病毒和亞病毒因子

第四章病毒和亞病毒因子教學(xué)要求：重點(diǎn)：病毒的特點(diǎn)；毒粒的性質(zhì)；病毒的復(fù)制；亞病毒因子難點(diǎn)：病毒的復(fù)制；病毒學(xué)研究的根本方法；病毒的非增殖性感染迄今仍無一個科學(xué)而嚴(yán)謹(jǐn)?shù)亩x病毒為具有獨(dú)立于其宿主的進(jìn)化史的絕對細(xì)胞內(nèi)寄生物,它的DNA或RNA基因組被其所編碼的蛋白質(zhì)殼體化(encapsidation)。--------Fields等,(1990年)非細(xì)胞生物(真)病毒:至少含核酸和蛋白質(zhì)二組分亞病毒類病毒:只含具侵染性的RNA組分衛(wèi)星RNA:只含有不具侵染性的RNA組分朊病毒:只含蛋白質(zhì)第一節(jié)病毒

病毒的定義形態(tài)極其微小,必須在電鏡下才能觀察,一般都具過濾性;沒有細(xì)胞構(gòu)造,故也稱分子生物;其主要成分僅是核酸和蛋白質(zhì)兩種;每一種病毒只含一種核酸,不是DNA就是RNA;病毒的特點(diǎn)既無產(chǎn)能酶系,也無蛋白合成系統(tǒng);利用宿主細(xì)胞設(shè)備進(jìn)行增殖,不存在個體生長和二均分裂等細(xì)胞繁殖方式;在宿主活細(xì)胞內(nèi)營專性寄生;在離體條件下,能以無生命的化學(xué)大分子狀態(tài)存在,并可行成結(jié)晶;對一般抗生素不敏感,但對于干擾素敏感.一、病毒的形態(tài)、構(gòu)造和化學(xué)成分〔一〕大小病毒的大小常用納米〔nm〕來度量，病毒大小在10~300nm之間，通常大小在100nm左右。絕大多數(shù)病毒能通過細(xì)菌濾器。須用電鏡才能觀察到其具體形態(tài)和大小。

核衣殼病毒粒子包膜核心：DNA或RNA衣殼：衣殼粒蛋白〔二〕形態(tài)

1、毒粒的殼狀結(jié)構(gòu)螺旋對稱殼體：亞基有規(guī)律地沿著中心軸〔核酸〕呈螺旋排列，進(jìn)而形成高度有序、對稱的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。2、病毒粒的對稱結(jié)構(gòu)二十面體對稱殼體：構(gòu)成對稱結(jié)構(gòu)殼體的第二種方式是蛋白質(zhì)亞基圍繞具立方對稱的正多面體的角或邊排列，進(jìn)而形成一個封閉的蛋白質(zhì)的鞘。二十面體對稱雙對稱殼體：具有雙對稱結(jié)構(gòu)的典型例子是有尾噬菌體〔tailedphage〕,其殼體由頭部和尾部組成。包裝有病毒核酸的頭部通常呈二十面體對稱，尾部呈螺旋對稱。1.煙草花葉病毒(TMV)---螺旋對稱衣殼衣殼蛋白：占95%，2130個衣殼粒核心RNA：占5%，ssRNA2.腺病毒(ADENOVIRUS)---二十面體立體對稱形狀：二十面體腺質(zhì)體致病性：消化道炎癥等。12個頂角20個面30個邊衣殼：252個衣殼粒12個五鄰體，240個六鄰體核心：dsDNA，線狀3.T偶噬菌體---復(fù)合對稱頭部尾部目前噬菌體根本形態(tài)分為3種蝌蚪形>微球形>絲狀橢圓形20面體衣殼粒212個內(nèi)含DNA和中心蛋白螺旋對稱衣殼粒144個注射核酸的通道噬菌體細(xì)菌培養(yǎng)物培養(yǎng)液營養(yǎng)瓊脂平板細(xì)菌培養(yǎng)液變清亮細(xì)菌平板成為殘跡平板A以細(xì)菌為接種物4病毒群體形態(tài)假設(shè)是噬菌體標(biāo)本經(jīng)過適當(dāng)稀釋再接種細(xì)菌平板，經(jīng)過一定時間培養(yǎng)，在細(xì)菌菌苔上可形成圓形局部透明區(qū)域，即噬斑〔plague〕。如同對細(xì)菌計(jì)數(shù)一樣，形成的噬菌斑也可用于對噬菌體的數(shù)目進(jìn)行估算。動物病毒實(shí)驗(yàn)動物雞胚多種細(xì)胞培養(yǎng)大多數(shù)動物病毒感染敏感細(xì)胞培養(yǎng)能引起其顯微表現(xiàn)的改變，即產(chǎn)生致細(xì)胞病變效應(yīng)〔cytopathiceffect,CPE〕，例如細(xì)胞聚集成團(tuán)、腫大、圓縮、脫落，細(xì)胞融合形成多核細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)包涵體〔inclusionbody〕，乃至細(xì)胞裂解等。假設(shè)標(biāo)本經(jīng)過適當(dāng)稀釋進(jìn)行接種并輔以染色處理，病毒可在培養(yǎng)的細(xì)胞單層上形成肉眼可見的局部病損區(qū)域，即蝕斑〔plaque〕或稱空斑。B以動物為接種物植物病毒敏感植物葉片產(chǎn)生壞死斑，或稱枯斑C以植物為接種物煙草花葉病毒花生斑駁病毒病◆一種病毒只含有一種核酸〔DNA或RNA〕。植物病毒絕大多數(shù)含RNA；少數(shù)含DNA；動物病毒一局部含DNA，一局部含RNA；細(xì)菌病毒普遍含DNA，含RNA的極少?！舨《镜暮怂犷愋蜆O為多樣化：▼▼病毒的DNA與RNA均有單鏈和雙鏈：dsDNAssDNAdsRNAssRNA(三)病毒的核酸▼病毒DNA分子有線狀和環(huán)狀之分。▼病毒核酸有正鏈〔+〕和負(fù)鏈〔-〕的區(qū)分。▼有某些病毒的RNA是雙意〔ambisense〕，即局部為正極性、局部為負(fù)極性。DNA，RAN之分單、雙鏈之分環(huán)狀，線狀之分(閉合,開放)正負(fù)鏈之分三、病毒的分類病毒分類最初是根據(jù)病毒的寄主特性將病毒分為動物病毒、植物病毒和細(xì)菌病毒(噬菌體)三大類，這種分類方法有其實(shí)用性，而沿用至今。但這種分類方法并沒有反映出病毒的本質(zhì)特征。隨著電鏡技術(shù)的開展以及別離、提純病毒新方法的應(yīng)用，逐漸轉(zhuǎn)向病毒本身的結(jié)構(gòu)特征、化學(xué)組成的研究、使病毒的分類朝著自然系統(tǒng)的方向開展。病毒分類的依據(jù)

①基因組性質(zhì)與結(jié)構(gòu)；②衣殼對稱性；③有無包膜；④病毒粒子的大小、形狀；⑤對理化因素的敏感性；⑥病毒脂類、碳水化合物、結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白的特征；⑦抗原性；⑧生物學(xué)特性〔繁殖方式、宿主范圍、傳播途徑和致病性〕。1.裂性噬菌體增殖吸附、侵入、增殖(復(fù)制)、裝配、釋放三、4類病毒及其繁殖方式〔一〕原核生物病毒-噬菌體〔1〕吸附當(dāng)噬菌體和敏感細(xì)胞混合時，發(fā)生碰撞接觸，敏感的細(xì)菌細(xì)胞外表具有噬菌體吸附的特異性受點(diǎn)，噬菌體的吸附點(diǎn)與細(xì)菌的接受點(diǎn)可以互補(bǔ)結(jié)合，這是一種不可逆的特異性反響。一種細(xì)菌可以被多種噬菌體感染，這是因?yàn)樗拗骷?xì)胞外表對各種噬菌體有不同的吸附受點(diǎn)。吸附時，噬菌體尾部末端尾絲散開，固著于特異性的受點(diǎn)，隨之尾刺和基板固定在受點(diǎn)上。不同的噬菌體粒子吸附于宿主細(xì)胞的部位也不一樣。至于每個宿主究竟能被多少噬菌體吸附，據(jù)測定一般在250~360個即到達(dá)飽和狀態(tài)，這稱作最大吸附量?！?〕侵入過程：尾絲展開、釋放溶菌酶、尾絲尾鞘收縮、DNA注入大腸桿菌(E.coli)T4噬菌體以其尾部吸附到敏感菌外表后，將尾絲展開并固著于細(xì)胞上。尾部的酶水解細(xì)胞壁的肽聚糖，使細(xì)胞壁產(chǎn)生一小孔，然后尾鞘收縮，將頭部的核酸通過中空的尾髓壓入細(xì)胞內(nèi)，而蛋白質(zhì)外殼那么留在細(xì)胞外?！?〕增殖核酸復(fù)制核酸轉(zhuǎn)錄蛋白質(zhì)合成(4)裝配DNA分子的縮合通過衣殼包裹DNA而形成頭部尾絲和尾部其它部件獨(dú)立裝配完成頭部與尾部相結(jié)合裝上尾絲成熟的病毒粒子從被感染細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移到外界的過程。成熟的噬菌體粒子，均借宿主細(xì)胞裂解而釋放。細(xì)菌裂解導(dǎo)致一種肉眼可見的液體培養(yǎng)物由混濁變清或固體培養(yǎng)物出現(xiàn)噬菌斑。(5)釋放2.噬菌體效價的測定效價指噬菌體懸液的濃度。即噬菌體數(shù)/ml樣品。斑點(diǎn)試驗(yàn)法液體稀釋管法雙層平板法單層平板法快速玻片法45℃培養(yǎng)涂布菌液液····點(diǎn)樣··噬菌斑斑點(diǎn)試驗(yàn)法液體稀釋管法試樣（未知效價的噬菌體液）培養(yǎng)液和宿主細(xì)胞計(jì)數(shù)管中完整宿主細(xì)胞數(shù)〔定時取樣對活細(xì)胞計(jì)數(shù)〕噬菌體數(shù)=原細(xì)胞數(shù)—活細(xì)胞數(shù)雙層平板法瓊脂平板菌液+噬菌體試樣+瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)10天計(jì)數(shù)噬菌斑噬菌斑數(shù)=試樣中噬菌體數(shù)快速玻片法試樣+宿主細(xì)胞+瓊脂培養(yǎng)基低倍鏡下計(jì)數(shù)噬菌斑充分混勻短期培養(yǎng)布在滅菌玻片上利用烈性噬菌體的生活周期，可以在實(shí)驗(yàn)室條件下獲得噬菌體的生長曲線。這種用來測定噬菌體侵染和成熟病毒體釋放的時間間隔，并用以估計(jì)每個被侵染的細(xì)胞釋放出來的新的噬菌體粒子數(shù)量的生長曲線，稱為一步生長曲線(one-stepgrowthcurve)。它可反映每種噬菌體的三個最重要的特性參數(shù)—潛伏期、裂解期和裂解量(burstsize)，故十分重要。3.一步生長曲線將高濃度的敏感菌培養(yǎng)物與適量相應(yīng)的噬菌體懸液相混，使得一個病毒體與10~100個細(xì)菌細(xì)胞相混合，這樣的比例系數(shù)可降低幾個噬菌體同時侵染單個細(xì)菌細(xì)胞的機(jī)率。經(jīng)過短時間的培養(yǎng)使噬菌體吸附在細(xì)菌上，再用抗病毒血清或離心或稀釋除去未吸附的噬菌體。接著，用新鮮培養(yǎng)液把經(jīng)過上述處理的細(xì)菌懸液高倍稀釋，以免發(fā)生第二次吸附和感染。培養(yǎng)后，定時取樣，將含有噬菌體的樣品與敏感細(xì)菌培養(yǎng)物混合培養(yǎng)，計(jì)算每個樣品在培養(yǎng)基平板外表產(chǎn)生的噬菌斑數(shù)目。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，噬菌斑數(shù)為縱坐標(biāo)，可以繪出一步生長曲線。噬菌體在吸附和侵入寄主后，細(xì)胞內(nèi)只出現(xiàn)噬菌體的核酸和蛋白質(zhì)，還沒有釋放出噬菌體，這段時間稱為隱晦期(eclipsephase)。人們將噬菌體吸附寄主細(xì)胞開始到細(xì)胞釋放新的噬菌體為止的這段時間稱為潛伏期(latentperiod)。潛伏期過后，噬菌斑數(shù)突然迅速上升，說明被感染的細(xì)菌已經(jīng)越來越多地裂解，直至所有感染細(xì)胞都被裂解為止，這個時間稱為上升期(riseperiod)。接著，噬菌斑數(shù)到達(dá)大致恒定，曲線平穩(wěn)。這個時期即使存在一些未感染的細(xì)菌，由于細(xì)菌懸液的稀釋倍數(shù)很高，使得新釋放的噬菌體不能吸附未感染的細(xì)菌。裂解量=裂解期平均噬菌斑數(shù)潛伏期平均噬菌斑數(shù)裂解量：每個被感染細(xì)菌釋放新的噬菌體的平均數(shù)稱為“平均收獲量，也稱裂解量。4溶源性溶源性：溫和噬菌體侵入宿主細(xì)胞后，細(xì)菌并不裂解，即它們有溶源性的生活周期。如λ和P1噬菌體〔1〕溫和噬菌體(temperatephage)：噬菌體吸附或侵入細(xì)胞后，其DNA只整合在宿主核染色體組上，并可長期隨宿主DNA的復(fù)制而同步復(fù)制，一般不進(jìn)行增殖或引起宿主細(xì)胞裂解的噬菌體。原噬菌體(前噬菌體)：整合在宿主染色體上的溫和噬菌體核酸。游離態(tài)：具感染性的病毒粒子整合態(tài)：原噬菌體，附著或整合在細(xì)菌染色體上營養(yǎng)態(tài)：在宿主細(xì)胞內(nèi)指導(dǎo)特定的病毒核酸和蛋白質(zhì)的合成〔2〕溶源性細(xì)菌：含有原噬菌體(溫和噬菌體)的細(xì)菌稱為溶源性細(xì)菌。溶源性細(xì)菌根本特性：(1)溶源性是溶源性細(xì)菌的一個極其穩(wěn)定的遺傳特性(2)自發(fā)裂解(3)誘發(fā)裂解(4)具“免疫性〞(5)溶源性細(xì)菌的復(fù)愈：非溶源化(6)溶源轉(zhuǎn)變：可獲得一些新的生理特性E.coli

K12(λ):表示一株帶有λ前噬菌體的大腸桿菌K12溶源菌株。〔二〕植物病毒植物病毒大多是單鏈RNA病毒。從病毒粒子的形態(tài)來看根本上有三種類型：桿狀、線狀或近球形的多面體。有些植物病毒也具囊膜。植物病毒也是嚴(yán)格寄生生物，但專一性不強(qiáng)，一種病毒往往能寄生在不同的科、屬、種的植物上。例如煙草花葉病毒能侵染十幾個科、百余種草本和木本植物。病毒侵染植物后可使植物表現(xiàn)出三類病癥：一是引起花葉、黃化和紅化，因病毒破壞了葉綠體或使之不能形成葉綠素；二是使植物矮化、叢簇、畸形；三是形成枯斑、壞死等。細(xì)胞包涵體有兩類：一類是一般為不規(guī)那么形、六角形、紡錘形、針形和線形的結(jié)晶形包涵體，另一類是一般呈圓球形或橢圓形的非結(jié)晶形包涵體(又稱X-小體)。前者通常由病毒粒子堆疊而成，而后者往往由病毒粒子和寄主細(xì)胞成分混合而成。植物病毒沒有專門的侵入機(jī)制，主要通過昆蟲作為媒介進(jìn)行傳播。植物病毒必須在侵入宿主細(xì)胞后才脫去蛋白質(zhì)衣殼，這一過程稱為脫殼〔三〕人類和脊椎動物病毒脊椎動物病毒可引起許多人類疾病如流行性感冒、肝炎、皰疹、流行性乙型腦炎、狂犬病、艾滋病、非典型肺炎〔由SARS病毒引起〕等。在已發(fā)現(xiàn)的動物病毒中約有1/4的病毒具有致腫瘤作用，至少有5五類病毒〔乳頭瘤病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、皰疹病毒、肝DNA病毒和黃病毒〕與癌癥發(fā)病有關(guān)。動物病毒侵入寄主細(xì)胞后可引起4種結(jié)果動物病毒也是在侵入宿主細(xì)胞后才脫去蛋白質(zhì)衣殼，即脫殼?！菜摹忱ハx病毒昆蟲病毒屬于無脊椎動物病毒。有些昆蟲具有經(jīng)濟(jì)上的重要性，例如蜜蜂和家蠶，一旦染上病毒病，就會造成經(jīng)濟(jì)上的重大損失。但有些病毒卻能侵染殺死農(nóng)作物和森林的重要害蟲。昆蟲病毒病的一個相當(dāng)普遍的特點(diǎn)是在被感染的動物細(xì)胞中形成多角形包涵體。包涵體的成分是蛋白質(zhì)。根據(jù)包涵體的有無及包涵體在細(xì)胞中的位置、形狀，可將昆蟲病毒分為4種：(1)核型多角體病毒(nuclearpolyhedrosisvirus，簡稱NPV)這類病毒粒子呈桿狀，被包在呈多面體的包涵體內(nèi)，位于宿主細(xì)胞核內(nèi)。蠶多角體病毒就是一個典型。有些核型多角體病毒那么是粘蟲、水稻色蛾、斜紋夜蛾等農(nóng)業(yè)害蟲的天敵，有些已用于生物防治。(2)質(zhì)型多角體病毒(cytoplasmicpolyhedrosisvirus，簡稱CPV)包涵體位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。主要在昆蟲腸道中增殖。用質(zhì)型多角體病毒防治松毛蟲有很好的效果。(3)顆粒體病毒(granulosisvirus，簡稱GV)包涵體呈圓形、橢圓形顆粒狀。包涵體內(nèi)只含一個病毒顆粒，偶有兩個。我國已制成菜粉蝶顆粒體病毒劑用于生物防治。課堂練習(xí)題多數(shù)病毒粒子的大小為10nm100nm左右300nmD.10-300nm病毒的大小以()為單位量度。A.

mB.nmC.mmE.coliT4噬菌體的典型外形是：球形蝌蚪形桿狀絲狀病毒含有的核酸通常是：DNA和RNADNA或RNADNARNA毒性噬菌體入侵寄主的過程可分為_______、__________、__________、__________、__________等五個階段。一種病毒只含一種核酸,即_____或______；植物病毒多為____病毒;噬菌體多為____病毒。病毒是一種無_______結(jié)構(gòu),能通過________,嚴(yán)格寄生于__________的超顯微生物。第二節(jié)亞病毒亞病毒是比真病毒更小更簡單的一類單分子病毒的總稱。一、類病毒至今所知的最小、最簡單的病毒；僅含一種成分——RNA； 〔病毒為106Da類病毒為105Da〕能在敏感細(xì)胞內(nèi)自我復(fù)制，不需要輔助病毒。馬鈴薯紡錘塊莖病PSTV類病毒馬鈴薯紡錘形塊莖病類病毒為裸露的閉合環(huán)狀RNA分子整環(huán)由2個互補(bǔ)的半體所組成，一個含179個堿基，另一個含180個堿基，兩者間有70%的堿基以氫鍵方式結(jié)合，共形成122個堿基對整個棒狀結(jié)構(gòu)中含27個內(nèi)環(huán)PSTV類病毒的結(jié)構(gòu)二、朊病毒(PRION“普列昂〞)不含核酸的傳染性蛋白質(zhì)分子；引起宿主內(nèi)同類蛋白質(zhì)分子發(fā)生與其相似的構(gòu)象變化，從而使宿主致?。坏鞍踪|(zhì)越純，其侵染性越強(qiáng)；朊病毒的化學(xué)特性朊病毒能耐熱，其侵染性在120～130℃條件下處理4h不失活；能抵抗紫外線和電離輻射；能抵抗DNA酶和RNA酶的處理；朊病毒對尿素、SDS、苯酚和其他使蛋白變性的化學(xué)藥劑〔蛋白酶K和胰蛋白酶〕是敏感的。朊病毒的結(jié)構(gòu)電鏡下呈桿狀顆粒，直徑25nm，長125~150nm桿狀顆粒呈叢狀排列，每叢從幾十至上百蛋白質(zhì)分子量為2.7萬~3萬KDa，無免疫原性朊病毒的致病性導(dǎo)致動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)退化、紊亂等疾病使動物出現(xiàn)脫毛、皮膚騷癢、失去平衡和后肢麻痹等病癥可以傳染給人類朊病毒的生物學(xué)意義使生物學(xué)遺傳信息傳遞的 “中心法那么〞受到?jīng)_擊為蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能 研究提出新思路三、擬病毒

擬病毒也稱為類類病毒，它是一種環(huán)狀單鏈RNA。它的侵染對象是植物病毒。被侵染的植物病毒被稱為輔助病毒，擬病毒必須通過輔助病毒才能復(fù)制。單獨(dú)的輔助病毒或擬病毒都不能使植物受到感染。四、衛(wèi)星病毒和衛(wèi)星核酸衛(wèi)星病毒和衛(wèi)星核酸都是亞病毒侵染因子的一類,它們?nèi)鄙侏?dú)立的復(fù)制能力,需要輔助病毒才能復(fù)制其核酸,或由輔助病毒提供外殼蛋白來包被核酸.凡其核酸編碼自己外殼蛋白的稱為衛(wèi)星病毒,否那么僅稱衛(wèi)星核酸.擬病毒、類病毒、阮病毒的比較病毒是由核酸和蛋白質(zhì)外殼所組成；類病毒只有核酸,沒有蛋白質(zhì)外殼；阮病毒只有蛋白質(zhì)組成；擬病毒是“寄生〞在病毒中的病毒，只是一小段核酸片段，需要依靠其“寄主〞病毒的復(fù)制來復(fù)制——完成自身的傳代。第三節(jié)病毒與實(shí)踐病毒與人類實(shí)踐的關(guān)系極為密切。由它們引起的宿主病害既可使人類健康和對畜牧業(yè)、栽培業(yè)和發(fā)酵工業(yè)帶來不利的影響，又可利用它們進(jìn)行生物防治，此外，還可利用病毒進(jìn)行疫菌生產(chǎn)和作為遺傳工程中的外源基因載體，直接或間接地為人類創(chuàng)造出巨大的經(jīng)濟(jì)效益、社會效益和生態(tài)效益。一、噬菌體與