生物化學(xué)-第十二章　DNA復(fù)制

第十章DNA的復(fù)制和修復(fù)第一節(jié)半保存復(fù)制第二節(jié)參與DNA復(fù)制的酶與蛋白質(zhì)第三節(jié)復(fù)制過(guò)程第四節(jié)DNA損傷及修復(fù)一、概念以親代DNA雙鏈為模板以堿基互補(bǔ)方式合成子代DNA，這樣新形成的子代DNA中，一條鏈來(lái)自親代DNA，而另一條鏈那么是新合成的，這種復(fù)制方式叫半保存復(fù)制。

幾個(gè)相關(guān)概念：

1.復(fù)制起始點(diǎn)

(origin,ori)

原核生物只有一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)； 真核生物染色體DNA有多個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)，同時(shí)形成多個(gè)復(fù)制單位，兩個(gè)起始點(diǎn)之間的DNA片段稱(chēng)為復(fù)制子(replicon)。

復(fù)制子

2.復(fù)制叉(replicationfork) 復(fù)制時(shí)雙鏈翻開(kāi)，分開(kāi)成兩股，新鏈沿 著張開(kāi)的模板生成，復(fù)制中形成的這種Y 字形的結(jié)構(gòu)稱(chēng)為復(fù)制叉。二、實(shí)驗(yàn)依據(jù)三、DNA復(fù)制的起點(diǎn)和方向環(huán)狀

DNA復(fù)制時(shí)所形成的Q結(jié)構(gòu)起始點(diǎn)復(fù)制叉的推進(jìn)復(fù)制叉起始點(diǎn)起始點(diǎn)起始點(diǎn)復(fù)制叉復(fù)制叉未復(fù)制DNA單向復(fù)制雙向復(fù)制復(fù)制中的大腸桿菌染色體放射自顯影圖

(Caims實(shí)驗(yàn))

ABC環(huán)狀DNA的復(fù)制

ABC四、復(fù)制特點(diǎn)半不連續(xù)復(fù)制半保存復(fù)制DNA的半不連續(xù)復(fù)制復(fù)制過(guò)程復(fù)制叉的移動(dòng)方向解旋酶DNA聚合酶III解鏈酶RNA引物引發(fā)體DNA聚合酶ISSB3′3′5′前導(dǎo)鏈隨后鏈3′5′復(fù)制的起始DNA鏈的延長(zhǎng)DNA鏈終止5′RNA引物3′3′復(fù)制特點(diǎn)

第二節(jié)參與DNA復(fù)制的酶與蛋白質(zhì)★

復(fù)制相關(guān)蛋白的基因：dnaA、dnaB、dnaC……dnaX 相應(yīng)的表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)：DnaA、DnaB、DnaC……DnaX DnaA：識(shí)別復(fù)制起始位點(diǎn) DnaB：解螺旋酶 DnaC：輔助解螺旋酶使其在起始點(diǎn)上 結(jié)合并翻開(kāi)雙鏈。一、DNA聚合酶★〔一〕催化的反響特點(diǎn)★以四種dNTP為原料需要模板需要引物催化反響方向?yàn)?’-3’產(chǎn)物性質(zhì)與模板鏈相同〔二〕大腸桿菌三種DNA聚合酶比較DNA聚合酶Ⅱ分子量每個(gè)細(xì)胞的分子統(tǒng)計(jì)數(shù)5′-3′聚合酶作用3′-5′核酸外切酶作用5′-3′核酸外切酶作用轉(zhuǎn)化率DNA聚合酶Ⅰ109，000400+++1120，000100++-0.05400，00010-20++-50比較工程DNA聚合酶

切除引物修復(fù)修復(fù)復(fù)制功能1999年發(fā)現(xiàn)聚合酶和，它們涉及DNA的錯(cuò)誤傾向修復(fù)〔erroounerepair〕DNA聚合酶I〔1〕53聚合酶功能〔但持續(xù)合成DNA的能力差〕；〔2〕35’外切酶活性〔在正常聚合條件下，此活性不能作用于生長(zhǎng)鏈，只作用于生長(zhǎng)中不配對(duì)的單鏈，校對(duì)功能?！?；〔3〕還具有53’外切酶活性〔雙鏈有效〕；5

3

聚合酶功能

(dNMP)n+dNTP→(dNMP)n+1+PPi

聚合反響機(jī)理：DNA聚合酶的3′-5′外切酶水解位點(diǎn)3′5′3′-5′核酸外切酶水解位點(diǎn)DNA聚合酶3′-5′外切酶活力切除引物、切除突變的片段DNA聚合酶5′-3′外切酶活力

5′-3′核酸外切酶水解位點(diǎn)單鏈缺口5′切除錯(cuò)配的核苷酸

DNA-polI:曾被稱(chēng)為復(fù)制酶(replicase)含量最多可被水解成兩個(gè)片段小片段(N端)：具有5′→3′外切酶活性；大片段(C端)：具有聚合活性和3′→5′

外切酶活性，也稱(chēng)為Klenow片段，是常用的工具酶。

DNA-polIII:由10種亞基組成的不對(duì)稱(chēng)聚合體催化效率最高大腸桿菌DNA聚合酶Ⅲ全酶的結(jié)構(gòu)和功能

延長(zhǎng)因子DNA聚合酶Ⅲ兩個(gè)亞基夾住DNADNA聚合酶Ⅲ異二聚體核心酶校對(duì)引物的結(jié)合和識(shí)別促使核心酶二聚化亞基相對(duì)分子量亞基數(shù)目基因亞基功能αεθτγδδ’χΨβ1320002700010000710005200035000330001500012000370002222211114dnaEdnaQholEdnaXdadX＊holAholBholCholDdnaN聚合作用3’→5’外切酶的校對(duì)功能組建核心酶使核心酶二聚化依賴(lài)DNA的ATP酶，形成γ復(fù)合物與β亞基結(jié)合，形成γ復(fù)合物形成γ復(fù)合物形成γ復(fù)合物形成γ復(fù)合物兩個(gè)β亞基形成滑動(dòng)夾子，以提高酶的持續(xù)合成能力DNA聚合酶Ⅲ全酶的亞基組成ArthurKornberg1918

StanfordUniversity

Stanford,CA,USA

TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1959"fortheirdiscoveryofthemechanismsinthebiologicalsynthesisofribonucleicacidanddeoxyribonucleicacid"二、解旋酶〔解超螺旋，也叫拓?fù)洚悩?gòu)酶、DnaB蛋白〕拓?fù)洚悩?gòu)酶：

催化DNA的拓?fù)溥B環(huán)數(shù)發(fā)生變化的酶，在DNA重組修復(fù)和其它轉(zhuǎn)變方面起重要作用。拓?fù)洚悩?gòu)酶?：使DNA一條鏈發(fā)生斷裂和再連接。作用是松解負(fù)超螺旋，反響不需要能量。主要集中在活性轉(zhuǎn)錄區(qū)，同轉(zhuǎn)錄有關(guān)。拓?fù)洚悩?gòu)酶Π：使DNA兩條鏈發(fā)生斷裂和再連接。當(dāng)引入負(fù)超螺旋時(shí)需要由ATP提供能量，同復(fù)制有關(guān)。DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)〔原核〕二級(jí)結(jié)構(gòu)為閉環(huán)雙螺旋；三級(jí)結(jié)構(gòu)為超螺旋①連環(huán)數(shù)〔linkingnumber,L〕DNA雙螺旋中，一條鏈以右手螺旋繞另一條鏈纏繞的次數(shù)②扭轉(zhuǎn)數(shù)〔twistingnumber,T〕DNA分子中的Watson-Crick螺旋數(shù)目，以T表示③超螺旋數(shù)〔纏繞數(shù),writhingnumber,W〕連環(huán)數(shù)（L）纏繞數(shù)（T）扭曲數(shù)W松馳環(huán)25250解鏈環(huán)23230超螺旋2325-2L=T+W三、解鏈酶〔DnaA蛋白〕四、SSB五、引物酶六、DNA連接酶解螺旋/鏈酶(helicase)〔DnaA蛋白〕: 模板對(duì)復(fù)制的指導(dǎo)作用在于堿基的準(zhǔn)確 配對(duì)，而堿基卻埋在雙螺旋的內(nèi)部。只有把DNA解開(kāi)成單鏈，它才能起模板作用。 解螺旋酶是最早發(fā)現(xiàn)的與復(fù)制有關(guān)的蛋白質(zhì)，當(dāng)時(shí)稱(chēng)為rep蛋白。作用是利用ATP供能，解開(kāi)DNA雙鏈。四、SSBSSB曾被稱(chēng)為螺旋反穩(wěn)定蛋白〔HDP〕。SSB與解開(kāi)的DNA單鏈緊密結(jié)合，防止重新形成雙鏈，并免受核酸酶降解。在復(fù)制中維持模板處于單鏈狀態(tài)。引物酶(primase):

依賴(lài)DNA的RNA聚合酶。

催化RNA引物的合成。

在大腸桿菌，引物酶是dnaG基因的產(chǎn)物。RNA引物：在DNA模板的復(fù)制起始部位由引物酶催化NTP的聚合，形成短片段的RNA，為DNA

聚合提供3′-OH末端。連接酶連接切口Mg2+連接酶ATP或NAD＋AMP+PPi或NMN+AMPATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPPOHTGGATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPTGGP缺口3'3'5'5'5'5'3'3'模板鏈模板鏈大腸桿菌和其它細(xì)菌的DNA連接酶要求NAD+提供能量；在高等生物和噬菌體中，那么要求ATP提供能量。DNA連接酶在DNA復(fù)制、損傷修復(fù)、重組等過(guò)程中起重要作用。第三節(jié)復(fù)制過(guò)程一、復(fù)制起始二、鏈的延長(zhǎng)〔岡崎片段的合成〕三、復(fù)制的終止

一、復(fù)制起始1、拓?fù)洚悩?gòu)酶解開(kāi)超螺旋。2、DnaA蛋白識(shí)別并在ATP存在下結(jié)合于四個(gè)9bp的重復(fù)序列。3、在類(lèi)組蛋白〔HU、ATP參與下,DanA蛋白變性13個(gè)bp的重復(fù)序列,形成開(kāi)鏈復(fù)合物。4、DnaB借助于水解ATP產(chǎn)生的能量在DnaC的幫助下沿5’→3’方向移動(dòng)，解開(kāi)DNA雙鏈，形成前引發(fā)復(fù)合物。5、單鏈結(jié)合蛋白結(jié)合于單鏈。6、引物合成酶〔DnaG蛋白〕開(kāi)始合成RNA引物。起始復(fù)合物前引發(fā)復(fù)合物開(kāi)鏈復(fù)合物引發(fā)體(primosome):

是由DnaB、DnaA、DnaC以及其他復(fù)制因子一起形成復(fù)合體，再結(jié)合引物酶形成較大的聚合體，結(jié)合到模板DNA上。二、鏈的延長(zhǎng)〔岡崎片段的合成〕

真核生物的岡崎片段為：100-200bp

原核生物的岡崎片段為：1000-2000bp岡崎片段引物的切除、缺口的填補(bǔ)和切口的連接:引導(dǎo)鏈與隨從鏈分別由哪些酶或蛋白參與？三、復(fù)制的終止oric復(fù)制叉2復(fù)制叉1終止復(fù)制叉2終止復(fù)制叉1復(fù)制叉1復(fù)制叉2完成復(fù)制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶

連鎖染色體DNA忠實(shí)性的保障1、堿基的配對(duì)規(guī)律：摸板鏈與新生鏈之間的堿基配對(duì)保證堿基配錯(cuò)幾率約為1/104～1/105。2、DNA聚合酶的3’→5’外切酶活性的校對(duì)功能，使堿基的錯(cuò)配幾率又降低100～1000倍。3、復(fù)制中的即時(shí)校讀功能。真核細(xì)胞內(nèi)有五種DNA聚合酶DNA聚合酶αDNA聚合酶β

DNA聚合酶γ

DNA聚合酶δDNA聚合酶ε定位亞基數(shù)目外切酶活性引物合成酶活性持續(xù)合成能力抑制劑功能細(xì)胞核4－＋中等蚜腸霉素引物合成細(xì)胞核1－－低雙脫氧TTP修復(fù)線(xiàn)粒體23’→5’外切酶－高雙脫氧TTP線(xiàn)粒體DNA合成細(xì)胞核23’→5’外切酶－有PCNA時(shí)高蚜腸霉素核DNA合成細(xì)胞核＞15’→3’外切酶－高蚜腸霉素修復(fù)真核和原核DNA細(xì)胞復(fù)制比較真核細(xì)胞DNA復(fù)制的特點(diǎn)

多個(gè)起點(diǎn)復(fù)制起點(diǎn)起點(diǎn)起點(diǎn)起點(diǎn)起點(diǎn)起點(diǎn)端粒酶〔telomerase〕初步研究說(shuō)明，人體中生殖細(xì)胞的端粒長(zhǎng)度保持不變，而體細(xì)胞的端粒長(zhǎng)度那么隨個(gè)體的老化而逐步縮短。對(duì)此的一個(gè)推論是：人的生殖細(xì)胞具端粒酶的活力，體細(xì)胞那么否。這一問(wèn)題的解決無(wú)疑會(huì)有助于對(duì)生命衰老的認(rèn)識(shí)。5′3′AAAACCCCAAAACCCCCCA端粒酶特點(diǎn)：

1.由RNA和蛋白質(zhì)構(gòu)成的復(fù)合物

2.為特殊的逆轉(zhuǎn)錄酶，能以自身的RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成端粒DNA功能： 合成端粒DNA，維持端粒的長(zhǎng)度

爬行模型：端粒合成的一種模型3′5′TTTTGGGGTTTTG5′3′AAAACCCCAAAACCCCCCAAA3′5′TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTG5′3′AAAACCCCAAAACCCCCCAAATTGGGTGGGT3′5′AATTTTG5′3′AAAACCCCAAAACCCCCCAGTTTTG整合和雜交移位和再雜交端粒合成的完成TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGTTTT5′3′nAA3′TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGT5′3′TTCCCCTnAA3′TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGT5′3′TTAAAACCCCAAAACCCCAAAACCCCTn進(jìn)一步加工繼續(xù)延伸第四節(jié)DNA損傷及修復(fù)四、誘導(dǎo)修復(fù)〔SOS修復(fù)〕一、光修復(fù)二、切除修復(fù)三、重組修復(fù)

DNA紫外線(xiàn)損傷的光裂合酶修復(fù)1、形成嘧啶二聚體2、光復(fù)合酶結(jié)合于損傷部位3、酶被可見(jiàn)光激活4、修復(fù)后酶被釋放切除修復(fù)堿基喪失堿基缺陷或錯(cuò)配結(jié)構(gòu)缺陷切開(kāi)核酸內(nèi)切酶核酸外切酶