木本植物的遺傳轉(zhuǎn)化4.7課件

實(shí)驗(yàn)三木本植物的

遺傳轉(zhuǎn)化

1.2.農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌是普遍存在于土壤中的一種革蘭氏陰性細(xì)菌，它能在自然條件下趨化性地感染大多數(shù)雙子葉植物的受傷部位，并誘導(dǎo)產(chǎn)生冠癭瘤或發(fā)狀根。3.農(nóng)桿菌介導(dǎo)法含有Ti質(zhì)粒的致癌農(nóng)桿菌與一些植物的細(xì)胞接觸后，Ti質(zhì)粒的一部分（T-DNA）可以導(dǎo)入植物細(xì)胞，整和到植物基因組DNA隨其復(fù)制。根據(jù)這一特性可構(gòu)建一系列Ti質(zhì)粒載體，與含目的片段的DNA片段重組，導(dǎo)入致癌農(nóng)桿菌，再采用葉盤法、原生質(zhì)體培養(yǎng)法、細(xì)胞培養(yǎng)法，通過致癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)進(jìn)入植物細(xì)胞。4.根癌農(nóng)桿菌（Ti質(zhì)粒）Ti質(zhì)粒是約200-500kb的環(huán)狀DNA分子，Ti質(zhì)粒具有五個主要功能區(qū)域，它們分別是T-DNA、質(zhì)粒轉(zhuǎn)移(plasmidtransfer)、冠癭堿代謝(opinecatabolism)、復(fù)制原點(diǎn)(ori)和毒性區(qū)域(vir)。T-DNA中直接參與轉(zhuǎn)移并整合到植物染色體上的序列，僅是T-DNA兩端與其它序列交界處的25bp不完全直接重復(fù)(imperfectdirectrepeats)，右端的序列稱為右界(rightborder,RB),左端的為左界(leftborder,LB)。T-DNA區(qū)域內(nèi)的所有基因與轉(zhuǎn)移無關(guān)，所以將致瘤基因全部缺失即卸甲(disarmed)后，將其它序列插入到這個區(qū)域，形成的T-DNA仍可將RB至LB內(nèi)的序列轉(zhuǎn)移并整合到植物基因組。Vir區(qū)的毒性基因是T-DNA轉(zhuǎn)移所必需的。,5.6.7.8.實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆者z傳轉(zhuǎn)化的原理和操作技術(shù)。初步掌握農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化植物的方法。9.農(nóng)桿菌介導(dǎo)法原理Ti(tumorinducing)質(zhì)粒是根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)所特有的質(zhì)粒，是天然的基因載體，可高效整合到植物細(xì)胞的基因組中。農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒中心T-DNA在毒性區(qū)Vir基因的作用下，轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，并插入植物基因組中共同復(fù)制與表達(dá)。10.材料、設(shè)備及試劑材料：葉片設(shè)備及試劑：超凈工作臺、離心機(jī)、振蕩培養(yǎng)箱、試劑瓶、培養(yǎng)皿、酒精燈等。Kan、利福平(rif)、YEB、乙醇等。11.（1）工程菌液的制備（2）外植體消毒將葉片用解剖刀切成小塊，浸泡在次氯酸鈉中10min，用無菌水洗3次，每次1-2min。（3）預(yù)培養(yǎng)以葉片作受體材料，選擇完全展開、深綠色的葉片，橫過葉片的主脈剪2-3下，放到誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基上進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)3d。（4）、侵染在超凈工作臺上，將工程菌液倒入無菌三角瓶中，將預(yù)培養(yǎng)的葉片浸入工程菌液中，5min.

（5）共培養(yǎng)取出外植體在無菌濾紙上吸干菌液，將葉片放入新的培養(yǎng)基中，共培養(yǎng)。（提前倒平板）（6）脫菌與選擇培養(yǎng)暗培養(yǎng)結(jié)束后的葉片，在超凈工作臺中轉(zhuǎn)入含有頭孢唑啉鈉的培養(yǎng)基中，進(jìn)行除菌。一周后進(jìn)行選擇培養(yǎng)。（7）誘導(dǎo)芽生長、生根，形成轉(zhuǎn)化植株實(shí)驗(yàn)步驟：12.步驟：農(nóng)桿菌的活化（1）工程菌液的制備13.挑單克隆14.測OD600=0.515.收集細(xì)胞用液體LB培養(yǎng)基重懸細(xì)胞稀釋20-50倍16.2、外植體消毒將葉片用解剖刀切成小塊，浸泡在次氯酸鈉中10min，用無菌水洗3次，每次1-2min17.3、預(yù)培養(yǎng)以葉片作受體材料，選擇完全展開、深綠色的葉片，橫過葉片的主脈剪2-3下（如圖1），放到誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基上進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，預(yù)培養(yǎng)時間分為3d。圖1用于預(yù)培養(yǎng)的葉片右：用于轉(zhuǎn)化；左：不宜作轉(zhuǎn)化外植體體左，18.4、侵染在超凈工作臺上，將工程菌液倒入無菌三角瓶中，將預(yù)培養(yǎng)的葉片浸入工程菌液中，浸泡為5min.19.5、共培養(yǎng)取出外植體在無菌濾紙上吸干菌液，將葉片放入新的培養(yǎng)基中，共培養(yǎng)。（提前倒平板）20.在含有選擇壓力的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)細(xì)胞分化，形成轉(zhuǎn)化芽6、脫菌與選擇培養(yǎng)暗培養(yǎng)結(jié)束后的葉片，在超凈工作臺中轉(zhuǎn)入含有頭孢唑啉鈉的培養(yǎng)基中，進(jìn)行除菌。一周后進(jìn)行選擇培養(yǎng)。21.誘導(dǎo)芽生長、生根，形成轉(zhuǎn)化植株Ⅲ-2選擇生根培養(yǎng)（Kan15mg/L）左，