高效液相色譜法原理與應用-

高效液相色譜法原理與應用參考書《高效液相色譜及其應用》《液相色譜檢測方法》《實用高效液相色譜法的建立》1第1章色譜根本原理一、色譜法概述色譜法的定義與特點色譜法的別離原理色譜法的特點色譜法的分類21.色譜法的定義茨維特的實驗3色譜別離效果圖4因此色譜法是一種別離方法。它的特點是：有兩相，一是固定相，一是流動相，兩相作相向運動。Chromatography將色譜法用于分析中，那么稱為色譜分析。色譜分析是一種別離、分析法。52、色譜法別離原理當流動相中所攜帶的混合物流過固定相時，就會和固定相發(fā)生作用(力的作用)。由于混合物中各組分在性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上有差異，與固定相發(fā)生作用的大小也有差異。因此在同一推動力作用下，不同組分在固定相中的滯留時間有長有短，從而按先后不同的次序從固定相中流出。63、色譜法的分類

按流動相狀態(tài)的不同，可分為氣相色譜法(GC)液相色譜法(LC)超臨界流體色譜(SFC)7什么是氣相色譜法？以氣體為流動相的色譜法GasChromatogaphy，簡稱GC適合別離分析易汽化〔在-190℃-500℃范圍內(nèi)有0.2-10mmHg的蒸氣壓的〕穩(wěn)定、不易分解、不易反響的樣品，特別適合用于同系物、同分異構(gòu)體的別離。8應用舉例〔GC〕9什么是液相色譜法？以液體為流動相的色譜法LiquidChromatogaphy，簡稱LC適合別離分析高沸點、熱不穩(wěn)定、離子型的樣品。10按固定相使用的形式可液相色譜法又可分為：柱色譜〔ColumnChromatography〕將固定相裝在色譜柱內(nèi)紙色譜〔PaperChromatography〕用濾紙做固定相或固定相載體的色譜薄層色譜〔ThinLayChromatography〕固定相均勻涂在玻璃板或塑料板上11TLC的應用123456789BandsDescription1PseudoginsenosideF112AmericanGinseng3GinsenosideRg14GinsenosideRf5Ginseng6GinsenosideRc7GinsenosideRb18Notoginseng9NotoginsenosideR1人參、西洋參和三七藥材的鑒別12丹參藥材有效成分的HPLC圖譜1.Danshensu;2.Protocatechuicacid;3.Protocatechualdehyde;4.Caffeicacid;5.SalvianolicacidF;6.SalvianolicacidD;7.SalvianolicacidJ/isomer;8.SalvianolicacidE;9.Rosmarinicacid;10.Lithospermicacid;11.SalvianolicacidB;12.SalvianolicacidB/E/isomer;13.SalvianolicacidA;14.DihydrotanshinoneI;15.Tetrahydrotanshinone/isomer;16.Cryptotanshinone;17.TanshinoneI;18.TanshinoneIIA1234568710911121615141317181314拖尾峰伸舌峰鬼峰、假峰畸峰峰底基線漂移基線噪聲譜帶擴張15死時間(tM):完全不保存組分流出系統(tǒng)的時間保存時間(tR):調(diào)整保存時間(t’R):死體積(VM):保存體積(VR):調(diào)整保存體積(V’R):16R:別離度tR:保存時間t0：死時間W：峰底寬度2.色譜別離根本方程17不同R值的峰重疊情況示意圖R>1.5可以得到基線別離別離度R反映的是相鄰兩個峰的分開程度R太小，兩個峰無法徹底別離R太大，別離時間過長，工作效率低下一般要求R>1.5，也可遵循行業(yè)特殊規(guī)定18根據(jù)該公式優(yōu)化試驗條件，提高別離度R。從數(shù)學推導來看，分別增大n，α，k值，都可以提高別離度。色譜別離根本方程19別離選擇性〔α〕對別離度〔R〕的影響如果t0=1minα=1.64/1.58=1.04α

=1.15/0.85=1.35α

=0.95/0.63=1.50改變別離選擇性α的方法改用不同的流動相改變流動相的組成α并非必須大于1.5！改變流動相pH值盡量優(yōu)化前幾種實驗條件提高a值，改變柱溫防止改變固定相〔買新柱子〕，以便降低本錢應用特殊的化學效應改變固定相20柱效〔n〕對別離度〔R〕的影響以上兩張譜圖k，,α值完全相同，僅僅由于柱效上下不同使得它們具有不同的別離度。直觀的看，峰的鋒利程度代表了柱效上下，峰越鋒利，其柱效越高，通常使用理論塔板數(shù)〔n〕的大小衡量柱效的上下21理論塔板數(shù)和理論塔板高度的計算方法理論塔板數(shù)理論塔板高度HETP=L/n理論塔板數(shù)n越大，柱效越高；理論塔板數(shù)HETP越效，柱效越高22容量因子〔k〕對別離度〔R〕的影響容量因子越大，別離度越大。k135791113∞k/k+10.500.750.830.880.900.920.931.00但當容量因子大于10，k/(k+1)的改變不大，而分析時間將大大延長。因此，k的最正確范圍是1<k<20。改變?nèi)萘恳蜃拥姆椒ㄓ校焊淖冎鶞馗淖冎荔w積，其中死體積對k/(k+1)的影響很大。改變流動相的配比是最簡便、最有效的方法梯度洗提容量因子23梯度洗提梯度洗脫即程序控制流動相的組成，使在整個別離過程中，溶劑強度按照特定的變化規(guī)律增加。優(yōu)點：別離復雜混合物，使所有組分都處在最正確的k值范圍內(nèi)。缺點：檢測器的使用受到限制，分析結(jié)果的重復性取決于流速的穩(wěn)定性。柱子需進行再生處理。2425裝置低壓梯度〔內(nèi)梯度〕：溶劑在常壓下混合，再用高壓泵輸送至柱系統(tǒng)。簡單、經(jīng)濟，只需一個泵，所用溶劑的元數(shù)沒有限制。高壓梯度〔外梯度〕：一般由兩臺高壓泵構(gòu)成，每臺泵輸送一種溶劑。溶劑在混合室混合后，在輸入柱系統(tǒng)。流量精密度高，溶劑的可壓縮性和熱力學體積的變化可能影響輸入柱子中溶劑的組成。26溶劑A溶劑B電磁閥A電磁閥B混合室泵溶劑A溶劑B高壓泵A

高壓泵B混合室低壓溶劑梯度方框圖高壓溶劑梯度方框圖27實現(xiàn)方式對于復雜樣品，線性梯度是最好的。正相色譜中，常用二氯甲烷參加正己烷來實現(xiàn)。反相色譜中，乙腈，甲醇參加水中是最常用的。28溫度的影響n，α，k都會受到柱溫的影響不要使用過高溫度，以保護柱子，60度算高溫溫度對平衡常數(shù)有影響，有時會影響出峰順序，注意對化合物進行定性后再定量升溫通常可以加速別離，縮短分析時間，但也不絕對29三、色譜定性與定量方法301.色譜定性分析(1)純物對照定性各物質(zhì)在一定的色譜條件下均有確定不變的保存值，因此保存值可作為定性指標。31實現(xiàn)方法利用保存時間和保存體積定性32用相對保存值定性用物增加峰高法定性33應用范圍：適用于簡單混合物，對該樣品已有了解并具有純物質(zhì)的情況。優(yōu)點：應用簡便，不需要其他儀器。缺點：定性結(jié)果的可信度不高。提高可信度的方法：雙柱、雙體系定性34(2)與其它儀器或化學方法聯(lián)合定性離線聯(lián)用方式化學法儀器法在線聯(lián)用方式化學法儀器法35離線聯(lián)用方式收集方法：餾分收集器應用范圍：無標準物時，可對較為復雜的混合物進行定性分析缺點：麻煩36在線聯(lián)用方式與其它儀器聯(lián)用定性混合物經(jīng)色譜別離后，將各組分直接由接口導入其它儀器中進行定性。常用的聯(lián)用方法有：LC-FTIR、LC-MS……其它儀器相當于色譜儀的檢測器。使用范圍：復雜樣品的定性。優(yōu)點：不需要標準物，定性結(jié)果可信度高，操作方便。缺點：需要特殊儀器或設備。372色譜定量分析(1)色譜定量根底色譜定量分析是基于被測物質(zhì)的量與峰面積成正比。在一定色譜條件下有：38〔2〕定量要解決的問題峰面積的測量和計算校正因子的測量與計算色譜定量方法及其應用39峰面積的測量與計算積分儀或色譜工作站簡便、速度快，精度高，可達0.2-2%，對小峰及不對稱峰的結(jié)果準確，是色譜開展趨勢。手動測量與計算40峰高乘半峰寬法：適于對稱峰峰高乘峰底寬度法：適于矮寬峰峰高乘平均峰寬法：適于不對稱峰峰高乘保存值法：適于狹窄峰，快速簡便，常用于工廠控制分析。41重疊峰的測量切線分峰垂線分峰42連線分峰計算機擬合分峰43校正因子的測量與計算相對校正因子由于絕對校正因子與儀器的靈敏度有關(guān)，又由于靈敏度與實驗條件相關(guān)，且每一檢測器的靈敏度都是不同的，它不容易測量準確，亦無通用性，所以實際工作中使用相對校正因子。44質(zhì)量校正因子摩爾校正因子相對響應值被測組分的質(zhì)量標準物質(zhì)量分子量45定量方法校正歸一化法——含歸一化內(nèi)標法——含內(nèi)標標準曲線法外標法——含單點校正46校正歸一化法推導：47應用范圍：當試樣中各組分都能流出色譜柱，且在檢測器上均有響應，各組分峰沒有重疊時，可用此法。優(yōu)點：簡便、準確，當操作條件如進樣量等變化時，對定量結(jié)果影響很小，該法適合于常量物質(zhì)的定量。缺點：對該法的苛刻要求限制了它的使用。48面積歸一化法假設各組分的定量校正因子相近或相同，那么上式可簡化為：49內(nèi)標法推導將一定量的純物質(zhì)作為內(nèi)標物，參加到準確稱量的試樣中。單點校正50適用范圍：當只需測定試樣中某幾個組分，且試樣中所有組分不能全部出峰時可用。優(yōu)點：受操作條件的影響較小，定量結(jié)果較準確，使用上不象歸一化法那樣受到限制，此法適合于微量物質(zhì)的分析。缺點：每次分析必須準確稱量被測物和內(nèi)標物，不適合于快速分析。51內(nèi)標標準曲線法〔多點校正內(nèi)標法〕fi,sms/m為常數(shù)K，此時Ci%=K·(Ai/As)，以Ci%對Ai/As作標準曲線。優(yōu)點：不必測校正因子，消除了某些操作條件的影響，方法簡便，適合液體試樣的常規(guī)分析。。52外標法〔標準曲線法〕用于常規(guī)分析優(yōu)點：操作簡單，計算方便。缺點：結(jié)果的準確度取決于進樣量的重現(xiàn)性和操作條件的穩(wěn)定性。該法必須定量進樣。53單點校正當被測試樣中各組分的濃度變化范圍不大時而用單點校正法。即配制一個與被測組分含量十分接近的標準溶液，定量進樣，計算被測物的含量。54〔3〕定量中的誤差問題樣品的代表性〔樣品的前處理〕進樣系統(tǒng)的影響柱系統(tǒng)的影響測量誤差定量結(jié)果的誤差分析55HPLC主要類型及其選擇

化學鍵合相色譜法液固色譜法離子對色譜法離子色譜法體積排阻色譜法56一、化學鍵合相色譜法1.分類正相鍵合相色譜法(Normalphasechromatography)：固定相的極性大于流動相的極性，適用于別離油溶性或水溶性的極性或強極性化合物反相鍵合相色譜法(Reversedphasechromatography)：固定相的極性大于流動相的極性，適于別離非極性、極性和離子性化合物。應用最廣泛57正相色譜法與反相色譜法比較表

正相色譜法反相色譜法固定相極性高～中中～低流動相極性低～中中～高組分洗脫次序極性小先洗出極性大先洗出582.固定相

疏水基團如不同鏈長的烷烴〔C8和C18〕和苯基等極性基團如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。59類型分離方式應用特點C-18反相、離子對普適性好，保留值大。溶于水的高極性化合物、中等極性化合物C-8反相、離子對與C-18類似，保留值略小C-3,C-4反相保留值小，適合肽類和蛋白質(zhì)苯基反相保留適中，選擇性不同。非極性、中等極性化合物-CN反相、正相選擇性與硅膠類似，保留小，用途廣-NH2反相、正相、離子交換分離糖類、核苷酸、固醇等二醇基正相分離有機酸、排阻分蛋白質(zhì)等醚基反相、正相分離酚類、芳硝基化合物，保留比C-18強聚苯乙烯基反相PH使用范圍廣，對部分分離峰形好，壽命長常用固定相6061不同廠商固定相的比較623.流動相溶劑具有穩(wěn)定的化學性質(zhì)溶劑的選擇與使用的檢測器要有相容性溶劑的粘度要小溶劑的沸點不能太低溶劑的純度要高且價格廉價正相：正己烷、正庚烷、乙醚、二氯甲烷、氯仿等，己烷為主體，參加質(zhì)子接受體乙醚或甲基叔丁基醚，質(zhì)子給予體氯仿，偶極溶劑二氯甲烷反相：水、甲醇、乙腈、四氫呋喃、乙醇及其混合物等，以水為主體，參加質(zhì)子接受體甲醇，質(zhì)子給予體乙腈，偶劑溶劑四氫呋喃。634.影響保存值的因素溶質(zhì)結(jié)構(gòu)對保存值的影響：正相：溶質(zhì)極性越強，官能團越多，保存值越大反相：溶質(zhì)極性越弱，疏水性越強，保存值越大。溶質(zhì)的保存值與其分子非極性局部的總面積有關(guān)，面積大，保存值大。6465烷基鍵合固定相特性對保存值的影響：反相：鍵合相烷鏈長，k大，選擇性好。66溶劑性質(zhì)：正相：溶劑極性越弱，保存越大反相：流動相外表張力大、介電常數(shù)大，那么極性越強。其斥力越大，溶質(zhì)與固定相鍵合越強，保存值越大。67鹽的影響：通常參加醋酸鹽、硼酸鹽、硫酸鹽等。無機鹽使流動相外表張力增大，對非離子性溶質(zhì)，使k增加，對離子型溶質(zhì)，k下降。對堿性有機物有改善峰形的作用。pH值：參加酸、堿或緩沖液，控制PH，抑制溶質(zhì)的離子化，改善峰形。用于分析弱酸、堿。685應用69二.液固色譜法

LiquidSolidChromatography1.固定相極性：硅膠、氧化鎂、氧化鋁等非極性：活性炭、高分子多孔微球、碳多孔微球等2.流動相硅膠為固定相時：以弱極性的正構(gòu)烷烴為主體，參加二氯甲烷等中等極性溶劑調(diào)節(jié)適宜的洗脫強度?？捎盟畬枘z進行減活處理，或參加四氫呋喃、乙腈、甲醇、異丙醇等改性劑703.影響保存值的因素樣品分子結(jié)構(gòu)溶質(zhì)分子的官能團極性增加，保存值增加溶質(zhì)分子的官能團數(shù)目增加，保存值增加保存值與溶質(zhì)的空間效應有關(guān)保存值與吸附中心的幾何分布有關(guān)b．吸附劑吸附劑的孔徑越小，外表積越大，保存值越大吸附劑的活性越強，保存值越大，活性由流動相中的含水量來控制c．流動相714.應用中等分子量的油溶性樣品如油品、脂肪、芳烴等不同極性取代基的化合物結(jié)構(gòu)異構(gòu)體和幾何異構(gòu)體混合物的別離7273三、離子對色譜法

Ion-pairchromatography

1.根本原理將一種或數(shù)種與樣品離子電荷〔A+〕相反的離子(B-)〔稱為對離子或反離子〕參加到色譜系統(tǒng)流動相中，使其與樣品離子結(jié)合生成弱極性的離子對〔中性締合物〕的別離方法。多為反相離子對色譜7475762.固定相、流動相和離子對試劑固定相多為C18,C8反相鍵合相流動相是以水為主的緩沖液，或水-甲醇、水-乙腈等混合溶劑離子對試劑：四丁基銨正離子、十六烷基三甲基銨正離子，ClO4-，十二烷基磺酸根等773.影響保存值的因素pH的影響：改善別離選擇性的有效方法。反相中，對于陰離子的別離，pH下降，k減小。離子對試劑的性質(zhì)與濃度：反相中，離子對試劑烷基鏈越長，疏水性越大，k越大。溶劑的極性：反相中，甲醇、乙腈等含量增加，洗脫強度增大，k下降。洗脫強度與極性參數(shù)、介電常數(shù)同時相關(guān)離子強度：反相中，離子強度增加，溶質(zhì)k下降784.應用有機酸、有機堿特別是強酸強堿的分析，如羧酸、磺酸、胺類、酚類、藥物、染料等反相離子對色譜分析有機酸固定相：C18烷基鍵合相流動相：0.03mol/L四丁基銨+戊醇1.4-氨基苯甲酸；2.3-氨基苯甲酸；3.4-羥基苯甲酸；4.3-羥基苯甲酸；5.苯磺酸；6.苯甲酸；7.甲苯-4-磺酸79色譜類型（Mode）固定相（StationaryPhase）流動相(MobilePhase)主要適用范圍(CompoundSepatated)正相色譜（Normal-Phase）硅膠、氰基、氨基有機溶劑在水中絕對不溶解的物質(zhì)或同分異構(gòu)體反相色譜色譜(Reversed-Phase)C-18,C-8,C-4,C-2水/有機溶劑中性、弱酸性、弱堿性物質(zhì)離子對色譜(Ion-Pair)C18,C-8水/有機溶劑離子對試劑離子離子交換色譜(IonExchange)陰離子和陽離子交換劑水相/緩沖鹽對離子離子體積排阻色譜(SizeExclusion)聚酯、硅膠水相(GPC)有機相(GPC)大分子量化合物聚合物液相色譜常用類型總結(jié)：80第3章高效液相色譜法的建立與應用81我國藥典收載高效液相色譜法工程和數(shù)量比較表：82高效液相色譜儀的分析原理高效液相色譜儀的結(jié)構(gòu)色譜柱在高效液相色譜儀中的作用和峰形產(chǎn)生原理高壓泵進樣器檢測器色譜工作站色譜柱83HPLC有以下特點

高壓——壓力可達150~300Kg/cm2。色譜柱每米降壓為75Kg/cm2以上。高速——流速為0.1~10.0ml/min。高效——可達10000塔板每米。在一根柱中同時別離成份可達100種。高靈敏度——紫外檢測器靈敏度可達0.01ng。同時消耗樣品少。84HPLC與經(jīng)典液相色譜相比有以下優(yōu)點：

速度快——通常分析一個樣品在15~30min，有些樣品甚至在5min內(nèi)即可完成。分辨率高——可選擇固定相和流動相以到達最正確別離效果。靈敏度高——紫外檢測器可達0.01ng，熒光和電化學檢測器可達0.1pg。柱子可反復使用——用一根色譜柱可別離不同的化合物。樣品量少，容易回收——樣品經(jīng)過色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備。85Inwhichmaterials?Inwhatconcentration?Whichsample?Withwhichtechnique?一.高效液相色譜法的建立1.了解樣品86Whatisthesample?ConcentrationoftheinterestedcomponentContaminantCharacteristicsofthesampleStructureMolecularweightpKaSolubility87

溶于水——排阻色譜，水為流動相相對分子質(zhì)量＞2000不溶于水——排阻色譜，非水流動相同系物——分配色譜不溶于水異構(gòu)體——吸附色譜樣品分子大小差異——排阻色譜反相液一液色譜相對分子質(zhì)量溶于水，不離解＜2000排阻色譜，水為流動相堿——陽離子交換色譜溶于水，可離解酸——陰離子交換色譜溶于水，離子與非離子—反相離子對色譜

882.選擇適宜的分析方法AnalyticaltechniqueColumnMobilephaseDetectorSamplepreparation893.分析條件的優(yōu)化流動相種類與配比梯度溫度流速檢測波長進樣量90二、高效液相色譜法的應用樣品測定1．流動相比例調(diào)整：由于我國藥品標準中沒有規(guī)定柱的長度及填料的粒度，因此每次新開檢新品種時幾乎都須調(diào)整流動相〔按經(jīng)驗，主峰一般應調(diào)至保存時間為6~15分鐘為宜〕。所以建議第一次檢驗時請少配流動相，以免浪費。弱電解質(zhì)的流動相其重現(xiàn)性更不容易到達，請注意充分平衡柱。91樣品測定

2．樣品配制：①溶劑；②容器：塑料容器常含有高沸點的增塑劑，可能釋放到樣品液中造成污染，而且還會吸留某些藥物，引起分析誤差。某些藥物特別是堿性藥物會被玻璃容器外表吸附，影響樣品中藥物的定量回收，因此必要時應將玻璃容器進行硅烷化處理。92樣品測定3．記錄時間：第一次測定時，應先將空白溶劑、對照品溶液及供試品溶液各進一針，并盡量收集較長時間的圖譜〔如30分鐘以上〕，以便確定樣品中被分析組分峰的位置、別離度、理論板數(shù)及是否還有雜質(zhì)峰在較長時間內(nèi)才洗脫出來，確定是否會影響主峰的測定。93樣品測定4．進樣量：藥品標準中常標明注入10l，而目前多數(shù)HPLC系統(tǒng)采用定量環(huán)〔10l、20l和50l〕，因此應注意進樣量是否一致?！部筛淖儤右簼舛取?4樣品測定5．計算：由于有些對照品標示含量的方式與樣品標示量不同，有些是復合鹽、有些含水量不同、有些是鹽基不同或有些是采用有效部位標示，檢驗時請注意。

95方法研究

1．波長選擇：首先在可見紫外分光光度計上測量樣品液的吸收光譜，以選擇適宜的測量波長，如最靈敏的測量波長并避開其它物質(zhì)的干擾。從紫外光譜中還可大體知道在HPLC中的響應值，如吸收度小于0.5時，HPLC測定的面積將會很小。2．流動相選擇：盡量采用不是弱電解質(zhì)的甲醇-水流動相。96食品分析9798992.環(huán)境分析1001013.藥物分析102103人參皂苷的分析1045.農(nóng)藥分析105第4章儀器使用細節(jié)1061.HPLC用水專門的純水機或超純水機；去離子水重蒸；二次或三次重蒸水；采用類似家用的純水機；市場上瓶裝的純潔水或蒸餾水；其它途徑；1072.樣品溶解樣品用溶劑最好是流動性，或者用溶劑強度與流動相相近的溶劑。進樣樣品要求無微粒，樣品溶液均要用0.45μm的濾膜過濾。1083.流動相的配制流動相通常按體積比配制。流動相在使用前一般都需要過濾，尤其使用了加緩沖鹽的流動相時。如果沒有自動脫氣裝置，流動相配好后應該采用適宜的方法脫氣，如超聲波脫氣，真空脫氣、氦氣脫氣等。109在HPLC系統(tǒng)中使用的注射器針頭有別于氣相色譜，是平頭注射器。一方面，針頭外側(cè)緊貼進樣器密封管內(nèi)側(cè)，密封性能好，不漏液，不引入空氣；另一方面，也防止了針頭刺壞密封組件及定子。盡快轉(zhuǎn)動閥，不能停留在中途，否那么過高的壓力在柱頭上引起損壞。六通閥進樣器的進樣方式有局部裝液法和完全裝液法兩種。使用局部裝液法進樣時，進樣量最多為定量環(huán)體積的75，并且要求每次進樣體積準確、相同；使用完全裝液法進樣時，進樣量最少為定量環(huán)體積的3至5倍，即20μl的定量環(huán)最少進樣60至100μl的樣品，這樣才能完全置換樣品定量環(huán)內(nèi)殘留的溶液，到達所要求的精密度及重現(xiàn)性。4.六通閥的使用110防止微粒阻塞進樣閥和減少對進樣閥的磨損。為防止緩沖鹽和其它殘留物質(zhì)留在進樣系統(tǒng)中，每次結(jié)束后應沖洗進樣器，通常用不含鹽的稀釋劑、水或不含鹽的流動相沖洗，在進樣閥的Load和Inject位置反復沖洗，。1115.泵的保養(yǎng)使用流動相盡量要清潔；進液處的砂芯過濾頭要經(jīng)常清洗；流動相交換時要防止沉淀；防止泵內(nèi)堵塞或有氣泡；112色譜柱問題及解決方法：保存值和別離度的重現(xiàn)性：影響方法的準確度與精密度譜峰拖尾：別離質(zhì)量下降，精密度下降色譜柱壽命6.色譜柱113114樣品溶劑對別離結(jié)果的影響115柱子在任何情況下不能碰撞、彎曲或強烈震動；當柱子和色譜儀聯(lián)結(jié)時，閥件或管路一定要清洗干凈；要注意流動相的脫氣；防止使用高粘度的溶劑作為流動相；進樣樣品要提純；嚴格控制進樣量；每天分析工作結(jié)束后，要清洗進樣閥中殘留的樣品；每天分析測定結(jié)束后，都要用適當?shù)娜軇﹣砬逑粗患僭O分析柱長期不使用，應用適當有機溶劑保存并封閉；116高效液相色譜柱開展史19世紀70年代中期，HPLC儀開始出現(xiàn)，主要填料：10μm的無定型硅膠顆粒。70年代后期，開展了反相液相色譜。80年代，HPLC被廣泛應用于化合物的別離，主要填料：粒徑為5～10μm球形硅膠。90年代早期，粒徑為5μm的高純硅膠，即所謂的B型硅膠被開展，并成為這個行業(yè)填料的標準，這種B型硅膠含有微量的金屬。90年代后期，為了滿足快速別離的需求，開展了3μm或3.5μm的球形硅膠，其作用和性能逐漸的獲得了人們的認同和接受。21世紀早期，為適應超快速的別離要求，粒徑小于2μm的填料被開發(fā)出來，開展出了整體柱、無機和有機雜化硅膠。目前，市場上流行的分析用的HPLC硅膠基質(zhì)填料主要為B型硅膠。117PLC色譜柱及其填料的特征HPLC色譜柱的基質(zhì)材料硅膠與聚合物現(xiàn)代高效液相色譜填料的特征色譜柱結(jié)構(gòu)固定相鍵合相色譜柱接頭鍵合相穩(wěn)定性118硅膠基質(zhì)材料目前應用最為廣泛的基質(zhì)材料。高機械強度和高的比外表積。可利用直接的廣泛的外表鍵合反響來滿足正相、反相、離子交換、疏水作用色譜和體積排除色譜的需求。高效。重現(xiàn)性好。pH適用范圍為pH2－8。具有容易導致強堿性物質(zhì)拖尾的，外表活性和帶酸性的硅羥基。119聚合物基質(zhì)材料交聯(lián)苯乙烯、二乙烯基苯和甲基苯烯酸酯。pH穩(wěn)定性好：pH1－13。可以在很寬的范圍內(nèi)進行外表化學處理以滿足反相色譜、離子交換色譜、疏水作用色譜和體積排阻色譜的需求。在中等pH條件下對強堿性物質(zhì)具有更好的峰形。填料的體積隨著流動相的不同而改變，如膨脹或收縮。別離效率相對硅膠而言比較低重現(xiàn)性不好120硅膠外形球形硅膠:現(xiàn)代HPLC填料粒徑小(5μm,3μm,<2μm)重現(xiàn)性好穩(wěn)定性好別離效率高無定型硅膠:最初的HPLC填料粒徑>5μm柱床穩(wěn)定性差比外表積較小價格廉價121硅膠純度硅膠純度對強極性化合物的別離最重要。以前的純度較低的硅膠〔稱為A型硅膠〕,A型硅膠是以金屬硅酸鹽制備而來，具有很高的金屬含量，可被用作中性化合物和非離子化合物的別離。純度高、酸性較弱的硅膠(稱為B型硅膠)，這種硅膠是以無金屬的工藝制備而來，只含有微量的金屬，建議用于別離離子化合物和可電離的化合物，特別是堿性化合物。金屬雜質(zhì)引起對螯合劑和堿性化合物的別離產(chǎn)生不對稱峰或拖尾峰。122硅膠純度M+表面金屬能與螯合化合物絡合MSiOH內(nèi)部的金屬對表面硅羥基具有活化作用強酸性A型硅膠C18B型硅膠C18123硅膠孔徑孔徑作用和效能<60nm對HPLC分析沒有用，會引起峰形拖尾和較低的分離效率60–150nm對小分子的分離效果理想(MW<4,000to130,000),例如藥物分子、傳統(tǒng)的中藥和小分子的縮氨酸300–1,000nm對大分子的分離效果理想，如多肽、核苷和高分子>1,000nm對聚合物的分離效果理想，如DNA和生物大分子124硅膠粒徑粒徑作用和效能5μm目前應用最廣泛，可以滿足從分析到半制備的分離3–3.5μm常用于分析柱上的快速分離，色譜柱短，節(jié)省溶劑<2μm常應用于超快速分離，highthroughput,分離度高7–10μm常用于半制備色譜柱10–20μm常用于制備色譜柱125HPLC色譜柱結(jié)構(gòu)類型內(nèi)徑D(cm)柱長(cm)粒徑(μm)分析柱0.3–0.463-253-10微孔柱0.1,0.2115,253-8半制備柱0.8–1.010-255-20制備柱2.0–5.010-255-20126鍵合相鍵合相:反相:70%;C18,65%;C8,15%;Cyano,5%,苯基柱<5%,正相:20%;硅膠、-NH2、-CN其它(手性柱,離子交換柱):10%反相色譜是目前應用得最為廣泛的高效液相色譜方法。C18和C8在反相色譜終應用得最為廣泛。127封尾封尾是用如三甲基硅烷等小分子與鍵合了C18以后的硅膠進行進一步的反響。由于硅烷相對很大的體積，使得C18和其它鍵合相在發(fā)生鍵合反響時只能覆蓋不到硅膠外表的50%。硅膠外表未被鍵合的酸性硅羥基將會與被分析物相互作用，特別是在中性條件下會對強堿性化合物產(chǎn)生嚴重的峰形拖尾。封尾工藝使得外表剩余的硅羥基被進一步的消除，為小分子所取代。封尾工藝能促使色譜柱對極性和堿性化合物的別離具有良好的峰形。128