對(duì)電離輻射危害有輔助保護(hù)作用檢驗(yàn)方法

對(duì)電離輻射危害有輔助保護(hù)作用檢驗(yàn)方法1外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)1.1原理外周血白細(xì)胞數(shù)減少是一次性全身γ射線照射引起輻射損傷的表現(xiàn)之一，在一定范圍內(nèi)，照射劑量與外周血中白細(xì)胞數(shù)成反比，恢復(fù)時(shí)間與外周血中白細(xì)胞數(shù)成正比，外周血中白細(xì)胞數(shù)可代表血液系統(tǒng)受損的狀況。1.2儀器和試劑20μL定量取血管、血球計(jì)數(shù)板、顯微鏡、1%鹽酸等。1.3實(shí)驗(yàn)方法1.3.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：小鼠，18－22g，單一性別，每組10－15只。1.3.2劑量分組及受試樣品給予時(shí)間實(shí)驗(yàn)設(shè)三個(gè)劑量組和一個(gè)輻射模型對(duì)照組，以人體推薦量的10倍為其中的一個(gè)劑量組，另設(shè)二個(gè)劑量組，必要時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組。受試樣品于照射前給予14－30天，照射后仍然給予受試物，必要時(shí)可延長(zhǎng)至451.3.3實(shí)驗(yàn)步驟受試樣品組于照射前后經(jīng)口連續(xù)給予受試樣品，劑量組與輻射模型對(duì)照組均以同一劑量γ射線全身照射一次，照射劑量宜選擇3Gy－5Gy。分別于照射前、照射后第3天、照射后第14天三次采末梢血20μL，加入0.38mL1%鹽酸中，混勻后，加入血球計(jì)數(shù)板中，計(jì)算計(jì)數(shù)池中四個(gè)大方格中白細(xì)胞總數(shù)。白細(xì)胞數(shù)（109/L）=四個(gè)大方格白細(xì)胞總數(shù)×稀釋倍數(shù)×1071.4數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定白細(xì)胞數(shù)為計(jì)量資料，采用方差分析，但需按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊，計(jì)算F值，F(xiàn)值<F0.05，結(jié)論：各組均數(shù)間差異無(wú)顯著性；F值≥F0.05，P≤0.05，用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；對(duì)非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。照射前的外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)，用于各組間白細(xì)胞數(shù)目的均衡性檢驗(yàn)，劑量組與輻射模型對(duì)照組比較，差異無(wú)顯著性，再進(jìn)行照射及后續(xù)實(shí)驗(yàn)。照射后3天輻射模型對(duì)照組的白細(xì)胞數(shù)分別與照射前進(jìn)行自身比較，差異有顯著性，則判定輻射損傷模型成立；任一時(shí)間點(diǎn)、任一劑量組與輻射模型對(duì)照組比較，白細(xì)胞總數(shù)增多，差異有顯著性，則可判定該實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性。2．骨髓細(xì)胞DNA含量或骨髓有核細(xì)胞數(shù)實(shí)驗(yàn)2.1原理骨髓細(xì)胞DNA含量或骨髓有核細(xì)胞數(shù)降低是一次性全身γ射線照射引起輻射損傷的表現(xiàn)之一，在一定范圍內(nèi)，照射劑量與骨髓細(xì)胞DNA含量或骨髓有核細(xì)胞數(shù)成反比，恢復(fù)時(shí)間與骨髓細(xì)胞DNA含量或骨髓有核細(xì)胞數(shù)成正比，骨髓細(xì)胞DNA含量或骨髓有核細(xì)胞數(shù)可代表造血系統(tǒng)受損的狀況。2.2儀器和試劑血球計(jì)數(shù)板、顯微鏡、注射器、手術(shù)器械、紫外分光光度計(jì)、Hank’s液等。2.3實(shí)驗(yàn)方法2.3.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：小鼠，18－22g，單一性別，每組10－15只。2.3.2劑量分組及受試樣品給予時(shí)間實(shí)驗(yàn)設(shè)三個(gè)劑量組和一個(gè)輻射模型對(duì)照組，以人體推薦量的10倍為其中的一個(gè)劑量組，另設(shè)二個(gè)劑量組，必要時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組。受試樣品于照射前給予14－30天，照射后仍然給予受試物，必要時(shí)可適當(dāng)延長(zhǎng)至45天。2.3.3實(shí)驗(yàn)步驟受試樣品組于照射前后經(jīng)口連續(xù)給予受試樣品，劑量組與輻射模型對(duì)照組均以同一劑量γ射線全身照射一次，照射劑量宜選擇3Gy－5Gy。于照射后第3天，頸椎脫臼處死動(dòng)物，剝離出股骨，用1mL注射器（6.5號(hào)針頭）吸取一定體積的Hank’s液，沖出股骨中的全部骨髓細(xì)胞；最后，讓細(xì)胞懸液通過(guò)4號(hào)針頭的注射器，使細(xì)胞在懸液中充分分散。鏡下計(jì)數(shù)。計(jì)算每mL骨髓細(xì)胞懸液中的有核細(xì)胞數(shù)。或用紫外分光光度計(jì)260nm處測(cè)定DNA含量。2.4數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定骨髓有核細(xì)胞數(shù)或骨髓細(xì)胞DNA含量為計(jì)量資料，采用方差分析，但需按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊，計(jì)算F值，F(xiàn)值<F0.05，結(jié)論：各組均數(shù)間差異無(wú)顯著性；F值≥F0.05，P≤0.05，用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；對(duì)非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。任一劑量組與輻射模型對(duì)照組比較，骨髓有核細(xì)胞數(shù)或骨髓細(xì)胞DNA含量增多，差異有顯著性，則可判定該實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性。3小鼠骨髓細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)3.1原理骨髓細(xì)胞微核數(shù)增高是一次性全身γ射線照射引起輻射損傷的表現(xiàn)之一，在一定范圍內(nèi)，照射劑量與骨髓細(xì)胞微核率成正比，恢復(fù)時(shí)間與骨髓細(xì)胞微核率成反比，骨髓細(xì)胞微核數(shù)可代表機(jī)體染色體受損的狀況。3.2儀器和試劑解剖器械，生物顯微鏡，載玻片等。小牛血清：小牛血清濾菌后放入56℃恒溫水浴保溫1h進(jìn)行補(bǔ)體活性滅活。－20℃保存。亦可用大、小鼠血清代替。Giemsa染液及應(yīng)用液1/15mol/L磷酸鹽緩沖液（pH6.8）甲醇（分析純）3.3實(shí)驗(yàn)方法3.3.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：小鼠，體重18－22g，單一性別，每組10－15只。3.3.2劑量分組及受試樣品給予時(shí)間實(shí)驗(yàn)設(shè)三個(gè)劑量組和一個(gè)輻射模型對(duì)照組，以人體推薦量的10倍為其中的一個(gè)劑量組，另設(shè)二個(gè)劑量組，必要時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組。受試樣品于照射前給予14－30天，照射后仍然給予受試物，必要時(shí)可適當(dāng)延長(zhǎng)至45天。3.3.3實(shí)驗(yàn)步驟：受試樣品組于照射前后經(jīng)口連續(xù)給予受試樣品，劑量組與輻射模型對(duì)照組均以同一劑量γ射線全身照射一次，照射劑量宜選擇3Gy－5Gy。于照射后第3天，頸椎脫臼處死動(dòng)物，取胸骨或股骨，用止血鉗擠出骨髓液與玻片一端的小牛血清混勻，常規(guī)涂片?；蛴眯∨Ｑ鍥_洗股骨骨髓腔制成細(xì)胞懸液涂片，涂片自然干燥后，放入甲醇中固定5－10min，放入Giemsa應(yīng)用液中，染色10－15min，立即用磷酸鹽緩沖液或蒸餾水沖洗，晾干。鏡檢，每只動(dòng)物計(jì)數(shù)1000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞中微核細(xì)胞數(shù)，微核率以千分率表示。抑制率計(jì)算：C－DA（%）=───────×100%C－E式中A－抑制率C－致突變物對(duì)照組微核率D－受試樣品組微核率E－陰性對(duì)照組微核率3.4數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定采用卡方檢驗(yàn)、泊松分布或方差分析等統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。任一劑量組微核率低于輻射模型對(duì)照組微核率，差異有顯著性，可判定該實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性。4血／組織中超氧化物歧化酶（SOD）活性實(shí)驗(yàn)4.1原理血／組織中超氧化物歧化酶（SOD）活性降低是一次性全身γ射線照射引起輻射損傷的表現(xiàn)之一，在一定范圍內(nèi)，照射劑量與血／組織中超氧化物歧化酶（SOD）活性成反比，恢復(fù)時(shí)間與血／組織中超氧化物歧化酶（SOD）活性成正比，血／組織中超氧化物歧化酶（SOD）活性可代表機(jī)體氧化還原反應(yīng)系統(tǒng)受損的狀況。O2－氧化羥基的最終產(chǎn)物為亞硝酸鹽，后者在對(duì)氨基苯磺酸及甲萘胺作用下呈現(xiàn)紫紅色，在波長(zhǎng)530nm處有最大吸收峰，可用分光光度法進(jìn)行測(cè)定，當(dāng)SOD消除O2－后形成的亞硝酸鹽減少。4.2儀器與試劑儀器721分光光度計(jì)、離心機(jī)、恒溫水浴、勻漿器試劑1/15mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）pH7.8、SOD標(biāo)準(zhǔn)品、三氯甲烷、95%乙醇（v/v）、0.9%生理鹽水10mmol/L鹽酸羥胺鹽酸羥胺6.95mg，加PBS至10mL7.5mmol/L黃嘌呤黃嘌呤11.41mg，加0.1MNaOH2.5mL溶解，加PBS至10mL0.2mg/mL黃嘌呤氧化酶取10mg/mL黃嘌呤氧化酶0.2mL加冰冷PBS9.8mL至10mL0.1%甲萘胺取0.2gα-甲萘胺溶于40mL沸蒸餾水，涼至室溫加50mL冰醋酸，再加110mL涼蒸餾水至200mL0.33%對(duì)氨基苯磺酸取0.66g對(duì)氨基苯磺酸溶于150mL溫蒸餾水，加50mL冰醋酸至200mL4.3實(shí)驗(yàn)方法4.3.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：小鼠，體重18－22g，單一性別，每組10－15只。4.3.2劑量分組及受試樣品給予時(shí)間實(shí)驗(yàn)設(shè)三個(gè)劑量組和一個(gè)輻射模型對(duì)照組，以人體推薦量的10倍為其中的一個(gè)劑量組，另設(shè)二個(gè)劑量組，必要時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組。受試樣品于照射前給予14－30天，照射后仍然給予受試物，必要時(shí)可適當(dāng)延長(zhǎng)至45天。4.3.3實(shí)驗(yàn)步驟受試樣品組于照射前后經(jīng)口連續(xù)給予受試樣品，劑量組與輻射模型對(duì)照組均以同一劑量γ射線全身照射一次，照射劑量宜選擇6Gy－8Gy。于照射后第7天，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。4.3.3.1紅細(xì)胞抽提液制備：10μL全血沖入0.5mL生理鹽水，2000r/min離心3min，棄上清，加冰冷的雙蒸水0.2mL混勻，加入95%乙醇0.1mL，振蕩30s，加入三氯甲烷0.1mL，置快速混合器抽提1min，4000r/min離心3min，分層，上層為SOD抽提液，中層為血紅蛋白沉淀物，下層為三氯甲烷，記錄上清液體積待測(cè)。4.3.3.2組織勻漿的制備：剪取一定量的所需臟器，生理鹽水沖洗、拭干、稱重、剪碎，至玻璃勻漿器中加入冷生理鹽水20000r/min勻漿10s，間歇30s，反復(fù)進(jìn)行三次，制成1%組織勻漿最好用超聲波發(fā)生器處理30s使線粒體振破，以中性紅－詹鈉氏綠B染色證明線粒體已振碎。以4000r/min離心5min，取上清液20μL待測(cè)。4.3.3.3SOD標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線將SOD標(biāo)準(zhǔn)品用磷酸鹽緩沖液配制成750U/mL的溶液，再稀釋到50倍，即SOD量為15U/mL（1.5μg/mL用本法測(cè)定不同量的SOD標(biāo)準(zhǔn)液的百分抑制率，以百分抑制率為縱坐標(biāo)，以SOD活力單位U/mL為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。對(duì)照管OD－測(cè)定管ODSOD百分抑制率=────────────────×100%對(duì)照管OD計(jì)算每mL反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD量為一個(gè)單位。 對(duì)照管ODSOD活力（U/mL）=───────────────────────×──────────────×樣品稀釋倍數(shù)也可用酶比活法即以每管樣品的百分抑制率從SOD標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的SODU/mL，乘以稀釋倍數(shù)若樣品為組織勻漿液，根據(jù)勻漿濃度或組織蛋白質(zhì)含量，將單位換算為U/g組織或U/mg蛋白。若樣品為紅細(xì)胞抽提液，根據(jù)血紅蛋白含量，可換算為U/gHb。4.3.3.4樣品測(cè)定步驟：試劑測(cè)定管對(duì)照管1/15mol/L磷酸鹽緩沖液pH7.8（mL）1.01.0樣品A*10mmol/L鹽酸羥胺（mL）0.10.17.5mmol/L黃嘌呤（mL）0.20.20.2mg/mL黃嘌呤氧化酶（mL）0.20.2雙蒸水（mL）0.490.49混勻，25℃恒溫水浴20min0.33%對(duì)氨基苯磺酸（mL）2.02.00.1%甲萘胺（mL）2.02.0混勻15min后，倒入1cm光徑比色杯，以蒸餾水調(diào)零，530nm處比色測(cè)定OD值。20－30μL（溶血樣品剔除）4.4數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定SOD活性值為計(jì)量資料，采用方差分析，但需按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊，計(jì)算F值，F(xiàn)值<F0.05，結(jié)論：各組均數(shù)間差異無(wú)顯著性；F值≥F0.05，P≤0.05，用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；對(duì)非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。任一劑量組與輻射模型對(duì)照組比較，血／組織中SOD活性增強(qiáng)，差異有顯著性，則可判定該實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性。5血清溶血素實(shí)驗(yàn)5.1原理免疫系統(tǒng)是機(jī)體輻射損傷較敏感的組織之一，血清溶血素值可代表體液免疫系統(tǒng)的狀況。在一定范圍內(nèi)，照射劑量與血清中溶血素水平成反比，恢復(fù)時(shí)間與血清中溶血素水平成正比，血清中溶血素可代表機(jī)體體液免疫系統(tǒng)受損的狀況。5.2實(shí)驗(yàn)方法5.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：小鼠，18－22g，單一性別，每組10－15只。5.2.2劑量分組及受試樣品給予時(shí)間實(shí)驗(yàn)設(shè)三個(gè)劑量組和一個(gè)輻射模型對(duì)照組，以人體推薦量的10倍為其中的一個(gè)劑量組，另設(shè)二個(gè)劑量組，必要時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組。受試樣品于照射前給予14－30天，照射后仍然給予受試物，必要時(shí)可適當(dāng)延長(zhǎng)至45天。5.2.3實(shí)驗(yàn)步驟受試樣品組于照射前后經(jīng)口連續(xù)給予受試樣品，劑量組與輻射模型對(duì)照組均以同一劑量γ射線全身照射一次，照射劑量宜選擇1Gy－3Gy。于照射后20天內(nèi)，進(jìn)行血清溶血素的測(cè)定。（可任選下列方法之一）5.2.3.1血凝法用SRBC免疫動(dòng)物后，產(chǎn)生抗SRBC抗體（溶血素利用其凝集SRBC的程度來(lái)檢測(cè)溶血素的水平。5.2.3.1.2儀器和材料SRBC、生理鹽水、微量血凝實(shí)驗(yàn)板、離心機(jī)。5.2.3.1.3實(shí)驗(yàn)步驟5.2.3.1.3.1SRBC綿羊頸靜脈取血，將羊血放入有玻璃珠的滅菌錐形瓶中，朝一個(gè)方向搖動(dòng)，以脫纖維，放入4℃冰箱保存?zhèn)溆?，可保?周。5.2.3.1.3.2免疫動(dòng)物及血清分離取羊血，用生理鹽水洗滌3次，每次離心（2000r/min）10min。將壓積SRBC用生理鹽水配成2%（v/v）的細(xì)胞懸液，每只鼠腹腔注射0.2mL進(jìn)行免疫。4～5天后，摘除眼球取血于離心管內(nèi)，放置約1h，將凝固血與管壁剝離，使血清充分析出，2000r/min離心10min，收集血清。5.2.3.1.3.3凝集反應(yīng)用生理鹽水將血清倍比稀釋，將不同稀釋度的血清分別置于微量血凝實(shí)驗(yàn)板內(nèi)，每孔100μL，再加入100μL0.5%（v/v）的SRBC懸液，混勻，裝入濕潤(rùn)的平盤(pán)內(nèi)加蓋，于37℃溫箱孵育3h，觀察血球凝集程度。血清凝集程度一般分為5級(jí)（0－IV）記錄，按下式計(jì)算抗體積數(shù)，抗體水平S1+2S2+3S3……nSn）式中1、2、3……n代表對(duì)倍稀釋的指數(shù)，S代表凝集程度的級(jí)別，抗體積數(shù)越大，表示血清抗體越高。0級(jí)紅細(xì)胞全部下沉，集中在孔底部形成致密的圓點(diǎn)狀，四周液體清晰。I級(jí)紅細(xì)胞大部分沉集在孔底成圓點(diǎn)狀，四周有少量凝集的紅細(xì)胞。II級(jí)凝集的紅細(xì)胞在孔底形成薄層，中心可以明顯見(jiàn)到一個(gè)疏松的紅點(diǎn)。III級(jí)凝集的紅細(xì)胞均勻地鋪散在孔底成一薄層，中心隱約可見(jiàn)一個(gè)小紅點(diǎn)。IV級(jí)凝集的紅細(xì)胞均勻地鋪散在孔底成一薄層，凝塊有時(shí)成卷折狀。5.2.3.1.4數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定抗體積數(shù)為計(jì)量資料，采用方差分析，但需按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊，計(jì)算F值，F(xiàn)值<F0.05，結(jié)論：各組均數(shù)間差異無(wú)顯著性；F值≥F0.05，P≤0.05，用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；對(duì)非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。受試樣品組的抗體積數(shù)顯著高于模型對(duì)照組的抗體水平，可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性。5.2.3.1.5注意事項(xiàng)血清稀釋時(shí)要充分混勻。最后一個(gè)稀釋度應(yīng)不出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。5.2.3.2半數(shù)溶血值（HC50）的測(cè)定5.2.3.2.1原理用SRBC免疫動(dòng)物后，產(chǎn)生抗SRBC抗體（溶血素與SRBC一起孵育，在補(bǔ)體參與下，可發(fā)生溶血反應(yīng)，釋放血紅蛋白，通過(guò)測(cè)定血紅蛋白含量反映動(dòng)物血清中溶血素的含量。5.2.3.2.2儀器和材料721分光光度計(jì)、離心機(jī)、恒溫水浴、SRBC、補(bǔ)體（豚鼠血清）、SA緩沖液、都氏試劑（碳酸氫鈉1.0g、高鐵氰化鉀0.2g、氰化鉀0.05g，加蒸餾水至1000mL）。5.2.3.2.3實(shí)驗(yàn)步驟5.2.3.2.3.1SRBC綿羊頸靜脈取血，將羊血放入有玻璃珠的滅菌錐形瓶中朝一個(gè)方向搖動(dòng)，以脫纖維，放入4℃冰箱保存?zhèn)溆?，可保?周。5.2.3.2.3.2制備補(bǔ)體采集豚鼠血，分離出血清（至少5只豚鼠的混合血清將1mL壓積SRBC加入到5mL豚鼠血清中，放4℃冰箱30min，經(jīng)常振蕩，離心取上清，分裝70℃保存。用時(shí)以SA液按1∶8稀釋。5.2.3.2.3.3免疫動(dòng)物及血清分離取羊血，用生理鹽水洗滌3次，每次離心（2000r/min）10min。將壓積SRBC用生理鹽水配成2%（v/v）的細(xì)胞懸液每只鼠腹腔注射0.2mL進(jìn)行