二十一章基因重組技術(shù)

基因重組和基因工程

GeneticbinationandGeneticEngineering第21章第二節(jié)

重組DNA技術(shù)

又稱DNA克隆或分子克隆

DNAbinationTechniqueisalsoCalledDNACloningorMolecularCloneDNA研究史1865年G.Mendel的豌豆雜交實驗，提出遺傳因子概念，并總結(jié)出孟德爾遺傳定律。1868年Miescher.從膿細胞中提取“核素”1909年丹麥植物學(xué)家和遺傳學(xué)家約翰遜首次提出“基因”這一名詞，用以表達Mendel的遺傳因子概念。1944年O.TAvery等的肺炎球菌轉(zhuǎn)化實驗，說明DNA是遺傳物質(zhì)。

1953年Watson和Crick.發(fā)現(xiàn)DNA雙螺旋結(jié)

構(gòu)。具有劃時代的意義。DNA克隆、測序與重組技術(shù)的歷史近十幾年來，出現(xiàn)轉(zhuǎn)基因技術(shù)、基因剔除技

術(shù)、核轉(zhuǎn)移技術(shù)一、重組DNA技術(shù)相關(guān)概念克隆(clone):來自同一始祖的相同副本或拷貝(copy)的集合。獲取同一拷貝的過程稱為克隆化(cloning)，即無性繁殖。（一）DNA克隆技術(shù)水平：分子克隆(molecularclone)

（即DNA克?。?/p>

細胞克隆個體（組織）克隆（動物或植物）

應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來源的遺傳物質(zhì)（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）與載體DNA接合成一具有自我復(fù)制能力的DNA分子——復(fù)制子(replicon)，繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細胞，再進行擴增提取獲得大量同一DNA分子，也稱基因克隆或重組DNA(binantDNA)。DNA克隆

目的：①分離獲得某一感興趣的基因或DNA②獲得感興趣基因的表達產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）基因工程(geneticengineering)

——實現(xiàn)基因克隆所用的方法及相關(guān)的工作稱基因工程，又稱重組DNA工藝學(xué)（重組DNA

技術(shù)）。生物技術(shù)工程:

基因工程、蛋白質(zhì)工程、酶工程、細胞工程、組織工程等

理論基礎(chǔ)：①限制性核酸內(nèi)切酶（簡稱限制酶）

②基因載體（簡稱載體）

（二）工具酶

限制性核酸內(nèi)切酶

DNA聚合酶Ⅰ

逆轉(zhuǎn)錄酶

T4DNA連接酶堿性磷酸酶末端轉(zhuǎn)移酶

TaqDNA聚合酶限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease)

限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease,RE)是識別DNA的特異序列,并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ定義：與甲基化酶共同構(gòu)成細菌的限制－修飾系統(tǒng)，限制外源DNA，保護自身DNA。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技術(shù)中常用Ⅱ型）分類：作用：第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名：Hin

dⅢ

屬

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶Ⅱ類酶識別序列特點——

回文結(jié)構(gòu)(palindrome)

切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGGBamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口名稱識別序列及切割位點名稱識別序列及切割點切割后產(chǎn)生５’突出末端:BamHⅠ5’…G▼GATCC...3’BglⅡ

5’…A▼GATCT...3’EcoRⅠ

5’…G▼AATTC...3’HindⅢ

5’…A▼AGCTT...3’

HpaⅡ

5’…C▼CGG...3’

MboⅠ

5’…▼GATC...3’

NdeⅠ

5’…GA▼TATG...3’切割后產(chǎn)生3’突出末端:ApaⅠ

5’…GGGCC▼C...3’HaeⅡ

5’…PuGCGC▼Py...3’KpnⅠ

5’…GGTAC▼C...3’PstⅠ

5’…CTGCA▼G...3’SphⅠ

5’…GCATG▼C...3’切割后產(chǎn)生平末端:AluⅠ

5’…AG▼CT...3’EcoRⅤ

5’…GAT▼ATC...3’HaeⅢ

5’…GG▼CC...3’PvuⅡ

5’…CAG▼CTG...3’SmaⅠ

5’…CCC▼GGG...3’

限制性內(nèi)切核酸酶（三）基因載體

定義為攜帶目的基因，實現(xiàn)其無性繁殖或表達有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。

常用載體質(zhì)粒DNA噬菌體DNA病毒DNA克隆載體(cloningvector)為使插入的外源DNA序列被擴增而特意設(shè)計的載體稱為克隆載體。表達載體(expressionvector)為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計的載體稱為表達載體。載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)：能自主復(fù)制；具有兩個以上的遺傳標(biāo)記物，便于重組體的篩選和鑒定；有克隆位點（外源DNA插入點），常具有多個單一酶切位點，稱為多克隆位點；分子量小，以容納較大的外源DNA。質(zhì)粒

(plasmid)特點:能在宿主細胞內(nèi)獨立自主復(fù)制；帶有某些遺傳信息,會賦予宿主細胞一些遺傳性狀。

λ噬菌體DNA改造系統(tǒng)

λgt系列（插入型，適用cDNA克?。?/p>

EMBL系列（置換型，適用基因組克?。┦删w(phage)

M13噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含lacZ基因）

M13mp系列

pUC系列3.粘性質(zhì)粒(cosmid)

酵母人工染色體

(yeastartificialchromosome,YAC)

細菌人工染色體

(bacterialartificialchromosome,BAC)

動物病毒DNA改造的載體（如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）其他（四）目的基因(targetgene)

cDNA(complementaryDNA)

指經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成的、與RNA(通常指mRNA或病毒RNA)互補的單鏈DNA。以單鏈cDNA為模板、經(jīng)聚合反應(yīng)可合成雙鏈cDNA。

基因組DNA(genomicDNA)

指代表一個細胞或生物體整套遺傳信息(染色體及線粒體)的所有DNA序列。

二、重組DNA技術(shù)基本原理基本原理目的基因的獲取DNA導(dǎo)入受體細胞外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構(gòu)建重組體的篩選克隆基因的表達

（一）目的基因的獲取化學(xué)合成法基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)cDNA文庫(cDNAlibrary)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)（二）克隆載體的選擇和構(gòu)建目的不同，操作基因的性質(zhì)不同，載體的選擇和改建方法也不同。（三）外源基因與載體的連接方式：(1)同一限制酶切位點連接

(2)不同限制酶切位點連接配伍末端連接非配伍末端連接粘性末端連接平端連接

限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端粘端補齊或切平形成的平端適用于：在末端轉(zhuǎn)移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進行粘端連接。同聚物加尾連接由平端加上新的酶切位點，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進行粘端連接。

人工接頭(linker)連接受體菌條件：安全宿主菌限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)(competent)

導(dǎo)入方式：轉(zhuǎn)化(transformation)轉(zhuǎn)染(transfection)感染(infection)（四）重組DNA導(dǎo)入受體菌指將質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組子直接導(dǎo)入細菌細胞的過程。特指“將外源基因?qū)氩溉閯游锛毎囊幌盗屑夹g(shù)的通稱。如脂質(zhì)體包裹DNA轉(zhuǎn)染法、磷酸鈣轉(zhuǎn)染法、DEAE－葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法、電擊法。1.直接選擇法(1)抗藥性標(biāo)記選擇(2)標(biāo)志補救(markerrescue)(3)分子雜交法原位雜交Southern印跡2.免疫學(xué)方法如免疫化學(xué)方法及酶免檢測分析等（五）重組體的篩選重組DNA技術(shù)操作過程可形象歸納為：小結(jié)分分離目的基因切限制酶切目的基因與載體接拼接重組體

轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體細胞篩篩選重組體

重組DNA技術(shù)操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNA

cDNA人工合成PCR產(chǎn)物限制酶消化開環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定菌落原位雜交表達體系的建立：表達載體的構(gòu)建受體細胞的建立表達產(chǎn)物的分離純化（六）克隆基因的表達

標(biāo)準(zhǔn)：選擇標(biāo)志 強啟動子翻譯調(diào)控序列 多接頭克隆位點

E.coli表達體系的不足：不宜表達真核基因組DNA；不能加工表達的真核蛋白質(zhì)；表達的蛋白質(zhì)常形成不溶性包涵體(inclusionbody)

；很難表達大量可溶性蛋白。1.原核表達體系(E.coli表達體系最為常用)

優(yōu)點：可表達克隆的cDNA及真核基因組DNA

可適當(dāng)修飾表達的蛋白質(zhì)表達產(chǎn)物分區(qū)域積累缺點：操作技術(shù)難、費時、經(jīng)濟

轉(zhuǎn)染

——將表達載體導(dǎo)入真核細胞的過程方法：磷酸鈣轉(zhuǎn)染

DEAE葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染電穿孔脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染顯微注射2.真核表達體系（酵母、昆蟲、乳類動物細胞）第三節(jié)

重組DNA技術(shù)與醫(yī)學(xué)的關(guān)系非常密切并前景遠大DNAbinationTechniqueisCloslyRelatedwithMedicineandhasaGoodPerspective一、疾病基因的發(fā)現(xiàn)與克隆根據(jù)基因定位克隆之并研究其性質(zhì)，而認識疾病的分子機制。

疾病基因發(fā)現(xiàn)的兩個典型例子:脆性X綜合征Kallmann綜合征二、生物制藥利用基因工程生產(chǎn)有藥用價值的蛋白質(zhì)、多肽產(chǎn)品已成為當(dāng)今世界一項重大產(chǎn)業(yè)，并將有望成為21世紀(jì)的支柱產(chǎn)業(yè)。美國EliLilly公司于1982年首先利用重組DNA技術(shù)合成人胰島素并投放市場，標(biāo)志著生物工程藥物時代的開始。迄今為止，已有50多種基因工程藥物上市，近千種處于研發(fā)狀態(tài)，形成一個巨大的高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)，產(chǎn)生了不可估量的社會效益和經(jīng)濟效益。

重組DNA醫(yī)藥產(chǎn)品產(chǎn)品功能組織胞漿素原激活劑抗凝血液因子VIII促進凝血顆粒細胞-巨噬細胞集落剌激因子剌激白細胞生成促紅細胞生成素剌激白細胞生成生長因子(bFGF,EGF)刺激細胞生長與分化生長素治療侏儒癥胰島素治療糖尿病干擾素(

1b,

2a,

2b,

)抗病毒感染及某些腫瘤白細胞介素激活、剌激各類白細胞超氧化物歧化酶抗組織損傷單克隆抗體利用其結(jié)合特異性進行診斷試驗、腫瘤導(dǎo)向治療乙肝疫苗(CHO,酵母)預(yù)防乙肝