第二章 實(shí)驗(yàn)室設(shè)置與常規(guī)技術(shù)

第二章實(shí)驗(yàn)室設(shè)置與常規(guī)技術(shù)井岡山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院了解細(xì)胞工程的通用技術(shù)，初步掌握細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)中的培養(yǎng)基配制、滅菌以及無菌操作的原理與操作方法。第一節(jié)實(shí)驗(yàn)室設(shè)置實(shí)驗(yàn)室是細(xì)胞工程研究的主要場所，應(yīng)能滿足清洗、培養(yǎng)基制備、儲(chǔ)藏、無菌操作、培養(yǎng)、鑒定等多方面的工作。實(shí)驗(yàn)室組成

基本設(shè)備配制培養(yǎng)容器與用具細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室它必須滿足三個(gè)基本的需要，即：實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備，包括培養(yǎng)基配制，洗滌與滅菌等；無菌操作；控制培養(yǎng)?；緦?shí)驗(yàn)室輔助實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室一．實(shí)驗(yàn)室組成基本實(shí)驗(yàn)室——準(zhǔn)備室進(jìn)行一切與實(shí)驗(yàn)有關(guān)的準(zhǔn)備工作。要求寬敞明亮，通風(fēng)條件好。1.1洗滌間根據(jù)工作量的大小決定其大小，一般面積控制在30-50m2。在實(shí)驗(yàn)室的一側(cè)設(shè)置專用的洗滌水槽，用來清洗玻璃器皿。中央實(shí)驗(yàn)臺(tái)還應(yīng)配置2個(gè)水槽，用于清洗小型玻璃器皿。如果工作量大，可以購置一臺(tái)洗瓶機(jī)。準(zhǔn)備1-2個(gè)洗液缸，專門用于洗滌對潔凈度要求很高的玻璃器皿。此外還應(yīng)配置落水架、干燥箱、柜子、超聲波清洗器等。地面應(yīng)耐濕并排水良好。1.2培養(yǎng)基配制間

面積60平方米左右，配備的主要儀器設(shè)備有：冰箱、天平、微波爐、pH計(jì)、培養(yǎng)基分裝器、藥品柜、器械柜、抽氣泵、電爐、各種規(guī)格的培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、移液管、燒杯、量筒、容量瓶、儲(chǔ)藏瓶等。冰箱以體積180-200L為宜，用于儲(chǔ)存培養(yǎng)基母液、激素維生素等貴重藥品、彩色膠卷、及保存植物材料。天平應(yīng)有不同感量。

1.3消毒間

配備實(shí)驗(yàn)臺(tái)、高壓滅菌鍋、排風(fēng)滅火設(shè)備、細(xì)菌過濾設(shè)備、干熱消毒柜、電爐等。滅菌鍋的選擇應(yīng)根據(jù)不同的要求選擇不同型號(hào)的滅菌鍋。一般實(shí)驗(yàn)室可選用小型的醫(yī)用手提式高壓滅菌鍋，較大的實(shí)驗(yàn)室可選用立式自動(dòng)控制壓力和溫度的滅菌鍋。生產(chǎn)性的實(shí)驗(yàn)室可選用大型的臥式滅菌鍋。

如果沒有條件的話，可以將上述工作間合并成一個(gè)準(zhǔn)備間，要求是設(shè)備的安裝和排列要合理、房間要寬敞、明亮、透風(fēng)，地面要便于清潔、防滑。

1.4無菌操作室

無菌操作室主要用于實(shí)驗(yàn)材料的接種操作，所以又叫接種室。通常由里外兩間組成，外間是緩沖間，用于準(zhǔn)備工作，還有防止污染的作用。緩沖間的門應(yīng)該與接種室的門錯(cuò)開，兩個(gè)門也不要同時(shí)開啟，以保證無菌室不因開門和人的進(jìn)出帶進(jìn)雜菌。緩沖間內(nèi)應(yīng)該設(shè)有水槽、實(shí)驗(yàn)臺(tái)、鞋帽架、和柜子、紫外燈。無菌操作室的內(nèi)壁應(yīng)當(dāng)用塑鋼板或瓷磚裝修，工作人員進(jìn)入操作間前要穿上消過毒的工作服和拖鞋。

室內(nèi)應(yīng)配有超凈工作臺(tái)，紫外燈、解剖鏡、各種接種器械等。接種室要求封閉性好，干燥清潔，能較長時(shí)間保持無菌。房間一般不宜過大，其規(guī)模根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要而定。接種室除了出入口和通氣口外，應(yīng)行密閉。防止空氣對流。1.5培養(yǎng)室

為了控制培養(yǎng)室的溫度和光照時(shí)間及其強(qiáng)度，培養(yǎng)室的房間不要窗戶，但應(yīng)當(dāng)留一個(gè)通氣窗，并安上排氣扇。室內(nèi)溫度由空調(diào)控制，光照由日光燈控制。天花板和內(nèi)墻最好用塑料鋼板裝修，地面用水磨石或瓷磚鋪設(shè)，一般要分兩間，一為光照培養(yǎng)室，一為暗培養(yǎng)室。培養(yǎng)室外應(yīng)有一預(yù)備間或走廊。

培養(yǎng)室應(yīng)配有培養(yǎng)架、轉(zhuǎn)床、搖床、光照培養(yǎng)箱、生化培養(yǎng)箱、自動(dòng)控時(shí)器等。日光燈一般用40W，固定在培養(yǎng)架的側(cè)面或擱板的下面，每層有兩支日光燈，距離在20cm，光照強(qiáng)度為2000-3000lx。

基本實(shí)驗(yàn)室——培養(yǎng)室培養(yǎng)室的功能是對離體材料進(jìn)行控制培養(yǎng)。其首要要求是要能控制光照和溫度，其次為防止微生物感染，培養(yǎng)室應(yīng)保持干燥和清潔。輔助實(shí)驗(yàn)室——細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)室其功能是對培養(yǎng)材料進(jìn)行細(xì)胞學(xué)鑒定和研究。要求清潔、明亮、干燥，使各種光學(xué)儀器不受潮濕和灰塵污染。輔助實(shí)驗(yàn)室——理化分析實(shí)驗(yàn)室在以培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)物為主要目的的實(shí)驗(yàn)室中，應(yīng)建立相應(yīng)的分析化驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室，以便于對培養(yǎng)物的有效成分隨時(shí)進(jìn)行取樣檢查。離心機(jī)、酶聯(lián)免疫檢測儀、天平、PCR儀等。

2.2、溫室

為試管苗提供滿足生長的適宜環(huán)境條件。二．基本設(shè)備配制基本設(shè)備：冰箱、天平、酸度計(jì)、純水器、電爐、培養(yǎng)基分裝器、攪拌器。滅菌設(shè)備：蒸汽壓力滅菌鍋、干熱消毒柜、過濾滅菌裝置、噴霧消毒器、紫外燈。無菌操作設(shè)備：凈化工作臺(tái)、接種箱。光溫控制設(shè)備：時(shí)間程序控制器、空調(diào)及溫度感應(yīng)器。細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備：培養(yǎng)設(shè)備根據(jù)需要而定，包括培養(yǎng)架、培養(yǎng)箱、搖床、生物反應(yīng)器等。細(xì)胞學(xué)鑒定設(shè)備：光學(xué)研究顯微鏡、實(shí)體顯微鏡、倒置顯微鏡。除上述基本設(shè)備外，如果有條件和需要還可配制攝影設(shè)備、生化分析設(shè)備等。三．培養(yǎng)器皿及實(shí)驗(yàn)用具玻璃器皿新型材料器皿金屬材質(zhì)用具第二節(jié)基本技術(shù)洗滌

滅菌接種培養(yǎng)基一、洗滌技術(shù)1．洗滌液鉻酸洗滌液是用重鉻酸鉀(K2Cr2O7)與硫酸(H2SO4)配制而成，可根據(jù)需要配制成弱、中、強(qiáng)三種。弱用重鉻酸鉀50g加入蒸餾水1L，加熱溶化，冷卻后再緩慢加入濃硫酸90ml。中用重鉻酸鉀50g加入蒸餾水100ml，加熱溶化，冷卻后再緩慢加入濃硫酸875ml。強(qiáng)與濃硫酸加熱的同時(shí)緩慢加入磨碎的重鉻酸鉀，直到重鉻酸鉀達(dá)到飽和為止。一般濃硫酸1L加入重鉻酸鉀50g。洗滌液的配制

2．洗滌方法玻璃器皿洗滌塑料用品洗滌金屬用品洗滌A、新購買的玻璃儀器表面常附著有游離的堿性物質(zhì)，可先用0.5％的去污劑洗刷，再用自來水洗凈，然后浸泡在1％～2％鹽酸溶液中過夜（不可少于四小時(shí)），再用自來水沖洗，最后用無離子水沖洗兩次，在100℃～120℃烘箱內(nèi)烘干備用。

B、使用過的玻璃儀器的清洗

先用自來水洗刷至無污物，再用合適的毛刷沾去污劑（粉）洗刷，或浸泡在0.5％的清洗劑中超聲清洗（比色皿決不可超聲），然后用自來水徹底洗凈去污劑，用無離子水洗兩次，烘干備用（計(jì)量儀器不可烘干）。清洗后器皿內(nèi)外不可掛有水珠，否則重洗，若重洗后仍掛有水珠，則需用洗液浸泡數(shù)小時(shí)后（或用去污粉擦洗），重新清洗。

C、塑料器皿的清洗

聚乙烯、聚丙烯等制成的塑料器皿，在生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中已用的越來越多。第一次使用塑料器皿時(shí)，可先用8mol/L尿素（用濃鹽酸調(diào)pH=1）清洗，接著依次用無離子水、1mol/LKOH和無離子水清洗，然后用10—3mol/LEDTA除去金屬離子的污染，最后用無離子水徹底清洗，以后每次使用時(shí)，可只用0.5％的去污劑清洗，然后用自來水和無離子水洗凈即可。D、金屬用品洗滌

金屬用品一般不宜用各種洗滌液洗滌（新的可以用熱洗衣粉水洗凈），需要清洗時(shí)，一般用酒精擦洗，然后火焰干燥。

E、除菌過濾器用清水沖洗后，用洗液沖洗，再用清水沖洗，最后用蒸餾水沖洗，晾干備用。二．滅菌、消毒技術(shù)滅菌的方法：

1、物理方法：干熱、濕熱、過濾（0.25微米）、紫外燈、超聲波等。

2、化學(xué)方法：使用滅菌劑或抗菌素，如酒精、次氯酸鈉、升汞、漂白粉、高錳酸鉀、雙氧水、福爾馬林等

1）干熱滅菌

適用于玻璃器皿和金屬器械的滅菌。操作方法：150℃、40min或120℃、120min，如果發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌，160℃、90~120min

（2）濕熱滅菌

適用于各種器皿、培養(yǎng)基、器皿、蒸餾水、棉塞、紙等。121℃維持20~30min

注意點(diǎn)：加足水、排盡氣、氣壓降到0時(shí)，才能開蓋

（3）過濾滅菌

培養(yǎng)基的滅菌一般用高壓高溫處理，但如果培養(yǎng)基中某些成分遇到高溫分解（如某些生長調(diào)節(jié)劑GA3、玉米素等），就需要過濾滅菌。另外酶、血清等也需要過濾滅菌

滅菌方法：將生長調(diào)節(jié)劑或酶配成一定濃度，用注射器注入微孔濾膜慮，濾膜孔徑0.22-0.45微米。制培養(yǎng)基時(shí)，現(xiàn)將培養(yǎng)基高壓滅菌，待降至50℃左右時(shí)，加入適量的激素，然后分裝（4）射線滅菌

主要是利用紫外燈進(jìn)行照射，適合實(shí)驗(yàn)室空氣、操作臺(tái)等，滅菌時(shí)間20-30min。

注意：關(guān)燈后5min后再進(jìn)入。超凈工作臺(tái)關(guān)燈后要打開風(fēng)機(jī)。

（5）火焰灼燒滅菌

用火焰灼燒達(dá)到滅菌目的，適用于接種器皿的滅菌。

（6）消毒劑適用外植體、實(shí)驗(yàn)器皿、操作表面、皮膚等。幾種常用消毒劑的效果比較消毒劑使用濃度(%)消毒時(shí)間(min.)效果殘液去除難易乙醇70-750.1-3好易新潔爾滅10～205～30好易氯化汞0.1～12～15最好最難過氧化氫10～125～15較好最易抗菌素4～50mgl-130～60較好較難次氯酸鈣/納9～105～30好易人為因素（工作人員本身）：工作服、帽、口罩、酒精擦手。物品因素器皿和用具培養(yǎng)皿：洗→熱壓

玻璃器皿：洗→干熱（干熱箱）或晾干

接種用具：用CCL4布擦→濕布擦→

泡75%~95%酒精→燒培養(yǎng)基：濕熱培養(yǎng)材料外部細(xì)菌：用水沖洗→化學(xué)藥劑處理

內(nèi)部細(xì)菌

莖尖培養(yǎng)

加抗生素：青霉素、利福平操作的空氣：洗刷地板95%酒精擦超凈工作臺(tái)

用化學(xué)試劑薰蒸污染來源無菌操作技術(shù)

1．培養(yǎng)基滅菌2．玻璃器皿滅菌3．金屬用具滅菌4．接種室滅菌5．外植體滅菌1、實(shí)驗(yàn)器具和材料的準(zhǔn)備

2、用75%的酒精擦拭超凈工作臺(tái)，然后室內(nèi)及超凈工作臺(tái)用紫外燈殺菌20min-30min。注意：臺(tái)面上的用品不要放置太多或重疊放置，以免降低滅菌效果。

3、關(guān)紫外燈、打開風(fēng)機(jī)，過5-10min進(jìn)入緩沖間，以75%洗手和手臂，更換無菌服、帽子和口罩。進(jìn)入接種室。（注：沒有特別情況，盡量不要下工作臺(tái)）

4、用70－75％的酒精拭擦臺(tái)面并消毒雙手。試驗(yàn)用具也應(yīng)該用酒精消毒。點(diǎn)燃酒精燈，將金屬器械在其火焰上灼燒，冷卻待用。

注意：所有操作應(yīng)在火焰近處并經(jīng)過灼燒進(jìn)行。金屬器械不能過度灼燒，以防退火。移液管不能灼燒，培養(yǎng)瓶口、塑料材料、橡膠材料過火焰不能時(shí)間太長。6、打開培養(yǎng)瓶，瓶口在燈焰處旋轉(zhuǎn)灼燒，用鑷子將培養(yǎng)材料置于培養(yǎng)基上，灼燒鑷子放回，灼燒瓶口，蓋上瓶塞。

7、用酒精擦洗工作臺(tái)和手。進(jìn)行下一輪操作。5、取流水沖洗（至少30min）過的外植體，用一定的消毒劑浸泡消毒，用無菌水沖洗3~4次，放入無菌培養(yǎng)皿中，置于酒精燈火焰下方，用無菌的接種器械進(jìn)行分離、切割或其他處理。注意（1）進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，動(dòng)作要準(zhǔn)確敏捷，但又不必太快，以防空氣流動(dòng)，增加污染機(jī)會(huì)。（2）不能用手觸及已消毒器皿，如已接觸，要用火焰燒灼消毒或取備品更換。（3）為拿取方便，工作臺(tái)面上的用品要有合理的布局，原則上應(yīng)是右手使用的東西放置在右側(cè)，左手用品在左側(cè)，酒精燈置于中央。（4）工作由始至終要保持一定順序性，組織或細(xì)胞在未做處理之前，勿過早暴露在空氣中。同樣，培養(yǎng)液在未用前，不要過早開瓶；用過之后如不再重復(fù)使用，應(yīng)立即封閉瓶口直立可增加落菌機(jī)會(huì)。（5）吸取營養(yǎng)液、細(xì)胞懸液及其它各種用液時(shí)，均應(yīng)分別使用吸管，不能混用，以防擴(kuò)大污染或?qū)е录?xì)胞交叉污染。

（6）工作中不能面向操作區(qū)講話或咳嗽，以免唾沫把細(xì)菌或支原體帶入工作臺(tái)面發(fā)生污染。

（7）手或相對較臟的物品不能經(jīng)過開放的瓶口上方，瓶口最易污染，加液時(shí)如吸管尖碰到瓶口，則應(yīng)將吸管丟掉。接種時(shí)在近火焰處打開瓶口，使瓶傾斜，以免空氣中微生物落入瓶中正

確

錯(cuò)

誤整個(gè)接種操作應(yīng)在近火焰處進(jìn)行，且動(dòng)作要迅速正

確

錯(cuò)

誤接種過程中盡可能達(dá)到懸空要求防止操作帶來的污染正

確

錯(cuò)

誤接種時(shí)不得用手接觸瓶蓋內(nèi)壁或瓶口正

確

錯(cuò)

誤瓶蓋朝上放，接種完畢后立即蓋好瓶口正

確

錯(cuò)

誤接種完一瓶用火燒用具以防止交叉污染產(chǎn)生種子和分生組織：培養(yǎng)時(shí)通常將其貼放在培養(yǎng)基表面，而不是插到培養(yǎng)基內(nèi)部，以免供氧不足正

確

錯(cuò)

誤接種莖段：注意形態(tài)學(xué)下端插入培養(yǎng)基內(nèi)，而形態(tài)學(xué)上端露于空氣中正

確

錯(cuò)

誤外植體的選擇與處理技術(shù)

用于外植體分離的母體植物材料一般有3種來源：一是生長在自然環(huán)境下的植物；二是在溫室控制環(huán)境條件下生長的植物；三是無菌環(huán)境下已經(jīng)過離體培養(yǎng)的植物。

（一）、外植體的選擇

1、選擇優(yōu)良的基因型

試驗(yàn)首先要明確目的。例如，蔬菜、作物等的脫毒快繁，是為了脫去病毒，提高產(chǎn)量和質(zhì)量，就應(yīng)選擇當(dāng)?shù)卦耘啻_認(rèn)的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的品種作為脫毒的材料，并且品種一定要可靠?；ɑ?、觀賞植物的快繁，也應(yīng)選擇有價(jià)值的植物。

2、取材

從生長旺盛、健壯、無病蟲害的植株上取材。母柱代謝旺盛期切取的外植體再生能力強(qiáng)，試驗(yàn)容易成功。3、外植體大小選擇

因外植體不同而不同。如利用莖尖培養(yǎng)，莖尖大小對脫毒效果非常明顯。再如幼胚培養(yǎng)，胚齡也非常重要。（以后具體講）

4、選擇外植體的時(shí)期

外植體的生長動(dòng)態(tài)往往與該物種的生長規(guī)律（生物鐘）有關(guān)。因此，最好在植物生長的最適宜時(shí)期取材培養(yǎng)。會(huì)得到較好的結(jié)果。

（二）、外植體的處理

1、取材母株的預(yù)處理

人工管理，促進(jìn)母株生長旺盛、代謝活躍，從其上取材培養(yǎng)，容易成功。

2、外植體休眠的處理

有些植物的種子、幼胚、或芽，存在休眠。為了打破休眠，可利用低溫處理，或赤霉素等化學(xué)物質(zhì)處理。因植物不同處理溫度和時(shí)間有所不同。

一、培養(yǎng)基的成分及其作用（一）無機(jī)營養(yǎng)物質(zhì)培養(yǎng)的植物組織、器官、細(xì)胞或者原生質(zhì)體需要連續(xù)的供給某些無機(jī)化學(xué)物質(zhì)，除了C、H、O之外，需要量比較多的元素叫大量元素，需要量比較少的元素叫微量營養(yǎng)元素。第三節(jié).培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件控制大量元素培養(yǎng)基的大量元素使用量一般在每升幾十至幾千毫克。大量元素包括N,P,K,Ca,Mg,S。培養(yǎng)基中加入量最多的是N，N一般以硝酸鹽或氨鹽，或者兩者結(jié)合的鹽提供微量元素微量元素的用量一般每升不高于幾十毫克。植物所需的微量元素有Fe、Cu、Zn、B、Mo、Mn、Co，Cl

其他一些化學(xué)藥品常帶有微量元素雜質(zhì)，因此要注意微量元素的用量不能過多，多會(huì)引起生長抑制等毒害現(xiàn)象。

（二）.有機(jī)化合物有機(jī)物質(zhì)包括維生素類物質(zhì)、氨基酸類物質(zhì)、糖類物質(zhì)和一些其它的有機(jī)添加物1、維生素類物質(zhì)維生素類物質(zhì)在酶系統(tǒng)中有催化功能。硫胺素（VB1）與愈傷組織的產(chǎn)生和生活力有關(guān)，可能是所有植物組織培養(yǎng)初期需要的維生素，而鹽酸吡哆醇（VB6）促進(jìn)根的生長，煙酸（VB3，又稱維生素PP）促進(jìn)胚的發(fā)育。有的配方中還使用了泛酸鈣（VB5）、生物素（VH）、鈷胺素（VB12）、葉酸（VBc），Vc等。

2、AA類物質(zhì)

絕大多數(shù)AA適量時(shí)對培養(yǎng)效果都有正象效應(yīng)。常用的有Gly、Asn、Gln。在植物組織培養(yǎng)中，有時(shí)也用水解乳蛋白和水解酪蛋白。3、糖類

糖在培養(yǎng)基的作用：

1）、為細(xì)胞提供合成新物質(zhì)的碳骨架

2）、為細(xì)胞的呼吸代謝提供底物和能量

3）、維持滲透壓

蔗糖是廣泛應(yīng)用的一種碳源。葡萄糖和麥芽糖也是常用的碳源。4、其它有機(jī)物質(zhì)

1）肌醇（環(huán)己六醇）

肌醇可以形成果膠物質(zhì)，是細(xì)胞壁的構(gòu)建物質(zhì)另外還可以形成植酸，與陽離子結(jié)合或形成磷脂，參與細(xì)胞膜的組成。利于胚和芽的形成

2）天然有機(jī)物

一些天然的有機(jī)物如椰乳、番茄提取物、酵母提取物、馬鈴薯煮汁也常用于植物組織培養(yǎng)，并表現(xiàn)出了良好的促進(jìn)作用。植物激素是在植物體內(nèi)合成的，對植物生長發(fā)育有顯著調(diào)節(jié)作用的微量有機(jī)物，而植物生長調(diào)節(jié)劑是外源的調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的物質(zhì)。無機(jī)元素和有機(jī)營養(yǎng)構(gòu)成的培養(yǎng)基僅保證培養(yǎng)物的生存與最低生理活動(dòng)，只有加入植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，才能誘導(dǎo)細(xì)胞分裂、脫分化和再分化。（三）、植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)

1、生長素類：

1）吲哚類：IAA（吲哚乙酸）、IBA（吲哚丁酸）、IPA（吲哚丙酸）

2）萘酸類：NAA（萘乙酸）

3）苯氧羧酸類：2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）、2,4,5-T（2,4,5-三氯苯氧乙酸）、2,4,5-TP（2,4,5-三氯苯氧丙酸）等。

其中吲哚乙酸在植物體內(nèi)普遍存在，是生理活性最強(qiáng)的生長素。

生長素的生理作用

1、促進(jìn)細(xì)胞生長和細(xì)胞分裂

2、誘導(dǎo)受傷組織表面細(xì)胞恢復(fù)分裂能力

3、形成愈傷組織，促進(jìn)生根

4、與一定量的細(xì)胞分裂素配合共同誘導(dǎo)不定芽的分化、側(cè)芽的萌發(fā)與生長、胚狀體的誘導(dǎo)。A：NAA0mg/L，芽（少），根（無）

B：NAA0.1mg/L，芽（少），根（無），愈傷組織（少量）

C：NAA5.0mg/L，芽（少），根（多），愈傷組織（一定量ABC2、細(xì)胞分裂素是一類腺嘌呤衍生物。主要有激動(dòng)素（6-糠基氨基嘌呤KT）、6-芐基氨基嘌呤（6-BA）和玉米素（ZT）等。其中最常用的是6—芐基氨基嘌呤。功能：1、促進(jìn)細(xì)胞的分裂和分化2、誘導(dǎo)芽的分化3、促進(jìn)側(cè)芽的萌發(fā)和生長4、抑制衰老ABA：BA(0mg/L)，芽（減少），根（增多）愈傷組織（一定量）

B：BA(0.1mg/L)，芽（適量），根（適量）愈傷組織（一定量）

控制植物細(xì)胞分化分裂素/生長素的比例是控制芽和根形成的一個(gè)重要條件比例高時(shí)——產(chǎn)生芽,比例低時(shí)——產(chǎn)生根

3、赤霉素（GA3）

生理作用：

1、誘導(dǎo)莖的細(xì)胞伸長，對矮生型植物恢復(fù)成高生型特別有效，對根無效

2、對形成層的細(xì)胞分化有影響，往往同生長素有協(xié)同作用。IAA/GA比值高有利于木質(zhì)部的分化，比值低有利于韌皮部的分化。

3、破除種子、鱗莖、塊莖休眠，使之提前萌發(fā)。

4、對生長素和細(xì)胞分裂素的活性有增效作用

注：不耐熱，應(yīng)采用過濾滅菌加入

4、脫落酸（ABA）

生理作用：

1、抑制蛋白質(zhì)的合成

2、抵消和抑制生長素、細(xì)胞分裂素、GA的作用

3、誘導(dǎo)休眠、促進(jìn)衰老和脫落

以上四種生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，前兩類用的多，后兩類只是補(bǔ)充，對某些植物有利、對某些植物不僅沒有利，還有害，實(shí)際工作中要具體分析。

生長調(diào)節(jié)物質(zhì)在生物體內(nèi)存在甚微，濃度很低，一般用ppm表示

1ppm=1mg/L（四）固化劑和懸浮劑

1、固化劑

瓊脂、瓊脂糖（用于原生質(zhì)體、細(xì)胞培養(yǎng)及某些作物的花藥培養(yǎng)）

瓊脂的用量一般在4-10g/L，所購回的瓊脂要先試一下它的凝固力，一般只要能穩(wěn)定的凝固就不要多加。瓊脂以顏色淺、透明度好、潔凈的為上品。

2、懸浮劑

Ficoll（聚蔗糖）

二、培養(yǎng)基的配方及培養(yǎng)基的選擇

培養(yǎng)基的種類（根據(jù)無機(jī)鹽的濃度）：

1、高無機(jī)鹽含量培養(yǎng)基

鉀鹽、銨鹽及硝酸鹽含量較高，微量元素種類齊全，比例適當(dāng)，離子平衡性好，具有較強(qiáng)的緩沖性，養(yǎng)分?jǐn)?shù)量及比例比較合適，廣泛用于植物的器官、花藥、細(xì)胞及原生質(zhì)體的培養(yǎng)。主要有MS、LS、BL、BM、ER培養(yǎng)基。2、高硝態(tài)氮培養(yǎng)基

硝酸鉀含量高，氨態(tài)氮的含量低，含有較高的VB1。主要適合與木本植物、十字花科植物和單子葉植物的組織和花藥培養(yǎng)。主要有B5、N6、SH培養(yǎng)基。3、中等無機(jī)鹽含量培養(yǎng)基

大量元素約為MS培養(yǎng)基的一半，微量元素種類減少，但含量較MS的高，維生素種類比MS多，如增加了生物素、葉酸等。適合于花藥培養(yǎng)，主要有Nitch，NT、H、Miller培養(yǎng)基。4、低無機(jī)鹽含量培養(yǎng)基

大量元素含量大幅度降低而且種類減少，有機(jī)含量相對也很低。多數(shù)用于生根培養(yǎng)基，主要有White、Heller、WS、HE、HB。培養(yǎng)基類型2.根據(jù)其作用不同，培養(yǎng)基分為誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基。1.根據(jù)培養(yǎng)物的培養(yǎng)過程，培養(yǎng)基分為初代培養(yǎng)基和繼代培養(yǎng)基。初代培養(yǎng)基是指用來第一次接種外植體的培養(yǎng)基。繼代培養(yǎng)基是指用來接種繼初代培養(yǎng)物的培養(yǎng)基。3.根據(jù)其營養(yǎng)水平不同，培養(yǎng)基可分為基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基?；九囵B(yǎng)基（就是通常稱呼的培養(yǎng)基）主要有MS、White、N6、B5、改良MS、Heller、Nitsh、SH、Miller等。完全培養(yǎng)基就是基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，根據(jù)試驗(yàn)的不同需要，附加一些物質(zhì)，如生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和其他復(fù)雜有機(jī)物質(zhì)等。

MS+6-BA0.5+KT0.5+NAA0.5+Su3%+Ag0.7%培養(yǎng)基的篩選：

1.無機(jī)營養(yǎng)成分：一般在現(xiàn)有培養(yǎng)基配方中選擇?？梢詤⒖记叭说慕?jīng)驗(yàn)，例如：MS是廣譜性培養(yǎng)基，N6用于單子葉植物的培養(yǎng)。豆科多用B5培養(yǎng)基。

2、植物生長調(diào)節(jié)劑：必須進(jìn)行篩選試驗(yàn)?？傮w原則-當(dāng)誘導(dǎo)愈傷組織形成時(shí)，細(xì)胞分裂素和生長素相對平衡；誘導(dǎo)芽分化時(shí)，細(xì)胞分裂素水平應(yīng)高于生長素，誘導(dǎo)根則要低。

3、有機(jī)成分要根據(jù)培養(yǎng)類型考慮，如進(jìn)行器官和組織培養(yǎng)，一般不加復(fù)雜有機(jī)成分，而進(jìn)行細(xì)胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)則要加

三、培養(yǎng)基的配制

（一）、貯備液（母液）的配制

為什么要配制母液？

1）、方便

2）、準(zhǔn)確（有些成分量太?。?/p>

以MS培養(yǎng)基配制為例：1、大量元素母液的配制

各成分按照表1培養(yǎng)基濃度含量擴(kuò)大10倍，按順序逐步混合。后用蒸餾水定容到1000ml的容量瓶中，即為10倍的大量元素母液。到入細(xì)口瓶，貼好標(biāo)簽保存于冰箱中。配制培養(yǎng)基時(shí)，每配1L培養(yǎng)基取此液100ml。

注意：(1)某些無機(jī)成分如Ca2+、SO42一、Mg2十和H2PO4一等在一起可能發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生沉淀物。為避免此現(xiàn)象發(fā)生，母液配制時(shí)要用純度高的重蒸餾水溶解，藥品采用等級較高的分析純，各種化學(xué)藥品必須先以少量重蒸餾水使其充分溶解后才能混合，混合時(shí)應(yīng)注意先后順序。特別應(yīng)將Ca2+、SO42一、Mg2十和H2PO4一等離子錯(cuò)開混合，速度宜慢，邊攪拌邊混合。

(2)CaCl2·2H2O要在最后單獨(dú)加入，在溶解CaCl2·2H2O時(shí)，蒸餾水需加熱沸騰，除去水中的CO2，以防沉淀。另外，CaCl2·2H2O放入沸水中易沸騰，操作時(shí)要防止其溢出。２、微量元素母液的配制

p78

MS培養(yǎng)基的微量元素?zé)o機(jī)鹽由7種化合物（除Fe）組成。微量元素用量較少，特別是

CuSO4·5H2O、

CoCl2·6H2O

，因此在配制中分微量Ⅰ、Ⅱ配制。按照表2，表3配方，用感量為0.0001g的分析天平稱量，其它同大量元素。配制培養(yǎng)基時(shí)，每配制1L培養(yǎng)基，取微量Ⅰ10ml，微量Ⅱ１ml3、鐵鹽母液的配制

鐵鹽不是都需要單獨(dú)配成母液，如檸檬酸鐵，只需和大量元素一起配成母液即可。目前常用的鐵鹽是硫酸亞鐵和乙二胺四乙酸二鈉的螯合物，必須單獨(dú)配成母液。這種螯合物使用起來方便，又比較穩(wěn)定，不易發(fā)生沉淀。配制方法同上，直接用蒸餾水加熱攪拌溶解。配制培養(yǎng)基時(shí)，配制1L取此液10ml。在配制鐵鹽時(shí)，如果加熱攪拌時(shí)間過短，會(huì)造成FeS04和Na2EDTA鰲合不徹底，此時(shí)若將其冷藏，F(xiàn)eS04會(huì)結(jié)晶析出。為避免此現(xiàn)象發(fā)生，配制鐵鹽母液時(shí)，F(xiàn)eS04和Na2EDTA應(yīng)分別加熱溶解后混合，并置于加熱攪拌器上不斷攪拌至溶液呈金黃色(約加熱20-30min)，調(diào)pH值至5.5，室溫放置冷卻后，再冷藏。4、有機(jī)母液的配制

MS培養(yǎng)基的有機(jī)成分有甘氨酸、肌醇、煙酸、鹽酸硫胺素和鹽酸吡哆素。培養(yǎng)基中的有機(jī)成分原則上應(yīng)分別單獨(dú)配制。配制直接用蒸餾水溶解，注意稱量時(shí)用電子分析天平。并貯存在棕色無菌瓶中。

配制生物素、葉酸，用稀氨水溶解，然后定容。

5、植物生長調(diào)節(jié)劑母液配制

一般植物生長調(diào)節(jié)劑母液的配制的終濃度以0.5mg/ml為好，需要注意的是：

（１）配制生長素類，例如IAA、NAA、2.4-D、IBA，應(yīng)先用少量95%乙醇或無水乙醇充分溶解，或者用1mol/L的NaOH溶解，然后用蒸餾水定容到一定的濃度。以后者效果好。

（２）細(xì)胞分裂素，例如KT，應(yīng)先用少量95%乙醇或無水乙醇加3~4滴1mol/L的鹽酸溶解，或直接用1mol/LHCl溶解，再用蒸餾水定容。

（３）GA3以95%酒精溶解（不耐高溫，過濾滅菌）

保存在棕色試劑瓶中。

注意：

所有母液都要貼上標(biāo)簽，注明名稱、配制倍數(shù)、日期，所有的母液都應(yīng)保存在0~4℃冰箱中，若母液出現(xiàn)沉淀或霉團(tuán)則不能繼續(xù)使用。

（二）、培養(yǎng)基的配制

1、計(jì)量

根據(jù)配制培養(yǎng)基的量和母液的濃度計(jì)算需要吸取母液的量，計(jì)算公式：吸取量ml=培養(yǎng)基中物質(zhì)的含量（mg/L）×1000ml/母液濃度（mg/L）。

2、移液

取醫(yī)用瓷缸一只，加入少量的蒸餾水，按照計(jì)算吸取母液的量依次吸取各母液置于醫(yī)用瓷量杯中備用。

注意（1）用量筒或移液管量取培養(yǎng)基母液之前，必須用所量取的母液將量筒或移液管潤洗2次。

（2）量取母液時(shí)，不要漏掉或多加。

（3）移液管不能混用。3、稱取瓊脂蔗糖備用

4、融化

用搪瓷量杯量取600～700ml的蒸餾水放在電爐上，加入瓊脂，邊加熱邊用玻璃棒攪拌，直到液體呈半透明狀將其取下，加入蔗糖。

大燒杯底的外表面不能沾水，否則加熱時(shí)燒杯容易炸裂，使溶液外溢，造成燙傷。

5、混合

將融化的瓊脂和母液充分混合，用蒸餾水定容到1000ml，來回混合幾次。

6、調(diào)pH

用滴管吸取物質(zhì)的量濃度為1mol/L的NaOH或HCl溶液，逐滴滴入溶化的培養(yǎng)基中，邊滴邊攪拌，并隨時(shí)用精密的pH試紙(5.4～7.0)測培養(yǎng)基的pH，一直到培養(yǎng)基的pH達(dá)到要求為止(在調(diào)制時(shí)要比目標(biāo)pH值偏高0.2～0.5個(gè)單位，因?yàn)榕囵B(yǎng)基在滅菌過程中由于糖等物質(zhì)的降解，pH值會(huì)下降0.2～0.5個(gè)單位左右)。7、分裝

溶化的培養(yǎng)基應(yīng)該趁熱分裝。注意不要讓培養(yǎng)基沾到瓶口和瓶壁上。錐形瓶中培養(yǎng)基的量約為錐形瓶容量的1/5～1/4。每1L培養(yǎng)基，可分裝20～30瓶。

8、包扎

用封口膜封口，外邊可加一層牛皮紙，扎好繩子，用鉛筆或碳素墨水筆在牛皮紙上寫上培養(yǎng)基的代號(hào)。

9、培養(yǎng)基的滅菌

培養(yǎng)條件的選擇

培養(yǎng)中溫度、光照、濕度等各種環(huán)境條件，培養(yǎng)基組成、pH值、滲透壓等各種化學(xué)環(huán)境條件都回影響組織一.光照的影響培養(yǎng)中光照也是重要的條件之一，主要表現(xiàn)在光強(qiáng)、光質(zhì)、以及光周期等方面：

光周期：黑暗與光照交替的時(shí)間光量：光照強(qiáng)度光質(zhì)：光的波長1、光周期對植物細(xì)胞脫分化和再分化的效應(yīng)

例1：黑暗中培養(yǎng)的煙草花藥，其胚狀體的分化與幼植物的生長，同經(jīng)光照培養(yǎng)一樣的多

例2：短日照敏感的葡萄品種，它的莖切段，僅在短日照條件下才能分化成根

例3：對日照不敏感的葡萄品種，可在任何光周期下分化成根

結(jié)論：光周期的需要與否，應(yīng)根據(jù)植物種類、培養(yǎng)的目的來決定

離體培養(yǎng)中光周期的調(diào)節(jié)

最常用的周期是16h的光照，8h的黑暗。