微生物第八章課件

第三節(jié)基因突變與誘變育種8.3.1基因突變類型和遺傳效應(yīng)8.3.2基因的自發(fā)突變機(jī)制8.3.3基因的誘發(fā)突變機(jī)制8.3.4突變型菌株及應(yīng)用8.3.5誘變育種技術(shù)8.3.1基因突變類型和遺傳效應(yīng)染色體的畸變：DNA復(fù)制時出錯，使子代DNA上大段堿基序列缺失、重復(fù)、倒位，通常導(dǎo)致細(xì)胞死亡；染色體的突變：DNA復(fù)制時出錯，使子代DNA上少數(shù)堿基序列出現(xiàn)缺失、添加、置換；基因突變（genemutation）：突變出現(xiàn)在基因序列內(nèi)，影響了基因編碼產(chǎn)物的功能，或者基因的表達(dá)特性，并產(chǎn)生遺傳效應(yīng)；點(diǎn)突變：僅在一個堿基位點(diǎn)發(fā)生的基因突變，是常見的基因突變；基因突變的類型堿基的置換：轉(zhuǎn)換：一種嘌呤（嘧啶）變?yōu)榱硪环N嘌呤（嘧啶）；顛換：嘌呤變?yōu)猷奏ぃ蜞奏ぷ優(yōu)猷堰?；堿基數(shù)量的突變：分為缺失和添加，如果發(fā)生在編碼序列中，稱為移碼突變；非編碼序列基因突變的遺傳效應(yīng)基因的表達(dá)元件發(fā)生基因突變，可能優(yōu)化表達(dá)元件，也可能損傷表達(dá)元件，而影響基因的表達(dá)水平；基因的調(diào)控元件發(fā)生基因突變，一般破壞其固有的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，例如：由誘導(dǎo)型表達(dá)變?yōu)榻M成型表達(dá)；編碼序列基因突變的遺傳效應(yīng)同義突變：堿基置換不改變密碼子的含義；錯義突變；堿基置換改變了密碼子的含義；無義突變：堿基置換產(chǎn)生終止密碼子UAA、UAG或UGA，使轉(zhuǎn)譯在突變處終止；移瑪突變：堿基的缺失或添加，使改變，使突變點(diǎn)以后的密碼子的閱讀框完全錯位；但是缺失或添加三個堿基，或缺失和添加數(shù)相等，則不會發(fā)生移碼突變，而可能發(fā)生錯義突變；堿基互變導(dǎo)致基因的自發(fā)突變在DNA復(fù)制過程中，如果某個G以烯醇式異構(gòu)體存在，則與T配對，在子鏈中形成G-T錯配；在下一次復(fù)制時，在子鏈中出現(xiàn)由G-C到A-T基因突變；環(huán)出效應(yīng)引起的基因自發(fā)突變DNA復(fù)制時，子鏈滑動出現(xiàn)環(huán)出，則子鏈發(fā)生堿基添加；如果母鏈滑動出現(xiàn)環(huán)出，則子鏈發(fā)生堿基缺失；子鏈再次復(fù)制時，其子鏈發(fā)生突變；8.3.3基因的誘發(fā)突變機(jī)制誘發(fā)突變：由外界的物理、化學(xué)或生物因素直接或間接作用于胞內(nèi)DNA分子，而導(dǎo)致的基因突變；一般發(fā)生頻率顯著高于自發(fā)突變；誘變劑：能夠直接或間接增加胞內(nèi)DNA的不穩(wěn)定性，提高DNA復(fù)制出錯幾率的物理、化學(xué)、生物因素；化學(xué)誘變劑：堿基類似物、氧化劑、烷化劑、插入染料等；物理誘變劑：紫外線和電離輻射；生物誘變劑：溫和性噬菌體、轉(zhuǎn)座因子等；堿基類似物及誘變機(jī)制堿基類似物：組成DNA的四種正常嘌呤或嘧啶堿基的結(jié)構(gòu)類似物；如：5-溴尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、8-氮鳥嘌呤、6-巰基嘌呤、2-氨基嘌呤等；堿基類似物的誘變機(jī)制：在DNA復(fù)制時，堿基類可替代正常堿基摻入到新合成的子鏈中；但堿基類似物更容易發(fā)生常態(tài)結(jié)構(gòu)和異構(gòu)體之間的互變，在DNA下次復(fù)制時，提高錯配的幾率；5-溴尿嘧啶的異構(gòu)體和配對方式5-溴尿嘧啶是嘧啶堿基類似物，可代替嘧啶核苷酸參與DNA復(fù)制；酮式5-溴尿嘧啶替代T與A配對（5-BU-A）；稀醇式5-溴尿嘧啶則替代C與G配對（5-BUe-G）；5-溴尿嘧啶的誘變機(jī)制5-溴尿嘧啶比正常堿基更容易發(fā)生酮式到稀醇式的互變，在DNA復(fù)制時，更容易產(chǎn)生錯配，提高T-A到C-G的突變幾率；烯醇式酮式亞硝基胍（NTG）的誘變機(jī)制N-甲基-N`-硝基-N-亞硝基胍是超強(qiáng)的鳥嘌呤烷化劑，使鳥嘌呤甲基化為O6-甲基鳥嘌呤；DNA復(fù)制時，O6-甲基鳥嘌呤與T配對；再次復(fù)制時，產(chǎn)生C-G到A-T的基因突變；常用烷化劑-硫酸酯和磺酸烷酯常用烷化劑-亞硝基化合物類常用烷化劑-環(huán)氧類和乙烯亞胺類常用烷化劑-其它類重氮甲烷（diazomethane）b-丙酸內(nèi)酯（b-ptopylactone）芥子氣（mustardgas）氮芥（nitrogenmustard）插入染料及誘變機(jī)制插入染料是一類具有扁平形狀的有機(jī)分子，如：溴化乙錠（EB）、丫啶橙、丫啶黃、原黃素等；插入染料能夠插入到雙螺旋DNA中間堆積的堿基之間，在復(fù)制時引起DNA滑動，造成堿基的缺失或添加突變；EB紫外線的誘變機(jī)制紫外線照射可使胞內(nèi)DNA上相鄰的兩個嘧啶之間形成二聚體；當(dāng)DNA復(fù)制時，影響其模板功能，導(dǎo)致堿基對置換，誘發(fā)基因突變；細(xì)胞都存在DNA損傷的暗修復(fù)和光修復(fù)機(jī)制，使一般劑量紫外線的照射不足以引起較高頻率的基因突變；電離輻射的誘變機(jī)制電離輻射：帶有較高能量的能引起物質(zhì)電離的電磁波，如：c射線、a射線、b射線、g射線等；在溫和劑量下，受電離輻射的胞內(nèi)DNA電離發(fā)生損傷，導(dǎo)致基因突變；或者使胞內(nèi)其它物質(zhì)電離產(chǎn)生強(qiáng)氧化物，再作用于DNA分子，誘發(fā)基因突變；各種誘變劑與DNA發(fā)生作用的位點(diǎn)是高度隨機(jī)的，由此產(chǎn)生的DNA突變也是隨機(jī)分布的，誘變劑與特定基因突變沒有對應(yīng)關(guān)系－－基因突變的不對應(yīng)性；8.3.4突變型菌株及應(yīng)用野生型菌株：從自然環(huán)境中分離得到的，基因型和表型為其固有的菌株；突變型菌株（突變型）：由野生型菌株發(fā)生基因突變，而衍生出的具有新的基因型和表型的菌株；突變型菌株主要用于代謝和分子遺傳學(xué)研究，以及用作工業(yè)發(fā)酵菌種；突變型的類型：營養(yǎng)缺陷型、抗性突變型、條件致死突變型、形態(tài)突變型、產(chǎn)量突變型；營養(yǎng)缺陷型（auxotroph）營養(yǎng)缺陷型：由于基因發(fā)生突變而不能正常表達(dá)所編碼的酶，導(dǎo)致某種必需代謝物的合成能力缺陷的突變型菌株；常見營養(yǎng)缺陷型：氨基酸缺陷型、維生素缺陷型、核苷酸（堿基）缺陷型等；需要從營養(yǎng)物質(zhì)中提供所缺陷的代謝物，營養(yǎng)缺陷型才能正常生長；例：細(xì)胞因基因突變而不能合成二氫蝶酸合成酶，使葉酸合成能力缺陷，細(xì)胞則成為葉酸缺陷型突變株；抗性突變型（resistantmutant）抗性突變型：因基因突變，導(dǎo)致該基因表達(dá)水平改變，或者導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)或代謝途徑發(fā)生改變，使細(xì)胞對某種化學(xué)因子和環(huán)境因素的耐受性提高的突變株；常見抗性突變株：抗藥性突變株、耐滲透壓突變株、耐高溫突變株、耐酸或耐堿突變株、耐有機(jī)溶劑突變株等；例如：可以耐受高濃度乙醇的乙醇耐受型突變株用于工業(yè)乙醇發(fā)酵的菌種；

條件致死突變型（conditionallethal）條件致死突變型：因基因突變，而喪失在某種特定物化條件下的生長能力，表現(xiàn)為死亡的突變型；例如：野生型E.coli在42℃時可以正常生長，其溫度敏感突變型（temperaturesensitive,ts）突變株在42℃時不能生長，但低于42℃可正常生長；條件致死突變型作為一種方便選擇培養(yǎng)（淘汰）的菌株，在微生物的分子遺傳學(xué)研究許多應(yīng)用；形態(tài)突變型和產(chǎn)量突變型形態(tài)突變型：基因突變導(dǎo)致形態(tài)特征明顯改變的突變株；例如：肺炎鏈球菌野生型（S型菌株）和形態(tài)突變型（R型菌株），菌落分別呈現(xiàn)大而濕潤和小而干燥的特征；因莢膜合成能力缺陷所致；產(chǎn)量突變型：由于多基因影響某種代謝物的過量合成，不清楚的基因突變導(dǎo)致代謝物的合成能力提高的突變株；傳統(tǒng)工業(yè)發(fā)酵菌株基本上都是產(chǎn)量突變株；例如：產(chǎn)青霉素的產(chǎn)黃青霉的產(chǎn)量突變型，其產(chǎn)青霉素的能力較野生型大幅度提高；8.3.5誘變育種技術(shù)誘變育種技術(shù)：使用誘變劑，通過誘變，提高基因突變發(fā)生幾率的技術(shù)；以及將誘變產(chǎn)生的少數(shù)目的突變株從混雜群體中篩選（選擇）出來的技術(shù)；誘變育種技術(shù)是改變微生物基因型的傳統(tǒng)手段，用于為微生物分子遺傳學(xué)提供材料，也用于工業(yè)微生物的遺傳育種；微生物遺傳育種：通過人工技術(shù)手段改變微生物的基因型，獲得性狀優(yōu)良的工業(yè)發(fā)酵菌株；誘變技術(shù)規(guī)范出發(fā)菌株的選擇：基本性狀優(yōu)良，對誘變劑敏感，使用指數(shù)期細(xì)胞，絲狀菌使用單孢子；誘變劑的選擇：一般遵循先簡易，后繁雜；先溫和后強(qiáng)烈，先單一后復(fù)合的原則；可進(jìn)行多輪誘變；誘變強(qiáng)度的選擇：以細(xì)胞致死率或存活率為誘變強(qiáng)度的指標(biāo)，可選擇致死率為90%的誘變強(qiáng)度，也可以選擇致死率為10%的誘變強(qiáng)度：誘變強(qiáng)度=劑量×處理時間突變株篩選方法誘變雖然能夠提高總基因突變幾率，但是特定基因突變的出現(xiàn)幾率相對依然很低，可能在10-3～10-6之間；設(shè)計(jì)有效的目的突變株的篩選方法，是決定誘變育種效率的關(guān)鍵；一般采用選擇性培養(yǎng)基或培養(yǎng)條件選擇目的突變型，或淘汰野生型，濃縮目的突變型；或采用鑒別培養(yǎng)基，將不便直接觀察的突變表型特征轉(zhuǎn)化為可觀察的菌落特征，透明圈、變色圈；P233苯丙氨酸產(chǎn)量突變株的選擇（篩選）方法苯丙氨酸的合成代謝受苯丙氨酸反饋?zhàn)瓒粽{(diào)節(jié)；苯丙氨酸結(jié)構(gòu)類似物－－氟苯丙氨酸抑制野生型的生長；用含有抑制濃度氟苯丙氨酸的平板培養(yǎng)基，培養(yǎng)誘變處理后的菌懸液，野生型與其它突變型不能生長，只有苯丙氨酸產(chǎn)量突變株可以生長，而從混合菌群中被選擇出來；原理：苯丙氨酸合成酶基因的調(diào)控元件發(fā)生突變，成為組成型表達(dá)，不再受苯丙氨酸或結(jié)構(gòu)類似物氟苯丙氨酸的反饋?zhàn)瓒粽{(diào)控，苯丙氨酸過量合成；營養(yǎng)缺陷型的篩選培養(yǎng)基營養(yǎng)缺陷型因?yàn)橛腥毕荩菀资褂门囵B(yǎng)基或培養(yǎng)條件淘汰，而不利于選擇；一般使用基本培養(yǎng)基與補(bǔ)充培養(yǎng)基菌落生長對照方法篩選；基本培養(yǎng)基：能夠滿足野生型最低生長需要的培養(yǎng)基，一般是合成培養(yǎng)基，營養(yǎng)缺陷型不能生長；補(bǔ)充培養(yǎng)基：在基本培養(yǎng)基中，補(bǔ)充某一種營養(yǎng)物質(zhì)，能夠滿足某種營養(yǎng)缺陷型的生長需要；完全培養(yǎng)基：一般是天然培養(yǎng)基或半合成培養(yǎng)基，營養(yǎng)豐富，能夠滿足野生型和營養(yǎng)缺陷型的生長需要；營養(yǎng)缺陷型的篩選方法誘變處理后的菌懸液涂布在完全培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至長出單菌落；將長出的所有單菌落都逐個點(diǎn)種至基本培養(yǎng)基和補(bǔ)充培養(yǎng)基的對應(yīng)位置，培養(yǎng)至長出菌苔；如果在基本