大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備與轉(zhuǎn)化課件

實驗四、大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備與轉(zhuǎn)化【實驗?zāi)康摹繉W(xué)習(xí)CaCl2法制備大腸桿菌感受態(tài)細胞的原理與技術(shù)。學(xué)習(xí)大腸桿菌轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)。大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備與轉(zhuǎn)化【實驗原理】在自然條件下,很多質(zhì)粒都可通過細菌接合作用轉(zhuǎn)移到新的宿主內(nèi),但在人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體中,一般缺乏此種轉(zhuǎn)移所必需的mob基因,因此不能自行完成從一個細胞到另一個細胞的接合轉(zhuǎn)移。如需將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移進受體細菌，需誘導(dǎo)受體細菌產(chǎn)生一種短暫的感受態(tài)以攝取外源DNA。受體細胞經(jīng)過一些特殊方法(如電擊法,CaCl2等化學(xué)試劑法)的處理后,細胞膜的通透性發(fā)生了暫時性的改變,成為能允許外源DNA分子進入的感受態(tài)細胞(Compenentcells)。大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備與轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化(Transformation)是將外源DNA分子引入受體細胞,使之獲得新的遺傳性狀的一種手段,它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域的基本實驗技術(shù)。其原理是細菌處于0℃的CaCl2低滲溶液中，菌細胞膨脹成球形。轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸復(fù)合物粘附于細菌表面，經(jīng)42℃短時間熱激處理，促進細胞吸收DNA復(fù)合物。進入受體細胞的DNA分子通過復(fù)制,表達實現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移,使受體細胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備與轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化過程所用的受體細胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變體(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子進入體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給后代。將經(jīng)過轉(zhuǎn)化后的細胞在篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)，即可篩選出轉(zhuǎn)化子(Transformant，即帶有異源DNA分子的受體細胞)。CaCl2法是目前常用的感受態(tài)細胞制備方法，簡便易行,且其轉(zhuǎn)化效率完全可以滿足一般實驗的要求,制備出的感受態(tài)細胞暫時不用時,可加入占總體積15％的無菌甘油于-70℃保存(半年)。大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備與轉(zhuǎn)化本實驗以E.coliDH5a菌株為受體細胞,并用CaCl2處理,使其處于感受態(tài),然后與pUCm-T質(zhì)粒（T-載體）共保溫，實現(xiàn)轉(zhuǎn)化。由于pUCm-T質(zhì)粒帶有氨芐青霉素抗性基因(Ampr)，可通過Amp抗性來篩選轉(zhuǎn)化子。如受體細胞沒有轉(zhuǎn)入pUCm-T，則在含Amp的培養(yǎng)基上不能生長。能在Amp培養(yǎng)基上生長的受體細胞（轉(zhuǎn)化子）肯定已導(dǎo)入了pUCmT。轉(zhuǎn)化子擴增后，可將轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒提取出，進行電泳、酶切等進一步鑒定。大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備與轉(zhuǎn)化【設(shè)備、材料與試劑】一、設(shè)備

恒溫搖床，電熱恒溫培養(yǎng)箱，臺式高速離心機，無菌工作臺，低溫冰箱，恒溫水浴鍋，制冰機，分光光度計，微量移液槍。二、材料

E.coliDH5α菌株:Rˉ,Mˉ,Ampˉ；pUCmT質(zhì)粒DNA:購自上海生工生物工程有限公司。大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備與轉(zhuǎn)化三、試劑

1.LB固體和液體培養(yǎng)基

2.Amp母液

3.含Amp的LB固體培養(yǎng)基

4.SOC液體培養(yǎng)基

5.0.1mol/LCaCl2溶液大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備與轉(zhuǎn)化【實驗步驟】一、受體菌的培養(yǎng)

從LB平板上挑取新活化的E.coliDH5α單菌落,接種于20mlLB液體培養(yǎng)基中,37℃下振蕩培養(yǎng)12小時左右,直至對數(shù)生長后期。將該菌懸液以1:100-1:50的比例接種于100mlLB液體培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng)1-2小時至OD600＝0.5左右。大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備與轉(zhuǎn)化二、感受態(tài)細胞的制備(CaCl2法)

1、將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入離心管中,冰上放置10-30分鐘，然后于4℃下5000rpm離心10分鐘。

2、棄上清，用預(yù)冷的0.1mol/L的CaCl2溶液30ml輕輕懸浮細胞，冰上放置10分鐘后，4℃下5000rpm離心10分鐘，棄去上清。

3、每50ml初始培養(yǎng)物用200μl預(yù)冷的0.1mol/L的CaCl2溶液重懸每份細胞沉淀，冰上放置幾分鐘，即成感受態(tài)細胞懸液。大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備與轉(zhuǎn)化三、轉(zhuǎn)化

1、取200μl感受態(tài)細胞懸液，轉(zhuǎn)移至無菌的微量離心管中，置冰上。

2、加入連接產(chǎn)物10μl，輕輕搖勻，冰上放置60分鐘。

3、42℃水浴中熱擊2分鐘，熱激后迅速置于冰上冷卻2分鐘。

4、向管中加入800μlSOC液體培養(yǎng)基(不含Amp)，混勻后37℃振蕩培養(yǎng)30分鐘，使細菌恢復(fù)正常生長狀態(tài)，并表達質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因(Ampr)。（其間可以將IPTG7μl和X-Gal40μl涂布于預(yù)制的Amp平板上）。大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備與轉(zhuǎn)化5、將上述菌液以3000rpm離心20秒，棄大部分上清，用剩余的100μl上清重懸菌體，涂布于含Amp的篩選平板上（已涂布IPTG7μl和X-Gal40μl），正面向上放置半小時,待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿，37℃培養(yǎng)16-24小時。

同時做兩個對照:

對照組1:以同體積的無菌雙蒸水代替DNA溶液,其它操作與上面相同。此組正常情況下在含抗生素的LB平板上應(yīng)沒有菌落出現(xiàn)。

對照組2:以同體積的無菌雙蒸水代替DNA溶液,但涂板時只取5μl菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此組正常情況下應(yīng)產(chǎn)生大量菌落。大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備與轉(zhuǎn)化附錄：LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨1％酵母提取物0.5％NaCl1％用NaOH調(diào)pH至7.0，定容至1L，滅菌。含Amp的LB固體培養(yǎng)基：將配好的LB固體培養(yǎng)基高壓滅菌后冷卻至60℃左右,加入Amp儲存液,使終濃度為50ug/ml,搖勻后鋪板。大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備與轉(zhuǎn)化【注意事項】

為了提高轉(zhuǎn)化效率,實驗中要考慮以下幾個重要因素：

1、細胞生長狀態(tài)和密度：最好從－70℃或-20℃甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細胞的菌液。細胞生長密度以剛進入對數(shù)生長期時為好，可通過監(jiān)測培養(yǎng)液的OD600來控制。DH5α菌株的OD600為0.5時,細胞密度在5×107個/ml左右(不同的菌株情況有所不同),這時比較合適。密度過高或不足均會影響轉(zhuǎn)化效率。大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備與轉(zhuǎn)化2、質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度:用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應(yīng)主要是超螺旋態(tài)DNA(cccDNA)。轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比,但當加入的外源DNA的量過多或體積過大時,轉(zhuǎn)化效率就會降低。1ng的cccDNA即可使50μl的感受態(tài)細胞達到飽和。一般情況下,DNA溶液的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細胞體積的5％。大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備與轉(zhuǎn)化3、試劑的質(zhì)量:所用的試劑,如CaCl2等均需是最高純度的(GR.或AR.),并用超純水配制,最好分裝保存于干燥的冷暗處。4、防止雜菌和雜DNA的污染：整個操作過程均應(yīng)在無菌條件下進行,所用器皿,如離心管,tip頭等最好是新的,并經(jīng)高壓滅菌處理,所有的試劑都要滅菌,且注意防止被其它試