制備單克隆抗體的基本流程及原理

制備單克隆抗體的基本流程及原理單克隆抗體（mAb）源于單一B細(xì)胞克隆，具有高度的均一性和特異性，僅針對(duì)某一特定抗原表位。在生物醫(yī)學(xué)研究、疾病診斷以及某些疾病治療（如傳染病和癌癥）中，單克隆抗體發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。目前，制備單克隆抗體的主流技術(shù)包括雜交瘤技術(shù)、噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)和單個(gè)B細(xì)胞技術(shù)。雜交瘤技術(shù)通過融合免疫小鼠的B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞，篩選出能夠特異性分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞，進(jìn)而生產(chǎn)并純化得到單克隆抗體。噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)則利用基因工程技術(shù)，將抗體基因與噬菌體基因相連接，使抗體以融合蛋白的形式呈現(xiàn)在噬菌體表面，通過與靶蛋白的結(jié)合，篩選出具有特定親和力的噬菌體展示抗體。而單個(gè)B細(xì)胞技術(shù)則基于每個(gè)B細(xì)胞僅含有一對(duì)功能性的重鏈和輕鏈，每個(gè)B細(xì)胞僅產(chǎn)生一種特異性抗體的特性，直接從單個(gè)B細(xì)胞中擴(kuò)增抗體基因，從而獲得單克隆抗體。制備單克隆抗體的基本流程：1）抗原制備一般來(lái)說，抗原可以是蛋白（天然蛋白或重組蛋白）、多肽、小分子等。依據(jù)需求選擇和制備合適的免疫原對(duì)于抗體開發(fā)至關(guān)重要。義翹神州在蛋白抗原、多肽抗原制備積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，可提供專業(yè)的抗原制備服務(wù)。另外，義翹神州還成功制備出6000多種重組蛋白產(chǎn)品，可作為抗原用于動(dòng)物免疫和抗體篩選，歡迎訂購(gòu)。2）動(dòng)物免疫通常選用Balb/c小鼠作為免疫動(dòng)物，根據(jù)抗原的特性制定免疫方案，包括免疫抗原純度、抗原量、免疫方法和途徑等。免疫方法一般有常規(guī)免疫法、脾內(nèi)一次性免疫法、短程免疫法和體外免疫法等，免疫途徑主要有皮下注射、腹腔注射和靜脈注射。脾內(nèi)一次性免疫法具有用量少、免疫程序短、不加佐劑且所得單克隆抗體的特異性較高等特點(diǎn)。常規(guī)免疫周期如下：第一次免疫（抗原+弗氏完全佐劑，皮下注射）、第二次免疫（抗原+弗氏不完全佐劑，皮下注射）、第三次免疫（抗原+不加佐劑，皮下或靜脈注射）、第四次免疫（抗原+不加佐劑，靜脈注射）。3）細(xì)胞融合細(xì)胞融合前準(zhǔn)備：脾淋巴細(xì)胞制備：取已經(jīng)免疫的Balb/c小鼠的脾臟，制備淋巴細(xì)胞，通常每只小鼠可得1x10^8-2.5x10^8個(gè)脾細(xì)胞；同時(shí)摘除眼球采血，并分離血清作為抗體檢測(cè)時(shí)的陽(yáng)性對(duì)照血清。骨髓瘤細(xì)胞制備：骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)該和免疫動(dòng)物屬于同一品系，便于細(xì)胞融合以及產(chǎn)生大量Ab。融合前骨髓瘤細(xì)胞維持的方式，對(duì)成功得到雜交瘤非常重要。目的是使骨髓瘤細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的時(shí)間盡可能長(zhǎng)，融合前不能少于1周；凍存的細(xì)胞在復(fù)蘇后要生長(zhǎng)2周才能處于適合于融合的狀態(tài)。飼養(yǎng)細(xì)胞：常用的飼養(yǎng)細(xì)胞有胸腺細(xì)胞、正常脾細(xì)胞和腹腔巨噬細(xì)胞。飼養(yǎng)細(xì)胞促進(jìn)雜交瘤細(xì)胞增殖的機(jī)制可能是釋放非種屬特異性的生長(zhǎng)刺激因子，為雜交瘤細(xì)胞提供必要的生長(zhǎng)條件；也可能是滿足新生雜交瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞密度的依賴性。細(xì)胞融合：細(xì)胞融合方法有病毒介導(dǎo)的細(xì)胞融合、聚乙二醇（PEG）介導(dǎo)細(xì)胞融合、電融合。PEG融合相鄰骨髓瘤和/或抗體分泌細(xì)胞的質(zhì)膜，形成具有兩個(gè)或更多核的單細(xì)胞。異核體保留這些核，直到核膜在有絲分裂前溶解。電融合通過施加脈沖電場(chǎng)連接相鄰細(xì)胞的膜。電融合比PEG更加有效，結(jié)果具有重現(xiàn)性。4）雜交瘤篩選以及單克隆鑒定骨髓瘤細(xì)胞和脾細(xì)胞融合之后，由于細(xì)胞融合是隨機(jī)的，因此要利用HAT培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞。骨髓瘤細(xì)胞缺乏次黃嘌呤－鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶（HGPRT），對(duì)氨蝶呤鈉敏感，在HAT選擇培養(yǎng)液中不能生長(zhǎng)；免疫脾細(xì)胞雖然有HGPRT，但不能在體外無(wú)限繁殖。因此只有融合的雜交瘤細(xì)胞，才能在HAT選擇培養(yǎng)液中無(wú)限繁殖。得到融合的雜交瘤細(xì)胞后，需要進(jìn)一步篩選特異性抗體。將融合的細(xì)胞進(jìn)行充分有限稀釋，使分配到培養(yǎng)板的每一孔中的細(xì)胞數(shù)在0至數(shù)個(gè)細(xì)胞之間（30%的孔為0才能保證每個(gè)孔中是單個(gè)細(xì)胞），培養(yǎng)后取上清液用ELISA法選出抗體高分泌性的細(xì)胞，這一過程常被稱作克隆化。將這些陽(yáng)性細(xì)胞再進(jìn)行克隆化，應(yīng)用特異性抗原包被的ELISA找出針對(duì)目標(biāo)抗原的抗體陽(yáng)性細(xì)胞株，增殖后進(jìn)行凍存、體外培養(yǎng)或動(dòng)物腹水培養(yǎng)。5）單克隆抗體大量制備利用雜交瘤細(xì)胞大規(guī)模制備單克隆抗體主要有兩種方式：體外培養(yǎng)法和腹水制備法。體外培養(yǎng)可以采用單層細(xì)胞培養(yǎng)的形式，也可以采用懸浮培養(yǎng)的形式。單層細(xì)胞培養(yǎng)法是各個(gè)實(shí)驗(yàn)室最常用的，是將雜交瘤細(xì)胞加入培養(yǎng)瓶中，用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞濃度以1.0X10^6~2.0X10^6個(gè)/mL為宜，然后收集培養(yǎng)上清液。如果想在體外高效率地大量制備單克隆抗體，就必須高密度培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，充分利用培養(yǎng)基的立體空間。單位體積內(nèi)細(xì)胞數(shù)量越多，產(chǎn)生的單克隆抗體就越多，濃度就越高，產(chǎn)量就越大。義翹神州提供雜交瘤體外培養(yǎng)抗體生產(chǎn)服務(wù)，成功率>99%，可采用低血清或無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行高密度懸浮培養(yǎng)，生產(chǎn)規(guī)模從毫克級(jí)到克級(jí)不等，滿足客戶的不同需求。腹水制備法是通過將雜交瘤細(xì)胞接種于小鼠腹腔內(nèi)，并產(chǎn)生腹水，可得到大量的腹水單抗。這種方式能夠在相對(duì)短的時(shí)間內(nèi)獲得大量高濃度的抗體，而且成本低、操作相對(duì)簡(jiǎn)單以及不需要復(fù)雜的培養(yǎng)條件。