《重組蛋白表達(dá)體系》課件

《重組蛋白表達(dá)體系》PPT課件目錄重組蛋白表達(dá)體系概述重組蛋白表達(dá)體系的構(gòu)建重組蛋白的表達(dá)重組蛋白的分離與純化重組蛋白的表達(dá)影響因素重組蛋白表達(dá)體系的優(yōu)化01重組蛋白表達(dá)體系概述Part重組蛋白表達(dá)體系的建立需要經(jīng)過(guò)基因克隆、載體構(gòu)建、宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化、目的蛋白質(zhì)表達(dá)及純化等步驟。重組蛋白表達(dá)體系具有高效、可調(diào)控、可大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，是現(xiàn)代生物技術(shù)領(lǐng)域中的重要技術(shù)手段。重組蛋白表達(dá)體系是指通過(guò)基因工程技術(shù)，將外源基因在宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，從而獲得目的蛋白質(zhì)的過(guò)程。重組蛋白表達(dá)體系的基本概念以大腸桿菌為代表的原核生物作為宿主細(xì)胞，具有操作簡(jiǎn)便、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，適用于表達(dá)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、易于純化的蛋白質(zhì)。原核表達(dá)體系以酵母、昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞等為代表的真核生物作為宿主細(xì)胞，適用于表達(dá)復(fù)雜結(jié)構(gòu)、功能多樣的蛋白質(zhì)，但操作復(fù)雜、成本較高。真核表達(dá)體系通過(guò)基因工程技術(shù)手段，在宿主細(xì)胞中引入特定的轉(zhuǎn)錄后修飾系統(tǒng)，使目的蛋白質(zhì)具有與天然蛋白質(zhì)相同的修飾，如磷酸化、糖基化等。轉(zhuǎn)錄后修飾體系重組蛋白表達(dá)體系的種類重組蛋白表達(dá)體系的應(yīng)用生物醫(yī)藥領(lǐng)域用于生產(chǎn)藥物、疫苗、診斷試劑等，提高產(chǎn)量、降低生產(chǎn)成本。農(nóng)業(yè)領(lǐng)域用于改良農(nóng)作物性狀、生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因食品等，提高產(chǎn)量、抗病抗蟲(chóng)等。工業(yè)領(lǐng)域用于生產(chǎn)酶、蛋白質(zhì)等生物催化劑和工業(yè)原料，提高生產(chǎn)效率、降低環(huán)境污染。02重組蛋白表達(dá)體系的構(gòu)建Part通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)，從生物體中分離出目的基因的DNA片段?；蚩寺∪绻康幕驘o(wú)法從生物體中直接獲得，可以通過(guò)人工合成的方法獲得。基因合成目的基因的獲取質(zhì)粒是一種環(huán)狀DNA分子，可以自我復(fù)制并穩(wěn)定地存在于宿主細(xì)胞中。病毒載體可以將目的基因插入到病毒基因組中，并利用病毒的復(fù)制機(jī)制在宿主細(xì)胞中表達(dá)目的基因。載體的選擇與構(gòu)建病毒載體質(zhì)粒載體限制性酶切使用限制性酶對(duì)目的基因和載體進(jìn)行酶切，產(chǎn)生黏性末端或平末端。連接反應(yīng)將酶切后的目的基因和載體進(jìn)行連接，形成重組分子。目的基因與載體的連接重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化與篩選轉(zhuǎn)化將重組質(zhì)粒導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中，常用的方法有電穿孔法和化學(xué)轉(zhuǎn)化法。篩選通過(guò)特定的篩選標(biāo)記對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選，如抗生素抗性標(biāo)記、報(bào)告基因等。03重組蛋白的表達(dá)Part宿主細(xì)胞選擇根據(jù)重組蛋白的特性選擇合適的宿主細(xì)胞，如大腸桿菌、酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等。宿主細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)宿主細(xì)胞，使其達(dá)到適合重組蛋白表達(dá)的狀態(tài)，包括調(diào)整培養(yǎng)基成分、控制培養(yǎng)溫度和pH等。宿主細(xì)胞的選擇與培養(yǎng)VS根據(jù)選用的宿主細(xì)胞和重組蛋白特性，選擇適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)方法，如添加誘導(dǎo)劑、改變溫度或pH等。表達(dá)水平通過(guò)優(yōu)化誘導(dǎo)條件，提高重組蛋白的表達(dá)水平，確保獲得足量的目標(biāo)蛋白。誘導(dǎo)方法重組蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)采用適當(dāng)?shù)臋z測(cè)方法，如Westernblot、ELISA等，對(duì)重組蛋白的表達(dá)進(jìn)行定性或定量分析。對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化，去除雜質(zhì)，獲得高純度的目標(biāo)蛋白，以便后續(xù)研究或應(yīng)用。檢測(cè)方法表達(dá)產(chǎn)物純化重組蛋白的表達(dá)檢測(cè)04重組蛋白的分離與純化Part通過(guò)物理或化學(xué)方法破碎細(xì)胞，釋放細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的重組蛋白。細(xì)胞破碎利用離心機(jī)將破碎的細(xì)胞碎片與上清液中的重組蛋白進(jìn)行分離。離心分離細(xì)胞破碎與離心分離蛋白質(zhì)的沉淀與萃取通過(guò)改變?nèi)芤旱膒H、離子強(qiáng)度或添加有機(jī)溶劑等手段，使重組蛋白從溶液中沉淀下來(lái)。沉淀利用不同物質(zhì)在兩種不相溶溶劑中的溶解度差異，將重組蛋白從一種溶劑轉(zhuǎn)移到另一種溶劑中。萃取凝膠過(guò)濾層析利用不同大小的蛋白質(zhì)在凝膠上的擴(kuò)散速度不同進(jìn)行分離。要點(diǎn)一要點(diǎn)二離子交換層析利用蛋白質(zhì)的電荷性質(zhì)差異進(jìn)行分離，常用于去除雜質(zhì)和純化目的蛋白。蛋白質(zhì)的層析分離聚丙烯酰胺凝膠電泳根據(jù)蛋白質(zhì)的大小和電荷性質(zhì)進(jìn)行分離。等電聚焦電泳根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)進(jìn)行分離，常用于確定蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)并進(jìn)一步純化。蛋白質(zhì)的電泳純化05重組蛋白的表達(dá)影響因素Part03宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)條件宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)條件如溫度、pH、培養(yǎng)基成分等對(duì)重組蛋白的表達(dá)也有影響。01宿主細(xì)胞的遺傳背景不同的宿主細(xì)胞具有不同的基因組背景，對(duì)重組蛋白的表達(dá)有顯著影響。02宿主細(xì)胞的代謝狀態(tài)宿主細(xì)胞的代謝狀態(tài)影響其能量和物質(zhì)供給，從而影響重組蛋白的表達(dá)。宿主細(xì)胞的影響123某些蛋白酶可能對(duì)重組蛋白產(chǎn)生降解作用，影響其穩(wěn)定性。蛋白酶的穩(wěn)定性重組蛋白的構(gòu)象穩(wěn)定性對(duì)其表達(dá)和功能有重要影響。蛋白構(gòu)象的穩(wěn)定性重組蛋白與其他細(xì)胞成分的相互作用可能影響其穩(wěn)定性。蛋白與其他分子的相互作用重組蛋白的穩(wěn)定性表達(dá)載體和宿主細(xì)胞選擇選擇合適的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞可以提高重組蛋白的表達(dá)量。誘導(dǎo)條件的選擇選擇適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)條件如誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)等可以影響重組蛋白的表達(dá)量?；蛟O(shè)計(jì)和優(yōu)化基因序列的優(yōu)化和改造可以顯著提高重組蛋白的表達(dá)量。重組蛋白的表達(dá)量06重組蛋白表達(dá)體系的優(yōu)化Part基因敲除通過(guò)基因敲除技術(shù)，去除宿主細(xì)胞中與重組蛋白表達(dá)相關(guān)的內(nèi)源性基因，減少內(nèi)源性蛋白的干擾?；蛲蛔兺ㄟ^(guò)基因突變技術(shù)，對(duì)宿主細(xì)胞中與重組蛋白表達(dá)相關(guān)的基因進(jìn)行突變，以提高重組蛋白的表達(dá)水平?；驍U(kuò)增通過(guò)基因擴(kuò)增技術(shù)，增加宿主細(xì)胞中與重組蛋白表達(dá)相關(guān)的基因拷貝數(shù)，提高重組蛋白的表達(dá)量。宿主細(xì)胞的遺傳改造培養(yǎng)基成分01優(yōu)化培養(yǎng)基的成分，如添加適量的氨基酸、維生素和微量元素等，以促進(jìn)重組蛋白的表達(dá)。溫度和pH值02調(diào)整培養(yǎng)溫度和pH值，以適應(yīng)重組蛋白的表達(dá)需求，提高表達(dá)效率。誘導(dǎo)劑濃度和添加時(shí)間03優(yōu)化誘導(dǎo)劑的濃度和添加時(shí)間，以最大化重組蛋白的表達(dá)量。表達(dá)誘導(dǎo)條件的優(yōu)化STEP01STEP02STEP03蛋白質(zhì)純化方法的改進(jìn)親和標(biāo)簽采用多步純化方法