第二章第一節(jié)　工業(yè)微生物的菌種選育1

第一節(jié)發(fā)酵工業(yè)微生物的菌種選育菌種選育的原因：用微生物發(fā)酵方法生產(chǎn)藥物，首先要有一個良好的菌種。從自然界別離提到的菌種，由于生產(chǎn)能力低，往往不能滿足工業(yè)化的需要。采用種種措施來打破菌的正常代謝，使之失去調(diào)節(jié)控制，從而大量積累代謝產(chǎn)物，要到達(dá)此目的，可以進(jìn)行菌種選育。菌種選育的目的：改進(jìn)菌種的特性，使其符合工業(yè)化生產(chǎn)的要求。菌種選育的內(nèi)容：根據(jù)菌種自然變異而進(jìn)行的自然選育，以及用人工方法引起菌種變異或形成新的雜種，再按照工業(yè)生產(chǎn)的要求進(jìn)行篩選來獲得新的變種或雜種，這是當(dāng)前菌種選育的根本內(nèi)容。一、工業(yè)微生物的特點個體小種類多繁殖快分布廣代謝能力強(qiáng)易變異改造二、發(fā)酵工業(yè)常用微生物及要求1.發(fā)酵工業(yè)對菌種的要求原料廉價，生長迅速，目的產(chǎn)物產(chǎn)量高。易控制培養(yǎng)條件，發(fā)酵周期較短?？闺s菌和噬菌體的能力強(qiáng)。不易變異和退化，不產(chǎn)生任何有害物質(zhì)和毒素?？故删w和雜菌的能力強(qiáng)泡沫要少對前體物質(zhì)有耐受能力不是病原菌二、發(fā)酵工業(yè)中常用微生物菌種〔一〕細(xì)菌1、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)

分布廣，常存在于枯草、土壤等，一般為腐生菌；

在醬油、醬類和白酒制曲時，如果水分含量大，溫度較高，就容易造成枯草桿菌迅速繁殖；不僅消耗原料蛋白質(zhì)和淀粉，而且生成刺眼鼻的氨味，造成曲子發(fā)粘發(fā)臭，使制曲失敗。

能產(chǎn)生大量淀粉酶和蛋白酶AS1.393蛋白酶BF7658-淀粉酶2、大腸桿菌(Escherichiacoli)

可利用大腸桿菌制取天冬氨酸、蘇氨酸、纈氨酸等

大腸桿菌的谷氨酸脫羧酶在工業(yè)上被用來進(jìn)行谷氨酸的定量分析

基因工程的很好材料3、乳酸桿菌(Lactobacillussp.)

革蘭氏陽性，無芽孢，厭氧或兼性厭氧

可生產(chǎn)乳酸

干酪的成熟、乳脂的酸化和腌菜、泡菜制作4、棒狀桿菌(Corynebacterium)

以葡萄糖為原料發(fā)酵產(chǎn)生酸，是谷氨酸和其他氨基酸的高產(chǎn)菌

生產(chǎn)谷氨酸等

如北京棒桿菌AS1.299鈍齒棒桿菌AS1.5425、短桿菌(Brevibacterium)

氨基酸、核苷酸工業(yè)生產(chǎn)中常用的菌種，也是酶法合成生產(chǎn)輔酶A的菌種

〔二〕放線菌因其菌落呈放射狀而得名屬原核微生物類群，在自然界中分布很廣，尤其在有機(jī)質(zhì)豐富的微堿性土壤中較多。大多腐生，少數(shù)寄生。產(chǎn)生多種抗生素〔12000余種，60%左右來自放線菌〕，經(jīng)濟(jì)價值大1、鏈霉菌屬(Streptomyces)灰色鏈霉菌(Streptomycesgriseus)

生產(chǎn)鏈霉素金霉素鏈霉菌(Streptomycesaureofaciens)

在PDA培養(yǎng)基上生長時，基內(nèi)菌絲產(chǎn)生金黃色色素生產(chǎn)金霉素紅霉素鏈霉菌(Streptomyceserythreus)

產(chǎn)紅霉素龜裂鏈霉菌(Streptomycesrimosus)菌落灰白色，外表后期有皺折，呈龜裂狀生產(chǎn)土霉素2、小單胞菌屬(Micromonospora)

與一般放線菌不同，菌絲體長入培養(yǎng)基內(nèi)，不形成氣生菌絲，而在基內(nèi)菌絲體上長出孢子梗，其頂端生一個球形、橢圓形孢子。

菌落致密，與培養(yǎng)基緊密結(jié)合在一起，表面凸起，多崎嶇，疣狀；菌落常為橙黃色、紅色、深褐色、黑色和蘭色。

多種可產(chǎn)抗生素，如棘孢小單胞菌（M.echinospora）產(chǎn)慶大霉素3、諾卡氏菌屬(Norcadia)

一般無氣絲，基絲培養(yǎng)十幾小時形成橫隔，并斷裂成桿狀或球狀孢子。

菌落較小，邊緣多呈樹根毛狀。

生產(chǎn)利福霉素、蚊霉素等〔三〕酵母菌單細(xì)胞真核，主分布于含糖質(zhì)較多的偏酸性環(huán)境中，如水果、蔬菜、花蜜和植物葉子上，以及果園土壤中。1、啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)根據(jù)長與寬的比例，分三組：第一組長寬比為1～2細(xì)胞多為圓形、卵圓形；主要供生產(chǎn)啤酒、白酒和酒精及面包第二組長寬比為2多供生產(chǎn)葡萄酒、果酒用第三組長寬比大于2耐高滲透壓，供發(fā)酵甘蔗糖蜜生產(chǎn)酒精用

啤酒酵母的應(yīng)用非常廣，常用于傳統(tǒng)的發(fā)酵行業(yè)，如啤酒、白酒、果酒、酒精、藥用酵母、面包制作，故又稱釀酒酵母。

近年來，利用啤酒酵母提取核酸、麥角固醇、細(xì)胞色素C、凝血質(zhì)和輔酶A等；生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白(SCP)可食用、藥用和作為飼料；它的轉(zhuǎn)化酶可用于轉(zhuǎn)化蔗糖，制造酒心巧克力。2、球擬酵母(Toruiopsis)

此屬酵母有些種能產(chǎn)生不同比例的甘油、赤蘚糖、阿拉伯糖；有的能利用烴類生產(chǎn)蛋白質(zhì)。3、假絲酵母(Candida)

能形成假絲，液體培養(yǎng)時能形成浮膜

可生產(chǎn)SCP、甘油、脂肪酶4、紅酵母(Rhodotorula)

有明顯的紅色或黃色色素，很多種因生莢膜而形成粘質(zhì)狀菌落

可由菌體提取大量脂肪、-胡蘿卜素5、畢赤氏酵母(Pichia)

能利用石油或農(nóng)副產(chǎn)品及工業(yè)廢料產(chǎn)生菌體蛋白，有些菌株能生產(chǎn)麥角固醇、蘋果酸、磷酸甘露聚糖

近年來其在基因工程中的作用日益得到重視〔四〕霉菌1、根霉(Rhizopus)米根霉(Rhizopusoryzae)

淀粉酶活力極強(qiáng)，多作糖化酶使用；又由于具有較強(qiáng)的蛋白質(zhì)分解能力，也可用于制造腐乳。華根霉(Rhizopuschinentis)

是釀酒所必須的重要霉菌，也是酸性蛋白酶和腐乳生產(chǎn)中的重要菌種。2、毛霉(Mucor)魯氏毛霉(Mucorrouxianus)從我國小曲中別離出來；能糖化淀粉且能生成少量酒精；能產(chǎn)生蛋白酶，有分解大豆蛋白的能力，常用來制作腐乳總狀毛霉(Mucorracemosus)

是毛霉中分布最廣的一種，幾乎在各地土壤中、一些生霉的材料上、空氣中都能找到；酒曲中常見

可制作豆豉3、曲霉(Aspergillus)米曲霉(Aspergillusoryzae)

有較強(qiáng)的蛋白分解能力，同時又具有糖化能力釀酒中的糖化菌；蛋白酶和淀粉酶的生產(chǎn)菌黑曲霉(Aspergillusniger)

具有多種強(qiáng)大的酶系，如淀粉酶、蛋白酶、果膠酶、纖維素酶和葡萄糖氧化酶等；

還能產(chǎn)生多種有機(jī)酸，如抗壞血酸、檸檬酸、葡萄糖酸和沒食子酸等

是生產(chǎn)檸檬酸和葡萄糖酸的重要菌種4、青霉(Penicillum)產(chǎn)黃青霉(Penicillumchrysogenum)

生產(chǎn)青霉素，也可用來生產(chǎn)葡萄糖氧化酶、葡萄糖酸、檸檬酸和抗壞血酸婁地青霉(Penicillumroqueforti)

屬不對稱青霉組，具有分解油脂和蛋白質(zhì)的能力，可用于制造干酪；該菌孢子能將甘油三酯氧化為甲基酮〔五〕其它微生物1.擔(dān)子菌〔basidiomycetes〕即菇類〔mushroom〕2.藻類〔alga〕幾種菌落三發(fā)酵工業(yè)微生物菌種的別離和選育菌種選育的原因：用微生物發(fā)酵方法生產(chǎn)藥物，首先要有一個良好的菌種。從自然界別離得到的菌種，由于生產(chǎn)能力低，往往不能滿足工業(yè)化的需要。采用種種措施來打破菌的正常代謝，使之失去調(diào)節(jié)控制，從而大量積累代謝產(chǎn)物，要到達(dá)此目的，可以進(jìn)行菌種選育。菌種選育的目的：改進(jìn)菌種的特性，使其符合工業(yè)化生產(chǎn)的要求。菌種選育的內(nèi)容：根據(jù)菌種自然變異而進(jìn)行的自然選育，以及用人工方法引起菌種變異或形成新的雜種，再按照工業(yè)生產(chǎn)的要求進(jìn)行篩選來獲得新的變種或雜種，這是當(dāng)前菌種選育的根本內(nèi)容?！惨弧澄⑸锞N的別離與篩選工作程序發(fā)酵工業(yè)上使用的微生物菌種，最初都是從自然界中別離篩選出來的。別離與篩選菌種的具體做法一般分4個步驟：樣品采集增殖培養(yǎng)純種分離生產(chǎn)性能測定〔1〕含微生物樣品的采集較復(fù)雜；應(yīng)根據(jù)別離目的靈活掌握土壤〔豐富、5-25cm、土質(zhì)、酸堿度、植被狀況、地理條件、季節(jié)〕食品、海水、動物、植物、極端環(huán)境根據(jù)微生物的營養(yǎng)類型采樣森林土中有相當(dāng)多枯枝落葉和腐爛的木頭，富含纖維素，適合利用纖維素作碳源的纖維素酶產(chǎn)生菌生長。肉類加工廠附近、飯店排污溝，易別離到蛋白酶和脂肪酶產(chǎn)生菌。面粉加工廠等場所易別離到產(chǎn)淀粉酶、糖化酶的菌根據(jù)微生物的生理特性采樣篩選產(chǎn)低溫酶的微生物，可從冰窖、南極、深海等采樣別離耐高滲透壓酵母菌，可到甜果、蜜餞、甘蔗渣堆積處采樣〔2〕含微生物樣品的增殖培養(yǎng)增殖(enrichment)培養(yǎng)是在目的微生物含量較少時，根據(jù)微生物的生理特點，設(shè)計一種選擇性培養(yǎng)基，創(chuàng)造有利的生長條件，使目的微生物在最適的環(huán)境下迅速地生長繁殖，數(shù)量增加，由原來自然條件下的劣勢種變成人工環(huán)境下的優(yōu)勢種，以利別離到所需的菌株。其要領(lǐng)是提供一些有利于所需菌株生長或不利于其他菌型生長的條件，例如，供給特殊的基質(zhì)或參加某些抑制劑?？刂蒲蹩蓪⒑醚跷⑸锖蛥捬跷⑸锓珠_；高溫下培養(yǎng)可將嗜熱微生物和非嗜熱微生物分開；控制pH可別離嗜酸或嗜堿微生物；高糖或高鹽培養(yǎng)基可別離耐高滲透壓微生物；在別離培養(yǎng)中參加抗生素或某試劑可增加選擇性如別離真菌可在土豆培養(yǎng)基中參加鏈霉素；別離細(xì)菌或放線菌可在培養(yǎng)基中參加制霉菌素等

需注意，所需菌型生長的結(jié)果有時會改變培養(yǎng)基的性質(zhì)，從而改變選擇壓力。

重復(fù)移植幾次后接種少量已富集的培養(yǎng)物到固體培養(yǎng)基上。

移植時間是關(guān)鍵，應(yīng)在所需菌種確已占優(yōu)勢的情況下進(jìn)行。1.施加選擇性壓力別離法透明圈法別離水解酶產(chǎn)生菌時較多采用，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、核酸酶等；在平板培養(yǎng)基中參加溶解性較差的底物，使培養(yǎng)基混濁；能分解底物的微生物便會在菌落周圍產(chǎn)生透明圈，圈的大小初步反響菌株利用底物的能力。土壤經(jīng)巴氏消毒，以減少不產(chǎn)芽孢的微生物；然后鋪在pH8-9的瓊脂培養(yǎng)基〔含有均勻的不溶性蛋白質(zhì)〕外表；堿性蛋白酶產(chǎn)生菌能消化平板上的不溶性蛋白質(zhì)，產(chǎn)生一透明圈。例如用此法別離產(chǎn)生堿性蛋白酶的芽孢桿菌別離某種產(chǎn)生有機(jī)酸的菌株時，也通常采用透明圈法初篩在選擇培養(yǎng)基中參加碳酸鈣，使平板呈混濁狀，產(chǎn)酸菌能夠把菌落周圍的碳酸鈣水解，形成清晰的透明圈

透明圈的大小不能完全作為選擇高產(chǎn)菌的依據(jù)，因為在深層培養(yǎng)中的產(chǎn)酶單位與平板上圈的大小之間并不完全成正比。

但作為初篩的手段是有意義的1、抗生素產(chǎn)生菌的別離抑菌圈法、擴(kuò)散法、生物自顯影法等試驗菌的選擇是關(guān)鍵〔關(guān)系到靈敏度、活性、抗菌譜等〕采用聯(lián)合試驗菌〔枯草桿菌和綠色產(chǎn)色鏈霉菌或巴氏梭狀芽孢桿菌〕別離到黃霉素2、抗腫瘤藥物產(chǎn)生菌的別離臨床上有效的抗腫瘤藥物大多是直接作用于核酸或抑制核酸生物合成的物質(zhì)大局部具有抗菌或抗真菌的活性現(xiàn)開展出利用微生物篩選作用于DNA的抗腫瘤藥物的方法，如生化誘導(dǎo)分析法3、酶抑制劑產(chǎn)生菌的別離

某些酶與病理相關(guān)

如果某種化合物能在體外抑制某關(guān)鍵的人體酶，它就可能在體內(nèi)有藥理作用

選擇與生理和病理關(guān)系明確的酶作為靶酶

靶區(qū)靶酶抗高血壓血管緊張素轉(zhuǎn)移酶抗糖尿病-淀粉酶、蔗糖酶等抗血脂癥縮合酶抗組氨組氨酸脫羧酶、組氨-N-甲基轉(zhuǎn)移酶4、生長因子產(chǎn)生菌的別離通過觀察別離菌能否促進(jìn)營養(yǎng)缺陷型菌株的生長，來檢測生長因子產(chǎn)生菌。別離培養(yǎng)基上培養(yǎng)被殺死的菌落周圍有無檢測菌的生長圈影印到能支持生長因子產(chǎn)生菌生長的培養(yǎng)基上Uv照射殺死菌落鋪上一層含相應(yīng)生長因子缺陷型菌株三、純種別離〔1〕劃線法：簡單、快捷?！?〕稀釋法：菌落單一均勻。固體培養(yǎng)基四區(qū)劃法接種法步驟一輕觸營養(yǎng)平板上無菌的瓊脂處冷卻

步驟二以接種針輕觸菌落，使接種針上沾有細(xì)菌。

步驟三更換一個新的無菌營養(yǎng)平板

步驟四將接種針上的細(xì)菌劃于一個新的營養(yǎng)平板上。此為第一菌區(qū)。步驟五步驟六由第五步驟的第一區(qū)中劃出第二區(qū)，如右上圖。步驟七重復(fù)第六以及第七步驟，由第七步驟的第二區(qū)中劃出第三區(qū)，如右上圖。

步驟八重復(fù)第六以及第七步驟，由第八步驟的第三區(qū)中劃出第四區(qū)，劃滿剩下的空間。完成后的營養(yǎng)平板，如右上圖。步驟九在營養(yǎng)平板上貼好標(biāo)簽，標(biāo)示好接種日期、操作者姓名、菌種學(xué)名以及培養(yǎng)基名稱。步驟十固體培養(yǎng)基的稀釋涂抹接種法需要使用的儀器——震蕩機(jī)

吸取準(zhǔn)備好欲稀釋的菌液吸取充分均勻后的菌液

將試管于震蕩機(jī)上，使菌液混合均勻取出試管中的第一次十倍稀釋菌液1mL，參加另一個新的含9mL無菌水的試管中。重復(fù)此步驟直至所需要的稀釋濃度。從最后稀釋菌液中吸取0.1mL菌液，置入準(zhǔn)備好的無菌瓊脂內(nèi)。將三角玻璃棒浸于酒精中

使用玻璃棒將菌液均勻涂布開來，將培養(yǎng)皿置于恒溫培養(yǎng)箱中隔天觀察菌落數(shù)目，再依照稀釋倍數(shù)推算出菌液濃度。

二微生物菌種的選育

應(yīng)用微生物遺傳和變異理論，用人工方法(或自然)造成變異，再經(jīng)過篩選以得到人們所需菌種的過程。

菌種選育的目的是為了不斷提高發(fā)酵工業(yè)產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量，增加新產(chǎn)品和適應(yīng)工藝改革的要求。菌種選育的方向是選育“吃粗糧〞、耐高溫、生長快、代謝旺、產(chǎn)量高、質(zhì)量好、無毒性的優(yōu)良菌株。一、自然選育

在生產(chǎn)過程中，不經(jīng)過人工處理，利用菌種的自發(fā)突變而進(jìn)行菌種篩選的過程叫自然選育。

自發(fā)突變(spontaneousmutation)，也稱自然突變，指某些微生物在沒有人工參與下所發(fā)生的那些突變，但這決不意味著這種突變是沒有原因的。一般認(rèn)為引起自然突變有兩個原因：即多因素低劑量的誘變效應(yīng)和互變異構(gòu)效應(yīng)。多因素低劑量的誘變效應(yīng)是指自然突變實際上是由一些原因不詳?shù)牡蛣┝空T變因素引起的長期綜合效應(yīng)，例如充滿宇宙空間的各種短波輻射、自然界中普遍存在的一些低濃度誘變物質(zhì)以及微生物自身代謝活動中所產(chǎn)生的一些誘變物質(zhì)〔如過氧化氫等〕自然狀態(tài)下，堿基對發(fā)生自然突變的機(jī)率為10-8～10-9自然突變有兩種情況：一種是我們生產(chǎn)上所不希望看到的，表現(xiàn)為菌種退化而導(dǎo)致目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量或質(zhì)量下降，這種突變成為負(fù)突變。另一種是我們生產(chǎn)上希望看到的，對生產(chǎn)有利，這種突變成為正突變。制備單孢子〔單細(xì)胞〕懸液適當(dāng)稀釋在固體平板上別離挑取局部單菌落進(jìn)行生產(chǎn)能力測定經(jīng)反復(fù)篩選以確定生產(chǎn)能力更高的菌株替代原來的菌株自然選育的一般程序：自然選育簡單易行，可以到達(dá)純化菌種、防止菌種衰退、穩(wěn)定生產(chǎn)、提高產(chǎn)量等目的。自然選育的最大缺點是效率低、進(jìn)展慢，很難使生產(chǎn)水平大幅度提高。2、誘變育種

誘變育種就是人為地利用物理或化學(xué)等因素，使誘變對象細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)發(fā)生變化，引起突變，并通過適當(dāng)?shù)暮Y選方法獲得所需的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菌種的育種方法。誘變育種不僅可以提高菌種的生產(chǎn)能力，且可改進(jìn)產(chǎn)品質(zhì)量、擴(kuò)大品種和簡化生產(chǎn)工藝。目前發(fā)酵工業(yè)中應(yīng)用的生產(chǎn)菌株大局部是誘變育種得來的。以青霉素為例，1943年開始生產(chǎn)時的效價僅為20U/ml，通過屢次誘變育種現(xiàn)已達(dá)50000-100000U/ml。雖然遺傳工程等新的育種方法迅速開展，但誘變育種仍是目前廣泛使用的育種手段。一〕誘變育種的一般步驟原始菌株（出發(fā)菌株）細(xì)胞或孢子懸液制備活細(xì)胞計數(shù)誘變劑處理活細(xì)胞計數(shù)中間培養(yǎng)突變株分離初篩復(fù)篩生產(chǎn)性能試驗誘變預(yù)備處理誘變育種的工作程序1、出發(fā)菌株的選擇選擇時注意以下幾點：1〕選擇對誘變劑敏感性強(qiáng)、變異幅度大的菌株作為出發(fā)菌株。2〕最好選用已經(jīng)過生產(chǎn)選育的自發(fā)突變菌株。3〕采用具有有利性狀的菌株作為親本，如生長速度快，營養(yǎng)要求低等。4〕由于有些菌株在發(fā)生某一變異后會對其它誘變因素的敏感性提高，故有時可考慮選擇已發(fā)生其它變異的菌株作為出發(fā)菌株。例如，在金霉素生產(chǎn)菌的誘變中，失去〔黃色〕色素的變異菌株作為出發(fā)菌株那么產(chǎn)量會不斷提高。2、單細(xì)胞〔或單孢子〕懸液制備一般均采用生理狀態(tài)一致的單細(xì)胞或單孢子懸液進(jìn)行誘變處理。因為1〕分散狀態(tài)的細(xì)胞可均勻地接觸誘變劑2〕可防止長出不純的菌落。處理前，細(xì)胞應(yīng)盡可能到達(dá)同步生長狀態(tài)細(xì)胞菌齡一般在對數(shù)期，

霉菌的菌絲一般是多核的，所以對霉菌的處理一般應(yīng)采用孢子懸浮液。3、誘變劑及使用劑量的選擇凡能引起生物體遺傳物質(zhì)發(fā)生變異的因素，統(tǒng)稱誘變劑。如紫外線、X-射線、-射線、快中子、超聲波等誘變劑物理誘變劑化學(xué)誘變劑紫外線(Uv)

使用歷史較久、廉價、危險性小、效果好，應(yīng)用較廣

對誘變最有效的波長是260nm左右(253-265nm)

作用機(jī)制主要是形成胸腺嘧啶二聚體以改變DNA生物活性,造成菌體變異甚至死亡.氮芥

氮芥為極易揮發(fā)的油狀物，它的鹽酸鹽是白色粉末，一般使用的是其鹽酸鹽。

應(yīng)用時先使氮芥鹽酸鹽與碳酸氫鈉其作用，釋放出氮芥子氣，再與細(xì)胞起作用而造成變異。

氮芥的誘變機(jī)制是它能引起染色體畸變。是被使用得最早的一種誘變劑。亞硝酸

常用的有效誘變劑，其誘變作用主要是脫去堿基中的氨基。亞硝酸A——H〔次黃嘌呤〕C——UG——X〔黃嘌呤〕

亞硝酸很不穩(wěn)定，容易分解成水和硝酸酐，硝酸酐繼續(xù)分解放出NO和NO2。所以，可在臨用前將亞硝酸鈉放在pH4.5的醋酸緩沖液中，使先生成亞硝酸然后再使用。亞硝基胍(NTG)劑量確定誘變劑后，誘變劑劑量的選擇也是育種工作的一個關(guān)鍵問題。對一般微生物而言，誘變率往往隨誘變劑劑量的增高而增高，但到達(dá)一定程度后，再提高劑量，反而會使誘變率下降。

目前的處理劑量已從以前采用的死亡率90-99.9%降低到70-80%，甚至更低的劑量，特別是對于經(jīng)過一再誘變的高產(chǎn)菌株。

劑量似乎也不宜過低，因為在使用高劑量誘變時，除個別核被誘發(fā)變異外，還可以使其它的核破壞致死，最終能形成較純的變異菌落；另外，高劑量可能引起遺傳物質(zhì)的巨大損傷，產(chǎn)生回復(fù)突變少，促使變異后菌株的穩(wěn)定。凡既能增加變異幅度，又能促使變異向正變范圍移動的劑量就是適宜劑量。處理方法單一誘變劑處理復(fù)合處理1）兩種或多種誘變劑先后使用2）同一誘變劑重復(fù)處理3）兩種或多種誘變劑同時使用菌種單獨處理誘變劑突變率（%）復(fù)合處理誘變劑突變率（%）土曲霉紫外線X-射線21.319.7紫外線+X-射線42.8土曲霉氮芥（0.1%）紫外線不明顯4.7氮芥+紫外線11.0鏈霉菌紫外線-射線31.035.0紫外線+-射線43.6金色鏈霉菌二乙烯三胺硫酸二乙酯紫外線6.061.7812.5二乙烯三胺+紫外線硫酸二乙酯+紫外線26.635.9誘變劑的復(fù)合處理及其協(xié)同效應(yīng)5、變異菌株的篩選由于經(jīng)誘變處理后提高產(chǎn)量的變異株仍屬少數(shù)，所以必須經(jīng)過大量的篩選工作，才能得到需要的菌株。

初篩和復(fù)篩

在初篩過程中，一般采用觀察初篩菌落在平板上的生理效應(yīng)所呈現(xiàn)的變色圈、透明圈、生長圈或抑菌圈的大小來進(jìn)行初步測定。初篩

要求迅速地從大量菌株中挑選出較好的一些菌，主要應(yīng)著眼于盡量擴(kuò)大挑選范圍。例如，測定突變株淀粉酶活力，可把待測菌株的培養(yǎng)液以相同大小和條件浸泡的濾紙片點植于淀粉平板上，經(jīng)培養(yǎng)后滴加碘液再仔細(xì)觀察并測定其透明圈的大小。局部微生物菌株經(jīng)過誘變處理后，變異菌株的菌落形態(tài)與生理特性、生產(chǎn)性能變化有一定的相關(guān)性，可在初篩時加以利用。赤霉素產(chǎn)生菌色素暗紅加深，產(chǎn)量上升紅霉素產(chǎn)生菌有顏色產(chǎn)量下降灰黃霉素產(chǎn)生菌野生菌株高產(chǎn)菌株堿性脂肪酶產(chǎn)生菌野生菌株高產(chǎn)變異株復(fù)篩

在初篩縮小了的范圍中選出產(chǎn)量最高的1-2個菌株，主要著眼于在接近生產(chǎn)條件的情況下精確地測定出菌株的生產(chǎn)性狀。

復(fù)篩一般是將初篩所得到的菌株接種到三角瓶中做搖瓶培養(yǎng)，然后對其培養(yǎng)液進(jìn)行定量分析測試。四、原生質(zhì)體融合育種原生質(zhì)體融合〔protoplastfusion〕育種是雜交育種〔基因重組〕育種的一種特殊方式一〕原生質(zhì)體融合的概念