真核細胞培養(yǎng)中的常見問題及其解決方案

真核細胞培養(yǎng)中的常見問題及其解決方案在生物學和醫(yī)學研究中，真核細胞培養(yǎng)是一項至關重要的技術。然而，這一過程中常常會遇到各種挑戰(zhàn)和問題，這些問題可能會影響細胞的生長、繁殖和功能。本文將探討真核細胞培養(yǎng)中常見的幾個問題，并提供相應的解決方案，以幫助研究人員更好地掌握細胞培養(yǎng)技術，提高實驗效率。1.細胞培養(yǎng)不貼壁可能原因①胰蛋白酶消化過度②支原體污染③培養(yǎng)液中無貼壁因子解決方法①縮短胰蛋白酶消化時間或降低胰蛋白酶濃度②分離培養(yǎng)物，檢測支原體③清潔支架和培養(yǎng)箱2.培養(yǎng)液PH變化過快可能原因①CO2張力不對②培養(yǎng)瓶蓋擰得太緊③NaHCO3緩沖系統(tǒng)緩沖力不足④培養(yǎng)液中鹽濃度不正確⑤細菌、酵母或真菌污染解決方法①按培養(yǎng)液中NaHCO3濃度增加或減少培養(yǎng)箱內CO2濃度，2.0g/L到3.7g/L濃度NaHCO3對應CO2濃度為5％到10％②改用不依賴CO2培養(yǎng)液。松開瓶蓋1/4圈③加HEPES緩沖液至10到25mM終濃度④在CO2培養(yǎng)環(huán)境中改用基于Earle’s鹽配制的培養(yǎng)液，在大氣培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)改用Hank’s鹽配制的培養(yǎng)液⑤丟棄培養(yǎng)物或用抗生素除菌3.細胞生長緩慢可能原因①更換了不同培養(yǎng)液或血清②試劑保存不當③培養(yǎng)物中有少量細菌或真菌污染④培養(yǎng)液中一些細胞生長必需成分如谷氨酰胺或生長因子耗盡或缺乏或已被破壞解決方法①比較新培養(yǎng)液與原培養(yǎng)液成分②比較新血清與舊血清支持細胞生長實驗③增加起始培養(yǎng)細胞濃度④換入新鮮配制培養(yǎng)液，讓細胞逐漸適應新培養(yǎng)液⑤補加谷氨酰胺或生長因子⑥用無抗生素培養(yǎng)液培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)污染，丟棄⑦用抗生素除菌4.細胞培養(yǎng)時死亡可能原因①培養(yǎng)箱內無CO2②培養(yǎng)箱內溫度波動太大③細胞凍存或復蘇過程中損傷④培養(yǎng)液滲透壓不正確⑤培養(yǎng)液種有毒代謝產(chǎn)物堆積解決方法①檢測培養(yǎng)箱內CO2②檢查培養(yǎng)箱內溫度③取新的保存細胞種④檢測培養(yǎng)液滲透壓注意：大多數(shù)哺乳動物細胞能耐受滲透壓為260–350mOsm/kg。加入額外試劑如HEPES或藥物都有可能影響培養(yǎng)液滲透壓。5.黑膠蟲污染黑膠蟲污染常在培養(yǎng)條件改變、細胞接種密度降低、細胞狀態(tài)不佳時顯現(xiàn)，尤其在凍存細胞復蘇時可造成大量細胞死亡。感染黑膠蟲細胞的表現(xiàn)：①細胞培養(yǎng)時生長的旺盛，小黑點會越來越少，反之則多②可以穿透濾膜，也可以通過細胞培養(yǎng)箱空氣進行污染③換掖沖洗后也無多大作用④低倍鏡下觀察為黑色點狀，高倍鏡（400X）下作不規(guī)則布朗運動解決方法①體外細胞培養(yǎng)時更換好一點的血清②如果是貼壁細胞的話，可用無菌的PBS洗幾次，可一定程度上緩解。若是懸浮的話，可以向其中少加一點滋養(yǎng)細胞（從小鼠腹腔內取的巨噬細胞），加滋養(yǎng)細胞對有黑膠蟲的剛復蘇的細胞很有一定作用③在換液前先加入生理鹽水并輕輕拍打，沖洗干凈后再加入細胞培養(yǎng)液，堅持天天洗，細胞傳代時加生理鹽水再離心一次，稍微加大接種密度，一段時間后，黑膠蟲數(shù)目會顯著減少④環(huán)丙沙星+哌拉西林，各10ug/ml，選擇片劑，1.5一盒/6片，每片含環(huán)丙沙星0.25g，磨成粉，PBS溶解，稀釋到適當濃度，過濾，4度保存。哌拉西林用的注射粉劑，2.5g/瓶，溶解到相