離子交換作用多緩沖交換劑〔與帶有多種電荷基團(tuán)的配體相偶聯(lián)的sepharose6B〕1/17/202421原理：以吸附劑作為固定相，選擇適當(dāng)?shù)娜軇┳髁鲃酉?。由于各種物質(zhì)的極性不同，被吸附劑吸附的程度和在流動相中的溶解度不同。層析時，當(dāng)流動相從固定相上流過時，各組分也就不同程度地被溶解〔解吸〕，然后又再被吸附、再溶解再吸附，從而以不同速度隨流動相向前移動。吸附層析〔absorptionchromatography〕1/17/202422吸附層析根據(jù)操作方式的不同，分為柱層析和薄層層析兩種填充物分部收集玻璃柱洗脫液樣品1/17/2024231/17/2024241/17/202425載體：硅膠氧化鋁羥基磷灰石應(yīng)用：別離純化蛋白質(zhì)、酶、氨基酸、核苷酸等生化物質(zhì)1/17/202426原理：分配層析是利用混合物(樣品)在二種或二種以上的不同溶劑中的分配系數(shù)不同而使物質(zhì)別離的方法分配層析實際上是一種連續(xù)抽提方式。如紙層析中濾紙的結(jié)合水為固定相，以水飽和的有機溶劑為流動相〔展開劑〕。分配層析(p148)1/17/202427物質(zhì)在紙上移動的速度可以用Rf表示：色斑中心至原點中心的距離Rf=──────────────溶劑前緣至原點中心的距離載體：纖維素硅藻土硅膠應(yīng)用：各種生化物質(zhì)的別離鑒定1/17/202428凝膠層析〔gelfiltration〕又稱為凝膠排阻層析〔gelexclusionchromatography〕、分子篩層析〔molecularsievechromatography〕、凝膠過濾〔gelfiltration〕、凝膠滲透層析〔gelpermeationchromatography〕等。1/17/202429原理p303凝膠層析是依據(jù)分子大小這一物理性質(zhì)進(jìn)行別離純化的。凝膠層析的固定相是惰性的珠狀凝膠顆粒，凝膠顆粒的內(nèi)部具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，形成很多孔穴。當(dāng)含有不同分子大小的組分的樣品進(jìn)入凝膠層析柱后，各個組分就向固定相的孔穴內(nèi)擴(kuò)散，組分的擴(kuò)散程度取決于孔穴的大小和組分分子大小。1/17/202430載體葡聚糖凝膠〔sephadex〕瓊脂糖凝膠〔sepharose〕應(yīng)用:測定分子量脫鹽和濃縮別離提純生物大分子除去熱原物質(zhì)1/17/202431離子交換層析〔ion-changechromatography〕原理離子交換層析是依據(jù)各種離子或離子化合物與離子交換劑的結(jié)合力不同而進(jìn)行別離純化的。離子交換層析的固定相是離子交換劑，它是由一類不溶于水的惰性高分子聚合物基質(zhì)通過一定的化學(xué)反響共價結(jié)合上某種電荷基團(tuán)形成的。1/17/202432分類：根據(jù)交換劑上吸附的離子交換基團(tuán)不同，陽離子交換劑;陰離子交換劑；按其解離度的大小，分為強、中強、弱三種：

1/17/202433磷酸基團(tuán)〔PO3H2〕和亞磷酸基團(tuán)〔PO2H〕結(jié)合磺酸基團(tuán)〔SO3H〕弱酸型

強酸型中等酸型結(jié)合酚羥基〔OH〕或羧基〔COOH〕弱堿型

強堿型中等堿型二乙基氨基乙基〔DEAE〕離子交換層析分類陰離子交換劑陽離子交換劑1/17/202434離子交換劑可以分為三局部：(高分子聚合物)基質(zhì)、電荷基團(tuán)和平衡離子1/17/2024351/17/202436交換過程2.吸附階段：樣品與反離子進(jìn)行交換3、4.解吸附階段：用梯度緩沖溶液洗脫，先洗下弱吸附物質(zhì)，后洗下強吸附物質(zhì)5.再生階段：用原始平衡液進(jìn)行充分洗滌，既可重復(fù)使用12345原始緩沖溶液的反離子樣品溶液梯度濃度1.平衡階段:離子交換劑與反離子結(jié)合1/17/2024371/17/2024381/17/2024391/17/2024401/17/202441應(yīng)用

制備、純化生物物質(zhì)定量、定性測定混合物中各組分1/17/202442氨基酸分析儀圖解緩沖液泵顯色反應(yīng)管茚三酮泵已分開的氨基酸離子交換柱樣品注入口記錄儀光電倍增管光源1/17/202443原理欲別離的大分產(chǎn)物質(zhì)S和相對應(yīng)的專一物質(zhì)L(配體)以次級鍵結(jié)合，能生成一種可解離的絡(luò)合物L(fēng)—S。其中的L又能與活化的基質(zhì)M以共價鍵首先結(jié)合，而形成M—L—S復(fù)合物。根據(jù)L—S之間能可逆地結(jié)合與解離的原理開展起來的層橋方法稱為親和層析法。親和層析〔affiuitychromatography〕

1/17/202444+待純化分子配體a.待純化分子和配體間具有親和性+基質(zhì)b.活性基質(zhì)與配體結(jié)合產(chǎn)生親和吸附劑++雜質(zhì)c.待純化分子與親和吸附劑結(jié)合，與雜質(zhì)分離+d.偶聯(lián)復(fù)合物經(jīng)解離后，得到純的待純化分子配體L基質(zhì)M待別離物質(zhì)SL-S復(fù)合物1/17/2024451/17/202446應(yīng)用別離純化酶、抗原、抗體別離純化核酸研究酶的結(jié)構(gòu)與功能1/17/202447聚焦層析〔Chromatofocusing〕該法是在等電點聚焦方法根底上開展起來的，其別離純化蛋白質(zhì)的依據(jù)是等電點的差異和離子交換行為。蛋白質(zhì)按其等電點在pH梯度環(huán)境中進(jìn)行排列的過程叫做聚焦效應(yīng)。原理1/17/202448pH梯度的形成(由多緩沖劑和多緩沖交換劑形成)是聚焦效應(yīng)的先決條件，如果一種蛋白質(zhì)加到已形成pH梯度的層析柱上時，由于洗脫液的連續(xù)流動，蛋白質(zhì)將迅速地遷移到與它等電點相同的pH處。從此位置開始，該蛋白質(zhì)將以緩慢的速度進(jìn)行吸附、解吸附，直到在等電點pH時被洗出。在聚焦層析過程中，一種樣品分次參加時，只要先參加者尚未洗出，并且有一定的時間進(jìn)行聚焦，剩余樣品還可以加到柱上，其聚焦過程都能順利完成。1/17/2024491、pH梯度的形成2、蛋白質(zhì)行為3、聚焦效應(yīng)1/17/202450層析時的聚焦效應(yīng)示意圖pH梯度溶液的形成示意圖蛋白質(zhì)1（pI=7）蛋白質(zhì)2（pI=8）流速移動速率1/17/202451幾種主要層析方法比較1/17/2024521/17/202453電泳的一般原理

電泳是帶電顆粒在電場作用下向著與其電荷相反的電極移動的現(xiàn)象。許多生物分子都帶有電荷，其電荷的多少取決于分子組成、性質(zhì)及其所在介質(zhì)的pH。如果混合物中各組分的結(jié)構(gòu)組成不同，在某一pH溶液中，各組分所帶電荷性質(zhì)、電荷數(shù)量不同，加之其分子量不同，在同一電場的作用下，各組分泳動的方向和速度也各異，而到達(dá)別離鑒定各組分的目的。1/17/202454電泳分類1/17/2024551/17/202456〔三〕按支持介質(zhì)形狀不同1.薄層電泳；

2.板電泳；

3.柱電泳?！菜摹嘲从猛静煌煞譃椋?/p>

1.分析電泳；2.制備電泳；

3.定量免疫電泳；1/17/2024571/17/202458

紙電泳

薄膜電泳

凝膠電泳

毛細(xì)管電泳1/17/202459毛細(xì)管電泳1/17/202460三、影響電泳的因素〔一〕帶電顆粒的物理性狀〔二〕支持物介質(zhì)：〔三〕緩沖溶液(pH離子強度)〔四〕電場強度：〔五〕電滲現(xiàn)象：〔六〕焦耳熱對電泳的影響1/17/202461I=1／2ΣCZ2(式中：I為離子強度，C為離子的摩爾濃度，Z為離子的價數(shù))。1/17/2024621/17/2024631/17/202464凝膠聚合反響及催化系統(tǒng)不連續(xù)PAGE可產(chǎn)生的三種效應(yīng)：電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)、濃縮效應(yīng)1/17/2024651/17/202466光聚合催化劑是核黃素，核黃素在光照下能夠產(chǎn)生自由基，催化聚合反響。聚合方式1/17/202467SOeSOSO282424----·+?+RMMRMM··+?RMRM··+?RMMMRMMM··+?1/17/202468

1/17/202469不連續(xù)表現(xiàn)：緩沖液及凝膠pH不連續(xù)凝膠孔徑不連續(xù)電位梯度不連續(xù)1/17/202470⊕–電極緩沖液pH8.3

Tris-Gly

別離膠pH：8.9Tris-HCl電極緩沖液pH8.3Tris-Gly

濃縮膠pH：6.7Tris-HCl

樣品

1/17/2024711/17/2024721/17/202473SDS

原理：當(dāng)SDS〔SodiumDodecylSulfate〕與蛋白質(zhì)結(jié)合后，蛋白質(zhì)分子即帶有大量的負(fù)電荷，并遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了其原來的電荷，從而使天然蛋白質(zhì)分子間的電荷差異就降低乃至消除了。與此同時蛋白質(zhì)在SDS的作用下結(jié)構(gòu)變得松散，形狀趨向一致，所以各種SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物在電泳時產(chǎn)生的泳動率差異，就反映了分子量的差異。在此條件下，樣品分子量的對數(shù)與其在凝膠中的遷移率呈直線關(guān)系?？捎孟率奖硎荆篖ogM=a–b應(yīng)用:測定蛋白質(zhì)分子量測定蛋白質(zhì)亞基數(shù)1/17/202474SDSseparatesproteinsbyMW1/17/2024751/17/2024761/17/2024771/17/202478等電點聚焦〔isoelectricfocusing〕

原理:在一定抗對流介質(zhì)〔如凝膠〕中參加兩性電解質(zhì)載體(Ampholyte,是一種多氨基多羧基的混合物，由異構(gòu)物和同系物組成，其pK和pI值各自相異卻又相近〕，當(dāng)直流電通過時，便形成一個由陽極到陰極pH值逐步上升的梯度。兩性化合物在此電泳過程中，就被濃集在與其等電點相等的pH區(qū)域，從而使不同化合物能按其各自等電點得到別離。應(yīng)用：高效率別離純化蛋白質(zhì)測定蛋白質(zhì)分子量1/17/2024791/17/202480等電聚焦電泳法測定蛋白質(zhì)pI1/17/2024811/17/202482毛細(xì)管電泳毛細(xì)管電泳又稱毛細(xì)管區(qū)帶電泳，它是在毛細(xì)管〔2-75μm〕中裝入緩沖液，從其一端注入樣品，在毛細(xì)管兩端加高壓直流電實現(xiàn)對樣品的別離，別離后的樣品依次通過設(shè)在毛細(xì)管一端的檢測器檢出。該法克服了傳統(tǒng)區(qū)帶電泳的熱擴(kuò)散和樣品擴(kuò)散的問題，實現(xiàn)了快速和高效別離。1/17/202483毛細(xì)管電泳裝置示意圖高壓電源光源光電倍增管數(shù)據(jù)采集毛細(xì)管緩沖液-樣品緩沖液1/17/202484離心原理離心機分類離心根本方法1/17/202485原理：離心法是利用離心機產(chǎn)生的強大離心力來別離具有不同沉降系數(shù)的物質(zhì)。沉降系數(shù)〔S〕概念1/17/202486沉降系數(shù)〔S〕

生物大分子在單位離心力場作用下的沉降速度稱為沉降系數(shù)。即沉降系數(shù)是微顆粒在離心力場的作用下，從靜止?fàn)顟B(tài)到達(dá)極限速度所需要的時間。其單位用Svedberg，即S表示，S=1×10-13秒。

沉降系數(shù)〔S〕與分子量〔M〕的關(guān)系M=RTSD(1-

)Svederg方程:1/17/202487沉降系數(shù)〔S〕

生物大分子在單位離心力場作用下的沉降速度稱為沉降系數(shù)。即沉降系數(shù)是微顆粒在離心力場的作用下，從靜止?fàn)顟B(tài)到達(dá)極限速度所需要的時間。其單位用Svedberg，即S表示，S=1×10-13秒。

沉降系數(shù)〔S〕與分子量〔M〕的關(guān)系M=RTSD(1-

)Svederg方程:1/17/202488分析性離心機制備性離心機工業(yè)用離心機實驗用離心機按用途普通離心機<6000rpm高速冷凍離心機20000～25000rpm超速離心機50000～80000〔大于30000〕rpm工業(yè)用離心機實驗用離心機1/17/202489組成：主機、轉(zhuǎn)頭和離心管1/17/202490離心根本方法沉淀離心：差速沉降離心法：密度梯度區(qū)帶離心法：差速區(qū)帶離心法等密度區(qū)帶離心法1/17/202491沉淀離心(pelletingcentrifugation)一般是指介質(zhì)密度約為1g/ml，選用一種離心速度，使懸浮溶液中的懸浮顆粒在離心力的作用下完全沉淀下來，這種離心方式稱為沉降離心。主要適宜于細(xì)菌等微生物、細(xì)胞和細(xì)胞器等生物材料(密度在1.08～1.12g/ml左右)及病毒和染色體DNA(密度在1.18～1.31g/ml左右)等的離心別離。沉降離心與離心力和顆粒大小有關(guān)1/17/202492差速沉降離心：采用逐漸增加離心速度或低速和高速交替進(jìn)行離心，使沉降速度不同的顆粒，在不同的離心速度及不同離心時間下分批別離的方法。此法一般用于別離沉降系數(shù)相差較大的顆粒。1/17/202493密度梯度區(qū)帶離心法〔簡稱區(qū)帶離心法〕：區(qū)帶離心法是將樣品加在惰性梯度介質(zhì)中進(jìn)行離心沉降或沉降平衡，在一定的離心力下把顆粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同區(qū)帶的別離方法。此法的優(yōu)點是：①別離效果好，可一次獲得較純顆粒；②適應(yīng)范圍廣，能象差速離心法一樣別離具有沉降系數(shù)差的顆粒，又能別離有一定浮力密度差的顆粒；圖2-11速率區(qū)帶離心示意圖驟③顆粒不會擠壓變形，能保持顆?；钚?，并防止已形成的區(qū)帶由于對流而引起混合。此法的缺點是：①離心時間較長；②需要制備惰性梯度介質(zhì)溶液；③操作嚴(yán)格，不易掌握。1/17/202494當(dāng)不同的顆粒間存在沉降速度差時〔不需要像差速沉降離心法所要求的那樣大的沉降系數(shù)差〕。在一定的離心力作用下，顆粒各自以一