實(shí)驗(yàn)2分離以尿素為氮源的微生物

選擇培養(yǎng)基定義：是根據(jù)某一種或某一類微生物的特殊營養(yǎng)要求或?qū)σ恍┪锢怼⒒瘜W(xué)抗性而設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基。利用這種培養(yǎng)基可以將所需要的微生物從混雜的微生物中分離出來。實(shí)例應(yīng)用：1、培養(yǎng)基中加入抗生素可以篩選出抗生素抗性菌2、培養(yǎng)基中缺乏碳源時(shí)，可篩選出自養(yǎng)型生物實(shí)驗(yàn)2分離以尿素為氮源的微生物

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?.使用專一的培養(yǎng)基（含尿素）分離專一的細(xì)菌（有脲酶的細(xì)菌）2.使用指示劑顏色的變化檢知酶（脲酶）所催化的反應(yīng)。二、實(shí)驗(yàn)原理：

脲即尿素，是蛋白質(zhì)降解的產(chǎn)物。有一些細(xì)菌含有脲酶可以分解尿素，利用尿素作為其生長的氮源(反應(yīng)式)(NH2)2C=O+H2O2NH3+CO2脲酶本實(shí)驗(yàn)利用尿素培養(yǎng)基分離出土壤中能利用尿素的細(xì)菌，由于尿素在脲酶的催化下分解產(chǎn)生了NH3，溶液會呈堿性，可用酸堿指示劑顏色的變化檢測(1)全營養(yǎng)LB固體培養(yǎng)基：蛋白胨0.25g、酵母提取物0.12g、NaCl0.25g、瓊脂0.5g、加水25ml。(2)尿素固體培養(yǎng)基：0.025g葡萄糖、NaCl0.12g、K2HPO40.12g、

酚紅0.25mg、瓊脂糖0.5g、加水15ml。滅菌冷卻到60℃時(shí)加入經(jīng)G6玻璃漏斗過濾

（使其無菌）的尿素。

酸堿指示劑：酸黃堿紅三、設(shè)備及用品：P25四、實(shí)驗(yàn)材料：（10倍稀釋法：0.5mL懸液

+4.5mL無菌水，搖勻即可）2.制備細(xì)菌懸液：1g土樣+99mL無菌水10-2土壤稀釋液并依次制備出10-3～10-5稀釋液。振蕩10min3、涂布分離法分離細(xì)菌：取10-4和10-5稀釋液各0.1ml，分別加到尿素培養(yǎng)基與LB培養(yǎng)基上，用玻璃刮刀將菌液涂布分離4、倒置培養(yǎng)5、觀察：比較LB培養(yǎng)基與尿素培養(yǎng)基上的菌落五、實(shí)驗(yàn)步驟1.制平板：LB固體培養(yǎng)基與尿素固體培養(yǎng)基對照組：LB固體培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)組：尿素固體培養(yǎng)基各濃度做3個(gè)培養(yǎng)皿1克土樣990.50.50.50.5各盛有4.5ml無菌水-5-5-5-6-6-6分析與討論：1、為什么要用瓊脂糖代替瓊脂配制固體培養(yǎng)基？2、有脲酶的細(xì)菌在生態(tài)穩(wěn)態(tài)上起什么作用？瓊脂是未被純化的混合物，內(nèi)含一定量的含氮化合物，如果用瓊脂固化培養(yǎng)基，會為細(xì)菌提供一定量的非尿素類氮源，這樣會在尿素固體培養(yǎng)上產(chǎn)生大量以非尿素為氮源的細(xì)菌，不利于以尿素為氮源的細(xì)菌的篩選脲酶的細(xì)菌能將尿素轉(zhuǎn)化為氨，供植物利用。因此脲酶的細(xì)菌對生態(tài)系統(tǒng)中N元素的循環(huán)有重要作用3、有脲酶的細(xì)菌菌落周圍為什么有著色的環(huán)帶出現(xiàn)？4、與全營養(yǎng)培養(yǎng)基上的菌落數(shù)比較，為什么尿素培養(yǎng)基上只有少數(shù)菌落？細(xì)菌向胞外分泌脲酶，使培養(yǎng)基中的尿素水解，尿素分解后產(chǎn)生氨，氨為堿性，酚紅在酸性環(huán)境中為黃色，在堿性環(huán)境里變?yōu)榧t色。培養(yǎng)基中的酸堿指示劑產(chǎn)生顏色變化，標(biāo)志著存在脲酶水解尿素的作用，從而證明這一菌株可以以尿素為氮源。紅色環(huán)狀區(qū)域的大小代表脲酶活性的強(qiáng)弱和含量的多少。紅色區(qū)域越大，表明菌株利用尿素的能力越強(qiáng)能利用尿素的細(xì)菌在土壤菌群中只占極少數(shù)量。因?yàn)槿撕推渌溉閯游锂a(chǎn)生的排泄物畢竟是少量的，而且尿素還可以在高溫下自然分解，因此，以尿素為氮源的菌群較少1、土壤中的微生物種類和數(shù)量繁多，同學(xué)們試圖探究土壤中微生物對尿素是否有分解作用，設(shè)計(jì)了以下實(shí)驗(yàn)，并成功篩選到能高效降解尿素的細(xì)菌（目的菌）。培養(yǎng)基成分如表所示，實(shí)驗(yàn)步驟如圖所示。請分析回答：KH2PO41.4gNa2HPO42.1gMgSO4·7H2O0.2g葡萄糖10g尿素1g瓊脂15g將上述物質(zhì)溶解后，用蒸餾水定容到100mL

（1）培養(yǎng)基中加入尿素的目的是篩選

，這種培養(yǎng)基屬于

培養(yǎng)基。（2）“目的菌”生長所需的氮源和碳源分別來自培養(yǎng)基中的

和

，實(shí)驗(yàn)需要振蕩培養(yǎng)，原因是

目的菌選擇尿素

為目的菌提供氧氣

葡萄糖

（3）圖中將細(xì)菌轉(zhuǎn)到固體培養(yǎng)基上時(shí)，常采用

的方法接種，獲得單菌落后繼續(xù)篩選。（4）在進(jìn)行分離分解尿素的細(xì)菌實(shí)驗(yàn)時(shí)，A同學(xué)從培養(yǎng)基上篩選出大約150個(gè)菌落，而其他同學(xué)只選擇出大約50個(gè)菌落。A同學(xué)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生的原因可能有

（填序號）。①土樣不同

②培養(yǎng)基污染

③操作失誤

④沒有設(shè)置對照（5）實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，使用過的培養(yǎng)基應(yīng)該進(jìn)行

處理后，才能倒掉。涂布平板（劃線）①②③滅菌

1.為了實(shí)現(xiàn)燃料供應(yīng)來源多樣化，發(fā)展長期替代化石燃料的產(chǎn)品如燃料酒精、生物柴油、沼氣等已經(jīng)列入我國未來10年的發(fā)展計(jì)劃。廣東省是我國甘蔗主產(chǎn)區(qū)之一。甘蔗是一種高光效的植物，單位面積產(chǎn)量很高，種植面積日益擴(kuò)大，目前已成為南方

地區(qū)燃料酒精生產(chǎn)的重要原料。利用甘蔗生產(chǎn)燃料酒精的一般工藝流程為：甘蔗榨汁（蔗糖）、酵母發(fā)酵﹑蒸餾﹑成品（燃料酒精）。請根據(jù)上述材料，回答下列問題：

(1)簡述甘蔗大規(guī)模快速繁殖技術(shù)的過程

選取甘蔗外植體，通過誘導(dǎo)脫分化產(chǎn)生愈傷組織，然后通過調(diào)整植物激素比例，再分化形成芽和根，獲得大量試管苗（或通過誘導(dǎo)大量形成胚狀體，制成人工種子，適宜條件下萌發(fā)長成幼苗）。（2）具有耐高糖和耐酸特性的酵母菌是理想的酒精發(fā)酵菌種，對野生酵母菌進(jìn)行誘變后通過篩選可以得到具有這些特性的突變菌，誘變及篩選過程如下：步驟1：野生菌液體培養(yǎng)一段時(shí)間后接受紫外線照射誘變處理。步驟2:制備選擇培養(yǎng)基。在基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，注意

和，加瓊脂后滅菌，制成固體平板。

步驟3：將紫外照射后的菌液稀釋涂布平板。

步驟4：根據(jù)

篩選出突變菌。

（3)上述步驟2、3和4的依據(jù)分別是＿。

添加高濃度蔗糖（葡萄糖）調(diào)低pH值

是否能在選擇培養(yǎng)基上生長提供高糖和酸性的篩選環(huán)境；獲得單菌落；能生長代表該菌落具有耐高糖和耐酸的特性。(4）利用獲得的突變菌和蔗汁進(jìn)行酒精發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，除了將培養(yǎng)基

滅菌、保持空間潔凈外，發(fā)酵過程中防止外來雜菌入侵還有

哪些可行方法？（列舉兩種）

（5)甘蔗榨汁以后還有大量的蔗渣廢棄物，主要成分為木質(zhì)素、纖維素和半纖維素,但是酵母菌無法直接利用，原因是其＿。請?zhí)岢鼋鉀Q該問題的方法。（列舉兩種方法）

①利用突變菌的耐酸特性，降低培養(yǎng)基的pH值，達(dá)到抑菌的目的；②利用突變菌的耐高糖特性，通過高滲環(huán)境達(dá)到抑菌目的；③保持厭氧環(huán)境，達(dá)到抑菌目的；④在培養(yǎng)基中添加一些抑制物如特殊的抗生素，達(dá)到抑菌目的。缺乏相應(yīng)分解酶系（或缺乏纖維素酶和半纖維素酶）。在酵母菌中轉(zhuǎn)入分解酶系相關(guān)基因；利用酶或微生物分解蔗渣；利用物理和化學(xué)方法分解蔗渣；將酵母菌與其他能分解蔗渣的微生物混合發(fā)酵。

2.自然界中的微生物往往是混雜生長的。人們在研究微生物時(shí)一般要將它們分離提純，然后進(jìn)行數(shù)量的測定。下面是對大腸桿菌進(jìn)行數(shù)量測定的實(shí)驗(yàn)，請回答有關(guān)問題。

步驟如下：A.制備稀釋倍數(shù)為10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的系列稀釋液。B.為了得到更加準(zhǔn)確的結(jié)果，你選用

接種樣品。C.適宜溫度下培養(yǎng)。結(jié)果分析：(1)測定的大腸桿菌數(shù)，在對應(yīng)稀釋倍數(shù)為10-6的培養(yǎng)基中，得到以下幾種統(tǒng)計(jì)結(jié)果，正確可信的是()A.一個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)是23B.兩個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)是22和26，取平均值24C.三個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)分別是21、5和52，取平均值26D.四個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)分別是21、30、24和25，取平均值25稀釋涂布平板法D

(2)一同學(xué)在稀釋倍數(shù)為10-5的培養(yǎng)基中測得平板上菌落數(shù)的平均值為23.4，那么每毫升樣品中的菌落數(shù)是(涂布平板時(shí)所用稀釋液的體積為0.2ML)_______________。(3)用這種方法測定