《RNA干涉及其應用》課件

RNAi及其應用實例

1精選課件ppt2006NobelPrize

生理學（醫(yī)學獎)RNAinterference“沉默”是金2精選課件ppt后基因組研究焦點：基因功能研究抑制基因表達觀察功能變化KnockOut法Antisense法Ribozyme法RNAi法3精選課件ppt概念：RNAinterference（RNAi）與靶基因序列同源的雙鏈RNA所誘導一種序列特異性的轉錄后基因沉默現(xiàn)象。4精選課件pptRNAi發(fā)現(xiàn)歷程：1990年，曾有科學家給矮牽?；ú迦胍环N催生紅色素的基因，希望能夠讓花朵更鮮艷。但意想不到的事發(fā)生了：矮牽?；ㄍ耆噬ò曜兂闪税咨?！??5精選課件ppt1995年

康奈爾大學Guo等在對線蟲C.elegans的研究中，應用正義鏈RNA作為對照，研究par-1基因的表達，意外的發(fā)現(xiàn)，正義鏈RNA與反義鏈RNA同樣能夠抑制目的基因的表達。

6精選課件ppt1998年，AndrewFire等首次將正義鏈反義鏈RNA混合注入線蟲C.elegans中，觀察到更強的基因表達抑制。首次提出了RNAinterference的概念。Acontrol:notstainedB:wtC:wt+antisenseRNAD:wt+dsRNAMex-3mRNAdetectioninembryosbyinsituhybridization7精選課件pptRNAi機制DicerRISC堿基互補酶解8精選課件pptshort-interferingRNA加工長鏈dsRNA形成21-23nt小片段3427212016Tuschl,20019精選課件ppt

DicercontainstwoRNAseIIIdomainssiRNAslongdsRNA10精選課件pptRISC:RNA-InducedSilencingComplexExonucleaseHomologysearchactivityEndonucleaseHelicase5’3’TargetmRNAOH3’5’P形成RISC復合物，降解目的mRNA11精選課件pptRNAi的生物學意義：一種古老、保守而又及其重要的遺傳學行為。生物體在長期的進化過程中對異?；蚧顒拥谋O(jiān)控和防御,有學者稱之為“基因組水平的免疫系統(tǒng)”。一種抗病毒感染機制。12精選課件ppt與其他反基因技術的比較：優(yōu)點：1、特異性好；2、抑制效率高；3、操作相對簡單，實驗周期短；缺點：1、靶點選擇的不確定性；2、核酸的不穩(wěn)定性，dsRNA引入細胞的常見問題；3、脫靶效應；4、生物安全性（質粒，病毒等）。13精選課件pptRNAi的應用：

功能基因組學藥物靶篩選和驗證細胞信號傳導通路分析基因治療的新策略14精選課件ppt基因治療方面的應用抗腫瘤策略——應用RNAi技術抑制腫瘤細胞（如肝癌細胞、膽管癌細胞等）中血管生長因子如血管生成素如angi1、angi2、angi3及VEGF等或其受體的表達，以及抑制腫瘤細胞中如癌基因bcl2、RAS、Tp53等突變基因及其蛋白的表達而不影響非突變基因的表達，可達到很好的抗腫瘤生長及抗腫瘤轉移的目的。15精選課件ppt抗器官移植排斥反應——細胞間粘附分子-1（ICAM-1）是重要的介導細胞粘附和T細胞激活的分子，應用與ICAM-1基因序列特異的siRNA阻斷ICAM-1mRNA和蛋白的表達，可以明顯降低大鼠同種移植心的移植物血管病的發(fā)生的程度和缺血再灌注損傷。16精選課件ppt抗病毒策略：

最早用于HIV研究，被Science評為2002年年度突破。

斯坦福醫(yī)學院的研究群，把dsRNA放進小老鼠的肝細胞，dsRNA被小老鼠體內的核酸酶分解成許多siRNA。研究發(fā)現(xiàn)siRNA具有高度專一性，會與小老鼠體內的丙型肝炎病毒的mRNA相結合，使mRNA分解并失去轉譯蛋白質的功能。斯坦福醫(yī)學院運用此技術來治療丙型肝炎的研究，已從體外試管實驗階段推進至體內的動物實驗。且在小老鼠身上，看到丙型肝炎病毒被阻斷的明顯效果。17精選課件ppt2004年，美國FDA批準經(jīng)過修飾的第一個RNAi藥物Bevasiranib

進行臨床新藥試驗，用于治療與年齡相關的黃斑退行性改變。

RNAi臨床治療的前景有賴于疾病的發(fā)生發(fā)展與特定基因的關系研究

功能基因組學18精選課件ppt利用siRNA治療疾病需要解決幾個問題：（1）導入問題，使用高效載體傳遞siRNA；（2）和給藥方式，因為RNA容易被降解，如何提高siRNA在體內的穩(wěn)定性；（3）高選擇性。如何靶向特定細胞而不影響其他細胞。19精選課件pptRNAi方法在哺乳動物細胞中的應用得益于RNAi機制的研究，小分子干擾RNA（shortinterferingRNA，siRNA)概念的引入。

20精選課件ppt哺乳動物細胞中的RNAi現(xiàn)象長鏈dsRNA所有基因表達下降RNAi現(xiàn)象PKR,RNaseL

活性化X干擾素21精選課件pptRNAi過程的功能單元：siRNA19ntduplex2nt3’overhangs22精選課件pptRNAi方法的核心步驟——siRNA的設計：

1、從轉錄本（mRNA）的AUG起始密碼下游75bp開始，尋找“AA”二連序列，并記下其后面的19個堿基序列，作為潛在的siRNA靶位點。有研究結果顯示GC含量在30%—60%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更為有效。靶點的選擇往往是試驗性的。

23精選課件ppt2、將候選的靶點序列和相應的基因組數(shù)據(jù)庫等進行BLAST比較。3、選出合適的目標序列進行合成。通常一個基因需要設計多個靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。24精選課件ppt提供RNAi在線技術支持的公司（網(wǎng)站）25精選課件pptsiRNA制備常用的五種方法：1、化學合成；2、體外轉錄；3、長片斷dsRNAs經(jīng)RNaseIII類降解(e.g.Dicer,E.coli,RNaseIII)；4、siRNA表達載體在細胞中表達形成shRNAs；5、PCR制備的siRNA表達框在細胞中表達。26精選課件ppt一、化學合成：1、高質量，高純度。2、高成本適用于已經(jīng)驗證過抑制效率的靶點序列不適于篩選靶點序列27精選課件ppt二、體外轉錄：1、成本適中2、省時適用于篩選靶點序列不適用于長期的研究或者針對某個特定靶點序列的大量研究應用T7RNApolymerase體外轉錄方法常需要RNA的起始兩個核苷酸是GGorGA，這樣合成效率才有保障。(Milligan1987）28精選課件ppt三、長片斷dsRNA酶解法：200-1000nt的dsRNA體外被RnaseⅢ家族成員切割成siRNA不需要驗證篩選多個靶點序列適用于LOF表型分析不適用于長期研究或者特定siRNA序列的研究29精選課件ppt四、siRNA表達質粒或者病毒載體在細胞中表達siRNAsRNApolymeraseIII(polIII):humanU6promotersmouseU6promotersthehumanH1promoter30精選課件ppt商品化載體的siRNA策略示意圖31精選課件ppt載體介導的細胞內表達siRNA方法的特點1、操作簡便，穩(wěn)定性好;2、siRNA表達載體一旦構建成功，可以無限制的應用于研究;3、可能建立可以調節(jié)表達的系統(tǒng);4、受轉染等因素的影響比較大。適用于長期的對于某個基因的研究，尤其是帶有篩選標記的載體，能夠用于構建特定基因缺陷（knockdown）的細胞株32精選課件ppt五、siRNAExpressionCassettes(SECs)方法快速、不需要克隆測序等步驟適用于篩選多個候選靶點序列的抑制效率33精選課件pptRNAi實例：

Targetgene：c-myc

查找靶基因mRNA利用網(wǎng)絡在線支持，尋找siRNA序列根據(jù)目的選擇實現(xiàn)RNAi的策略：推薦載體法。根據(jù)查找的siRNA序列，合成長鏈oligo構建載體轉染檢測效應（包括干擾效應和生物學效應）34精選課件ppt2、/

3、or

1、檢索文獻獲取有實驗證明有效的靶點序列（核對）目的基因mRNA獲?。?5精選課件ppt36精選課件ppt37精選課件ppt38精選課件ppt39精選課件ppt40精選課件ppt41精選課件ppt42精選課件ppt43精選課件ppt44精選課件ppt45精選課件ppt尋找siRNA序列/ssl-bin/app/rnai

支持accessionnumber或者序列直接輸入?yún)?shù)設計全面輸出經(jīng)過篩選的candidatetarget（BLAST）推薦★★★★★/techlib/misc/siRNA_finder.html

最全面的RNA實驗相關網(wǎng)站有商品化的各類載體獲得siRNAtarget需要手工BLAST輸出直接可遞交公司合成的長鏈oligo推薦★★★★46精選課件ppt利用生物學軟件組配長鏈oligo，（合成單鏈DNA（直接帶有4個bp的酶切位點粘性末端)；

載體構建：