高效液相色譜法原理與應(yīng)用-

高效液相色譜法原理與應(yīng)用參考書《高效液相色譜及其應(yīng)用》《液相色譜檢測(cè)方法》《實(shí)用高效液相色譜法的建立》1第1章色譜根本原理一、色譜法概述色譜法的定義與特點(diǎn)色譜法的別離原理色譜法的特點(diǎn)色譜法的分類21.色譜法的定義茨維特的實(shí)驗(yàn)3色譜別離效果圖4因此色譜法是一種別離方法。它的特點(diǎn)是：有兩相，一是固定相，一是流動(dòng)相，兩相作相向運(yùn)動(dòng)。Chromatography將色譜法用于分析中，那么稱為色譜分析。色譜分析是一種別離、分析法。52、色譜法別離原理當(dāng)流動(dòng)相中所攜帶的混合物流過固定相時(shí)，就會(huì)和固定相發(fā)生作用(力的作用)。由于混合物中各組分在性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上有差異，與固定相發(fā)生作用的大小也有差異。因此在同一推動(dòng)力作用下，不同組分在固定相中的滯留時(shí)間有長(zhǎng)有短，從而按先后不同的次序從固定相中流出。63、色譜法的分類

按流動(dòng)相狀態(tài)的不同，可分為氣相色譜法(GC)液相色譜法(LC)超臨界流體色譜(SFC)7什么是氣相色譜法？以氣體為流動(dòng)相的色譜法GasChromatogaphy，簡(jiǎn)稱GC適合別離分析易汽化〔在-190℃-500℃范圍內(nèi)有0.2-10mmHg的蒸氣壓的〕穩(wěn)定、不易分解、不易反響的樣品，特別適合用于同系物、同分異構(gòu)體的別離。8應(yīng)用舉例〔GC〕9什么是液相色譜法？以液體為流動(dòng)相的色譜法LiquidChromatogaphy，簡(jiǎn)稱LC適合別離分析高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定、離子型的樣品。10按固定相使用的形式可液相色譜法又可分為：柱色譜〔ColumnChromatography〕將固定相裝在色譜柱內(nèi)紙色譜〔PaperChromatography〕用濾紙做固定相或固定相載體的色譜薄層色譜〔ThinLayChromatography〕固定相均勻涂在玻璃板或塑料板上11TLC的應(yīng)用123456789BandsDescription1PseudoginsenosideF112AmericanGinseng3GinsenosideRg14GinsenosideRf5Ginseng6GinsenosideRc7GinsenosideRb18Notoginseng9NotoginsenosideR1人參、西洋參和三七藥材的鑒別12丹參藥材有效成分的HPLC圖譜1.Danshensu;2.Protocatechuicacid;3.Protocatechualdehyde;4.Caffeicacid;5.SalvianolicacidF;6.SalvianolicacidD;7.SalvianolicacidJ/isomer;8.SalvianolicacidE;9.Rosmarinicacid;10.Lithospermicacid;11.SalvianolicacidB;12.SalvianolicacidB/E/isomer;13.SalvianolicacidA;14.DihydrotanshinoneI;15.Tetrahydrotanshinone/isomer;16.Cryptotanshinone;17.TanshinoneI;18.TanshinoneIIA1234568710911121615141317181314拖尾峰伸舌峰鬼峰、假峰畸峰峰底基線漂移基線噪聲譜帶擴(kuò)張15死時(shí)間(tM):完全不保存組分流出系統(tǒng)的時(shí)間保存時(shí)間(tR):調(diào)整保存時(shí)間(t’R):死體積(VM):保存體積(VR):調(diào)整保存體積(V’R):16R:別離度tR:保存時(shí)間t0：死時(shí)間W：峰底寬度2.色譜別離根本方程17不同R值的峰重疊情況示意圖R>1.5可以得到基線別離別離度R反映的是相鄰兩個(gè)峰的分開程度R太小，兩個(gè)峰無法徹底別離R太大，別離時(shí)間過長(zhǎng)，工作效率低下一般要求R>1.5，也可遵循行業(yè)特殊規(guī)定18根據(jù)該公式優(yōu)化試驗(yàn)條件，提高別離度R。從數(shù)學(xué)推導(dǎo)來看，分別增大n，α，k值，都可以提高別離度。色譜別離根本方程19別離選擇性〔α〕對(duì)別離度〔R〕的影響如果t0=1minα=1.64/1.58=1.04α

=1.15/0.85=1.35α

=0.95/0.63=1.50改變別離選擇性α的方法改用不同的流動(dòng)相改變流動(dòng)相的組成α并非必須大于1.5！改變流動(dòng)相pH值盡量?jī)?yōu)化前幾種實(shí)驗(yàn)條件提高a值，改變柱溫防止改變固定相〔買新柱子〕，以便降低本錢應(yīng)用特殊的化學(xué)效應(yīng)改變固定相20柱效〔n〕對(duì)別離度〔R〕的影響以上兩張譜圖k，,α值完全相同，僅僅由于柱效上下不同使得它們具有不同的別離度。直觀的看，峰的鋒利程度代表了柱效上下，峰越鋒利，其柱效越高，通常使用理論塔板數(shù)〔n〕的大小衡量柱效的上下21理論塔板數(shù)和理論塔板高度的計(jì)算方法理論塔板數(shù)理論塔板高度HETP=L/n理論塔板數(shù)n越大，柱效越高；理論塔板數(shù)HETP越效，柱效越高22容量因子〔k〕對(duì)別離度〔R〕的影響容量因子越大，別離度越大。k135791113∞k/k+10.500.750.830.880.900.920.931.00但當(dāng)容量因子大于10，k/(k+1)的改變不大，而分析時(shí)間將大大延長(zhǎng)。因此，k的最正確范圍是1<k<20。改變?nèi)萘恳蜃拥姆椒ㄓ校焊淖冎鶞馗淖冎荔w積，其中死體積對(duì)k/(k+1)的影響很大。改變流動(dòng)相的配比是最簡(jiǎn)便、最有效的方法梯度洗提容量因子23梯度洗提梯度洗脫即程序控制流動(dòng)相的組成，使在整個(gè)別離過程中，溶劑強(qiáng)度按照特定的變化規(guī)律增加。優(yōu)點(diǎn)：別離復(fù)雜混合物，使所有組分都處在最正確的k值范圍內(nèi)。缺點(diǎn)：檢測(cè)器的使用受到限制，分析結(jié)果的重復(fù)性取決于流速的穩(wěn)定性。柱子需進(jìn)行再生處理。2425裝置低壓梯度〔內(nèi)梯度〕：溶劑在常壓下混合，再用高壓泵輸送至柱系統(tǒng)。簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)，只需一個(gè)泵，所用溶劑的元數(shù)沒有限制。高壓梯度〔外梯度〕：一般由兩臺(tái)高壓泵構(gòu)成，每臺(tái)泵輸送一種溶劑。溶劑在混合室混合后，在輸入柱系統(tǒng)。流量精密度高，溶劑的可壓縮性和熱力學(xué)體積的變化可能影響輸入柱子中溶劑的組成。26溶劑A溶劑B電磁閥A電磁閥B混合室泵溶劑A溶劑B高壓泵A

高壓泵B混合室低壓溶劑梯度方框圖高壓溶劑梯度方框圖27實(shí)現(xiàn)方式對(duì)于復(fù)雜樣品，線性梯度是最好的。正相色譜中，常用二氯甲烷參加正己烷來實(shí)現(xiàn)。反相色譜中，乙腈，甲醇參加水中是最常用的。28溫度的影響n，α，k都會(huì)受到柱溫的影響不要使用過高溫度，以保護(hù)柱子，60度算高溫溫度對(duì)平衡常數(shù)有影響，有時(shí)會(huì)影響出峰順序，注意對(duì)化合物進(jìn)行定性后再定量升溫通?？梢约铀賱e離，縮短分析時(shí)間，但也不絕對(duì)29三、色譜定性與定量方法301.色譜定性分析(1)純物對(duì)照定性各物質(zhì)在一定的色譜條件下均有確定不變的保存值，因此保存值可作為定性指標(biāo)。31實(shí)現(xiàn)方法利用保存時(shí)間和保存體積定性32用相對(duì)保存值定性用物增加峰高法定性33應(yīng)用范圍：適用于簡(jiǎn)單混合物，對(duì)該樣品已有了解并具有純物質(zhì)的情況。優(yōu)點(diǎn)：應(yīng)用簡(jiǎn)便，不需要其他儀器。缺點(diǎn)：定性結(jié)果的可信度不高。提高可信度的方法：雙柱、雙體系定性34(2)與其它儀器或化學(xué)方法聯(lián)合定性離線聯(lián)用方式化學(xué)法儀器法在線聯(lián)用方式化學(xué)法儀器法35離線聯(lián)用方式收集方法：餾分收集器應(yīng)用范圍：無標(biāo)準(zhǔn)物時(shí)，可對(duì)較為復(fù)雜的混合物進(jìn)行定性分析缺點(diǎn)：麻煩36在線聯(lián)用方式與其它儀器聯(lián)用定性混合物經(jīng)色譜別離后，將各組分直接由接口導(dǎo)入其它儀器中進(jìn)行定性。常用的聯(lián)用方法有：LC-FTIR、LC-MS……其它儀器相當(dāng)于色譜儀的檢測(cè)器。使用范圍：復(fù)雜樣品的定性。優(yōu)點(diǎn)：不需要標(biāo)準(zhǔn)物，定性結(jié)果可信度高，操作方便。缺點(diǎn)：需要特殊儀器或設(shè)備。372色譜定量分析(1)色譜定量根底色譜定量分析是基于被測(cè)物質(zhì)的量與峰面積成正比。在一定色譜條件下有：38〔2〕定量要解決的問題峰面積的測(cè)量和計(jì)算校正因子的測(cè)量與計(jì)算色譜定量方法及其應(yīng)用39峰面積的測(cè)量與計(jì)算積分儀或色譜工作站簡(jiǎn)便、速度快，精度高，可達(dá)0.2-2%，對(duì)小峰及不對(duì)稱峰的結(jié)果準(zhǔn)確，是色譜開展趨勢(shì)。手動(dòng)測(cè)量與計(jì)算40峰高乘半峰寬法：適于對(duì)稱峰峰高乘峰底寬度法：適于矮寬峰峰高乘平均峰寬法：適于不對(duì)稱峰峰高乘保存值法：適于狹窄峰，快速簡(jiǎn)便，常用于工廠控制分析。41重疊峰的測(cè)量切線分峰垂線分峰42連線分峰計(jì)算機(jī)擬合分峰43校正因子的測(cè)量與計(jì)算相對(duì)校正因子由于絕對(duì)校正因子與儀器的靈敏度有關(guān)，又由于靈敏度與實(shí)驗(yàn)條件相關(guān)，且每一檢測(cè)器的靈敏度都是不同的，它不容易測(cè)量準(zhǔn)確，亦無通用性，所以實(shí)際工作中使用相對(duì)校正因子。44質(zhì)量校正因子摩爾校正因子相對(duì)響應(yīng)值被測(cè)組分的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)量分子量45定量方法校正歸一化法——含歸一化內(nèi)標(biāo)法——含內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法外標(biāo)法——含單點(diǎn)校正46校正歸一化法推導(dǎo)：47應(yīng)用范圍：當(dāng)試樣中各組分都能流出色譜柱，且在檢測(cè)器上均有響應(yīng)，各組分峰沒有重疊時(shí)，可用此法。優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，當(dāng)操作條件如進(jìn)樣量等變化時(shí)，對(duì)定量結(jié)果影響很小，該法適合于常量物質(zhì)的定量。缺點(diǎn)：對(duì)該法的苛刻要求限制了它的使用。48面積歸一化法假設(shè)各組分的定量校正因子相近或相同，那么上式可簡(jiǎn)化為：49內(nèi)標(biāo)法推導(dǎo)將一定量的純物質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)物，參加到準(zhǔn)確稱量的試樣中。單點(diǎn)校正50適用范圍：當(dāng)只需測(cè)定試樣中某幾個(gè)組分，且試樣中所有組分不能全部出峰時(shí)可用。優(yōu)點(diǎn)：受操作條件的影響較小，定量結(jié)果較準(zhǔn)確，使用上不象歸一化法那樣受到限制，此法適合于微量物質(zhì)的分析。缺點(diǎn)：每次分析必須準(zhǔn)確稱量被測(cè)物和內(nèi)標(biāo)物，不適合于快速分析。51內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法〔多點(diǎn)校正內(nèi)標(biāo)法〕fi,sms/m為常數(shù)K，此時(shí)Ci%=K·(Ai/As)，以Ci%對(duì)Ai/As作標(biāo)準(zhǔn)曲線。優(yōu)點(diǎn)：不必測(cè)校正因子，消除了某些操作條件的影響，方法簡(jiǎn)便，適合液體試樣的常規(guī)分析。。52外標(biāo)法〔標(biāo)準(zhǔn)曲線法〕用于常規(guī)分析優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，計(jì)算方便。缺點(diǎn)：結(jié)果的準(zhǔn)確度取決于進(jìn)樣量的重現(xiàn)性和操作條件的穩(wěn)定性。該法必須定量進(jìn)樣。53單點(diǎn)校正當(dāng)被測(cè)試樣中各組分的濃度變化范圍不大時(shí)而用單點(diǎn)校正法。即配制一個(gè)與被測(cè)組分含量十分接近的標(biāo)準(zhǔn)溶液，定量進(jìn)樣，計(jì)算被測(cè)物的含量。54〔3〕定量中的誤差問題樣品的代表性〔樣品的前處理〕進(jìn)樣系統(tǒng)的影響柱系統(tǒng)的影響測(cè)量誤差定量結(jié)果的誤差分析55HPLC主要類型及其選擇

化學(xué)鍵合相色譜法液固色譜法離子對(duì)色譜法離子色譜法體積排阻色譜法56一、化學(xué)鍵合相色譜法1.分類正相鍵合相色譜法(Normalphasechromatography)：固定相的極性大于流動(dòng)相的極性，適用于別離油溶性或水溶性的極性或強(qiáng)極性化合物反相鍵合相色譜法(Reversedphasechromatography)：固定相的極性大于流動(dòng)相的極性，適于別離非極性、極性和離子性化合物。應(yīng)用最廣泛57正相色譜法與反相色譜法比較表

正相色譜法反相色譜法固定相極性高～中中～低流動(dòng)相極性低～中中～高組分洗脫次序極性小先洗出極性大先洗出582.固定相

疏水基團(tuán)如不同鏈長(zhǎng)的烷烴〔C8和C18〕和苯基等極性基團(tuán)如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。59類型分離方式應(yīng)用特點(diǎn)C-18反相、離子對(duì)普適性好，保留值大。溶于水的高極性化合物、中等極性化合物C-8反相、離子對(duì)與C-18類似，保留值略小C-3,C-4反相保留值小，適合肽類和蛋白質(zhì)苯基反相保留適中，選擇性不同。非極性、中等極性化合物-CN反相、正相選擇性與硅膠類似，保留小，用途廣-NH2反相、正相、離子交換分離糖類、核苷酸、固醇等二醇基正相分離有機(jī)酸、排阻分蛋白質(zhì)等醚基反相、正相分離酚類、芳硝基化合物，保留比C-18強(qiáng)聚苯乙烯基反相PH使用范圍廣，對(duì)部分分離峰形好，壽命長(zhǎng)常用固定相6061不同廠商固定相的比較623.流動(dòng)相溶劑具有穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)溶劑的選擇與使用的檢測(cè)器要有相容性溶劑的粘度要小溶劑的沸點(diǎn)不能太低溶劑的純度要高且價(jià)格廉價(jià)正相：正己烷、正庚烷、乙醚、二氯甲烷、氯仿等，己烷為主體，參加質(zhì)子接受體乙醚或甲基叔丁基醚，質(zhì)子給予體氯仿，偶極溶劑二氯甲烷反相：水、甲醇、乙腈、四氫呋喃、乙醇及其混合物等，以水為主體，參加質(zhì)子接受體甲醇，質(zhì)子給予體乙腈，偶劑溶劑四氫呋喃。634.影響保存值的因素溶質(zhì)結(jié)構(gòu)對(duì)保存值的影響：正相：溶質(zhì)極性越強(qiáng)，官能團(tuán)越多，保存值越大反相：溶質(zhì)極性越弱，疏水性越強(qiáng)，保存值越大。溶質(zhì)的保存值與其分子非極性局部的總面積有關(guān)，面積大，保存值大。6465烷基鍵合固定相特性對(duì)保存值的影響：反相：鍵合相烷鏈長(zhǎng)，k大，選擇性好。66溶劑性質(zhì)：正相：溶劑極性越弱，保存越大反相：流動(dòng)相外表張力大、介電常數(shù)大，那么極性越強(qiáng)。其斥力越大，溶質(zhì)與固定相鍵合越強(qiáng)，保存值越大。67鹽的影響：通常參加醋酸鹽、硼酸鹽、硫酸鹽等。無機(jī)鹽使流動(dòng)相外表張力增大，對(duì)非離子性溶質(zhì)，使k增加，對(duì)離子型溶質(zhì)，k下降。對(duì)堿性有機(jī)物有改善峰形的作用。pH值：參加酸、堿或緩沖液，控制PH，抑制溶質(zhì)的離子化，改善峰形。用于分析弱酸、堿。685應(yīng)用69二.液固色譜法

LiquidSolidChromatography1.固定相極性：硅膠、氧化鎂、氧化鋁等非極性：活性炭、高分子多孔微球、碳多孔微球等2.流動(dòng)相硅膠為固定相時(shí)：以弱極性的正構(gòu)烷烴為主體，參加二氯甲烷等中等極性溶劑調(diào)節(jié)適宜的洗脫強(qiáng)度?？捎盟畬?duì)硅膠進(jìn)行減活處理，或參加四氫呋喃、乙腈、甲醇、異丙醇等改性劑703.影響保存值的因素樣品分子結(jié)構(gòu)溶質(zhì)分子的官能團(tuán)極性增加，保存值增加溶質(zhì)分子的官能團(tuán)數(shù)目增加，保存值增加保存值與溶質(zhì)的空間效應(yīng)有關(guān)保存值與吸附中心的幾何分布有關(guān)b．吸附劑吸附劑的孔徑越小，外表積越大，保存值越大吸附劑的活性越強(qiáng)，保存值越大，活性由流動(dòng)相中的含水量來控制c．流動(dòng)相714.應(yīng)用中等分子量的油溶性樣品如油品、脂肪、芳烴等不同極性取代基的化合物結(jié)構(gòu)異構(gòu)體和幾何異構(gòu)體混合物的別離7273三、離子對(duì)色譜法

Ion-pairchromatography

1.根本原理將一種或數(shù)種與樣品離子電荷〔A+〕相反的離子(B-)〔稱為對(duì)離子或反離子〕參加到色譜系統(tǒng)流動(dòng)相中，使其與樣品離子結(jié)合生成弱極性的離子對(duì)〔中性締合物〕的別離方法。多為反相離子對(duì)色譜7475762.固定相、流動(dòng)相和離子對(duì)試劑固定相多為C18,C8反相鍵合相流動(dòng)相是以水為主的緩沖液，或水-甲醇、水-乙腈等混合溶劑離子對(duì)試劑：四丁基銨正離子、十六烷基三甲基銨正離子，ClO4-，十二烷基磺酸根等773.影響保存值的因素pH的影響：改善別離選擇性的有效方法。反相中，對(duì)于陰離子的別離，pH下降，k減小。離子對(duì)試劑的性質(zhì)與濃度：反相中，離子對(duì)試劑烷基鏈越長(zhǎng)，疏水性越大，k越大。溶劑的極性：反相中，甲醇、乙腈等含量增加，洗脫強(qiáng)度增大，k下降。洗脫強(qiáng)度與極性參數(shù)、介電常數(shù)同時(shí)相關(guān)離子強(qiáng)度：反相中，離子強(qiáng)度增加，溶質(zhì)k下降784.應(yīng)用有機(jī)酸、有機(jī)堿特別是強(qiáng)酸強(qiáng)堿的分析，如羧酸、磺酸、胺類、酚類、藥物、染料等反相離子對(duì)色譜分析有機(jī)酸固定相：C18烷基鍵合相流動(dòng)相：0.03mol/L四丁基銨+戊醇1.4-氨基苯甲酸；2.3-氨基苯甲酸；3.4-羥基苯甲酸；4.3-羥基苯甲酸；5.苯磺酸；6.苯甲酸；7.甲苯-4-磺酸79色譜類型（Mode）固定相（StationaryPhase）流動(dòng)相(MobilePhase)主要適用范圍(CompoundSepatated)正相色譜（Normal-Phase）硅膠、氰基、氨基有機(jī)溶劑在水中絕對(duì)不溶解的物質(zhì)或同分異構(gòu)體反相色譜色譜(Reversed-Phase)C-18,C-8,C-4,C-2水/有機(jī)溶劑中性、弱酸性、弱堿性物質(zhì)離子對(duì)色譜(Ion-Pair)C18,C-8水/有機(jī)溶劑離子對(duì)試劑離子離子交換色譜(IonExchange)陰離子和陽離子交換劑水相/緩沖鹽對(duì)離子離子體積排阻色譜(SizeExclusion)聚酯、硅膠水相(GPC)有機(jī)相(GPC)大分子量化合物聚合物液相色譜常用類型總結(jié)：80第3章高效液相色譜法的建立與應(yīng)用81我國(guó)藥典收載高效液相色譜法工程和數(shù)量比較表：82高效液相色譜儀的分析原理高效液相色譜儀的結(jié)構(gòu)色譜柱在高效液相色譜儀中的作用和峰形產(chǎn)生原理高壓泵進(jìn)樣器檢測(cè)器色譜工作站色譜柱83HPLC有以下特點(diǎn)

高壓——壓力可達(dá)150~300Kg/cm2。色譜柱每米降壓為75Kg/cm2以上。高速——流速為0.1~10.0ml/min。高效——可達(dá)10000塔板每米。在一根柱中同時(shí)別離成份可達(dá)100種。高靈敏度——紫外檢測(cè)器靈敏度可達(dá)0.01ng。同時(shí)消耗樣品少。84HPLC與經(jīng)典液相色譜相比有以下優(yōu)點(diǎn)：

速度快——通常分析一個(gè)樣品在15~30min，有些樣品甚至在5min內(nèi)即可完成。分辨率高——可選擇固定相和流動(dòng)相以到達(dá)最正確別離效果。靈敏度高——紫外檢測(cè)器可達(dá)0.01ng，熒光和電化學(xué)檢測(cè)器可達(dá)0.1pg。柱子可反復(fù)使用——用一根色譜柱可別離不同的化合物。樣品量少，容易回收——樣品經(jīng)過色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備。85Inwhichmaterials?Inwhatconcentration?Whichsample?Withwhichtechnique?一.高效液相色譜法的建立1.了解樣品86Whatisthesample?ConcentrationoftheinterestedcomponentContaminantCharacteristicsofthesampleStructureMolecularweightpKaSolubility87

溶于水——排阻色譜，水為流動(dòng)相相對(duì)分子質(zhì)量＞2000不溶于水——排阻色譜，非水流動(dòng)相同系物——分配色譜不溶于水異構(gòu)體——吸附色譜樣品分子大小差異——排阻色譜反相液一液色譜相對(duì)分子質(zhì)量溶于水，不離解＜2000排阻色譜，水為流動(dòng)相堿——陽離子交換色譜溶于水，可離解酸——陰離子交換色譜溶于水，離子與非離子—反相離子對(duì)色譜

882.選擇適宜的分析方法AnalyticaltechniqueColumnMobilephaseDetectorSamplepreparation893.分析條件的優(yōu)化流動(dòng)相種類與配比梯度溫度流速檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)樣量90二、高效液相色譜法的應(yīng)用樣品測(cè)定1．流動(dòng)相比例調(diào)整：由于我國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn)中沒有規(guī)定柱的長(zhǎng)度及填料的粒度，因此每次新開檢新品種時(shí)幾乎都須調(diào)整流動(dòng)相〔按經(jīng)驗(yàn)，主峰一般應(yīng)調(diào)至保存時(shí)間為6~15分鐘為宜〕。所以建議第一次檢驗(yàn)時(shí)請(qǐng)少配流動(dòng)相，以免浪費(fèi)。弱電解質(zhì)的流動(dòng)相其重現(xiàn)性更不容易到達(dá)，請(qǐng)注意充分平衡柱。91樣品測(cè)定

2．樣品配制：①溶劑；②容器：塑料容器常含有高沸點(diǎn)的增塑劑，可能釋放到樣品液中造成污染，而且還會(huì)吸留某些藥物，引起分析誤差。某些藥物特別是堿性藥物會(huì)被玻璃容器外表吸附，影響樣品中藥物的定量回收，因此必要時(shí)應(yīng)將玻璃容器進(jìn)行硅烷化處理。92樣品測(cè)定3．記錄時(shí)間：第一次測(cè)定時(shí)，應(yīng)先將空白溶劑、對(duì)照品溶液及供試品溶液各進(jìn)一針，并盡量收集較長(zhǎng)時(shí)間的圖譜〔如30分鐘以上〕，以便確定樣品中被分析組分峰的位置、別離度、理論板數(shù)及是否還有雜質(zhì)峰在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)才洗脫出來，確定是否會(huì)影響主峰的測(cè)定。93樣品測(cè)定4．進(jìn)樣量：藥品標(biāo)準(zhǔn)中常標(biāo)明注入10l，而目前多數(shù)HPLC系統(tǒng)采用定量環(huán)〔10l、20l和50l〕，因此應(yīng)注意進(jìn)樣量是否一致?！部筛淖儤右簼舛取?4樣品測(cè)定5．計(jì)算：由于有些對(duì)照品標(biāo)示含量的方式與樣品標(biāo)示量不同，有些是復(fù)合鹽、有些含水量不同、有些是鹽基不同或有些是采用有效部位標(biāo)示，檢驗(yàn)時(shí)請(qǐng)注意。

95方法研究

1．波長(zhǎng)選擇：首先在可見紫外分光光度計(jì)上測(cè)量樣品液的吸收光譜，以選擇適宜的測(cè)量波長(zhǎng)，如最靈敏的測(cè)量波長(zhǎng)并避開其它物質(zhì)的干擾。從紫外光譜中還可大體知道在HPLC中的響應(yīng)值，如吸收度小于0.5時(shí)，HPLC測(cè)定的面積將會(huì)很小。2．流動(dòng)相選擇：盡量采用不是弱電解質(zhì)的甲醇-水流動(dòng)相。96食品分析9798992.環(huán)境分析1001013.藥物分析102103人參皂苷的分析1045.農(nóng)藥分析105第4章儀器使用細(xì)節(jié)1061.HPLC用水專門的純水機(jī)或超純水機(jī)；去離子水重蒸；二次或三次重蒸水；采用類似家用的純水機(jī)；市場(chǎng)上瓶裝的純潔水或蒸餾水；其它途徑；1072.樣品溶解樣品用溶劑最好是流動(dòng)性，或者用溶劑強(qiáng)度與流動(dòng)相相近的溶劑。進(jìn)樣樣品要求無微粒，樣品溶液均要用0.45μm的濾膜過濾。1083.流動(dòng)相的配制流動(dòng)相通常按體積比配制。流動(dòng)相在使用前一般都需要過濾，尤其使用了加緩沖鹽的流動(dòng)相時(shí)。如果沒有自動(dòng)脫氣裝置，流動(dòng)相配好后應(yīng)該采用適宜的方法脫氣，如超聲波脫氣，真空脫氣、氦氣脫氣等。109在HPLC系統(tǒng)中使用的注射器針頭有別于氣相色譜，是平頭注射器。一方面，針頭外側(cè)緊貼進(jìn)樣器密封管內(nèi)側(cè)，密封性能好，不漏液，不引入空氣；另一方面，也防止了針頭刺壞密封組件及定子。盡快轉(zhuǎn)動(dòng)閥，不能停留在中途，否那么過高的壓力在柱頭上引起損壞。六通閥進(jìn)樣器的進(jìn)樣方式有局部裝液法和完全裝液法兩種。使用局部裝液法進(jìn)樣時(shí)，進(jìn)樣量最多為定量環(huán)體積的75，并且要求每次進(jìn)樣體積準(zhǔn)確、相同；使用完全裝液法進(jìn)樣時(shí)，進(jìn)樣量最少為定量環(huán)體積的3至5倍，即20μl的定量環(huán)最少進(jìn)樣60至100μl的樣品，這樣才能完全置換樣品定量環(huán)內(nèi)殘留的溶液，到達(dá)所要求的精密度及重現(xiàn)性。4.六通閥的使用110防止微粒阻塞進(jìn)樣閥和減少對(duì)進(jìn)樣閥的磨損。為防止緩沖鹽和其它殘留物質(zhì)留在進(jìn)樣系統(tǒng)中，每次結(jié)束后應(yīng)沖洗進(jìn)樣器，通常用不含鹽的稀釋劑、水或不含鹽的流動(dòng)相沖洗，在進(jìn)樣閥的Load和Inject位置反復(fù)沖洗，。1115.泵的保養(yǎng)使用流動(dòng)相盡量要清潔；進(jìn)液處的砂芯過濾頭要經(jīng)常清洗；流動(dòng)相交換時(shí)要防止沉淀；防止泵內(nèi)堵塞或有氣泡；112色譜柱問題及解決方法：保存值和別離度的重現(xiàn)性：影響方法的準(zhǔn)確度與精密度譜峰拖尾：別離質(zhì)量下降，精密度下降色譜柱壽命6.色譜柱113114樣品溶劑對(duì)別離結(jié)果的影響115柱子在任何情況下不能碰撞、彎曲或強(qiáng)烈震動(dòng)；當(dāng)柱子和色譜儀聯(lián)結(jié)時(shí)，閥件或管路一定要清洗干凈；要注意流動(dòng)相的脫氣；防止使用高粘度的溶劑作為流動(dòng)相；進(jìn)樣樣品要提純；嚴(yán)格控制進(jìn)樣量；每天分析工作結(jié)束后，要清洗進(jìn)樣閥中殘留的樣品；每天分析測(cè)定結(jié)束后，都要用適當(dāng)?shù)娜軇﹣砬逑粗患僭O(shè)分析柱長(zhǎng)期不使用，應(yīng)用適當(dāng)有機(jī)溶劑保存并封閉；116高效液相色譜柱開展史19世紀(jì)70年代中期，HPLC儀開始出現(xiàn)，主要填料：10μm的無定型硅膠顆粒。70年代后期，開展了反相液相色譜。80年代，HPLC被廣泛應(yīng)用于化合物的別離，主要填料：粒徑為5～10μm球形硅膠。90年代早期，粒徑為5μm的高純硅膠，即所謂的B型硅膠被開展，并成為這個(gè)行業(yè)填料的標(biāo)準(zhǔn)，這種B型硅膠含有微量的金屬。90年代后期，為了滿足快速別離的需求，開展了3μm或3.5μm的球形硅膠，其作用和性能逐漸的獲得了人們的認(rèn)同和接受。21世紀(jì)早期，為適應(yīng)超快速的別離要求，粒徑小于2μm的填料被開發(fā)出來，開展出了整體柱、無機(jī)和有機(jī)雜化硅膠。目前，市場(chǎng)上流行的分析用的HPLC硅膠基質(zhì)填料主要為B型硅膠。117PLC色譜柱及其填料的特征HPLC色譜柱的基質(zhì)材料硅膠與聚合物現(xiàn)代高效液相色譜填料的特征色譜柱結(jié)構(gòu)固定相鍵合相色譜柱接頭鍵合相穩(wěn)定性118硅膠基質(zhì)材料目前應(yīng)用最為廣泛的基質(zhì)材料。高機(jī)械強(qiáng)度和高的比外表積?？衫弥苯拥膹V泛的外表鍵合反響來滿足正相、反相、離子交換、疏水作用色譜和體積排除色譜的需求。高效。重現(xiàn)性好。pH適用范圍為pH2－8。具有容易導(dǎo)致強(qiáng)堿性物質(zhì)拖尾的，外表活性和帶酸性的硅羥基。119聚合物基質(zhì)材料交聯(lián)苯乙烯、二乙烯基苯和甲基苯烯酸酯。pH穩(wěn)定性好：pH1－13?？梢栽诤軐挼姆秶鷥?nèi)進(jìn)行外表化學(xué)處理以滿足反相色譜、離子交換色譜、疏水作用色譜和體積排阻色譜的需求。在中等pH條件下對(duì)強(qiáng)堿性物質(zhì)具有更好的峰形。填料的體積隨著流動(dòng)相的不同而改變，如膨脹或收縮。別離效率相對(duì)硅膠而言比較低重現(xiàn)性不好120硅膠外形球形硅膠:現(xiàn)代HPLC填料粒徑小(5μm,3μm,<2μm)重現(xiàn)性好穩(wěn)定性好別離效率高無定型硅膠:最初的HPLC填料粒徑>5μm柱床穩(wěn)定性差比外表積較小價(jià)格廉價(jià)121硅膠純度硅膠純度對(duì)強(qiáng)極性化合物的別離最重要。以前的純度較低的硅膠〔稱為A型硅膠〕,A型硅膠是以金屬硅酸鹽制備而來，具有很高的金屬含量，可被用作中性化合物和非離子化合物的別離。純度高、酸性較弱的硅膠(稱為B型硅膠)，這種硅膠是以無金屬的工藝制備而來，只含有微量的金屬，建議用于別離離子化合物和可電離的化合物，特別是堿性化合物。金屬雜質(zhì)引起對(duì)螯合劑和堿性化合物的別離產(chǎn)生不對(duì)稱峰或拖尾峰。122硅膠純度M+表面金屬能與螯合化合物絡(luò)合MSiOH內(nèi)部的金屬對(duì)表面硅羥基具有活化作用強(qiáng)酸性A型硅膠C18B型硅膠C18123硅膠孔徑孔徑作用和效能<60nm對(duì)HPLC分析沒有用，會(huì)引起峰形拖尾和較低的分離效率60–150nm對(duì)小分子的分離效果理想(MW<4,000to130,000),例如藥物分子、傳統(tǒng)的中藥和小分子的縮氨酸300–1,000nm對(duì)大分子的分離效果理想，如多肽、核苷和高分子>1,000nm對(duì)聚合物的分離效果理想，如DNA和生物大分子124硅膠粒徑粒徑作用和效能5μm目前應(yīng)用最廣泛，可以滿足從分析到半制備的分離3–3.5μm常用于分析柱上的快速分離，色譜柱短，節(jié)省溶劑<2μm常應(yīng)用于超快速分離，highthroughput,分離度高7–10μm常用于半制備色譜柱10–20μm常用于制備色譜柱125HPLC色譜柱結(jié)構(gòu)類型內(nèi)徑D(cm)柱長(zhǎng)(cm)粒徑(μm)分析柱0.3–0.463-253-10微孔柱0.1,0.2115,253-8半制備柱0.8–1.010-255-20制備柱2.0–5.010-255-20126鍵合相鍵合相:反相:70%;C18,65%;C8,15%;Cyano,5%,苯基柱<5%,正相:20%;硅膠、-NH2、-CN其它(手性柱,離子交換柱):10%反相色譜是目前應(yīng)用得最為廣泛的高效液相色譜方法。C18和C8在反相色譜終應(yīng)用得最為廣泛。127封尾封尾是用如三甲基硅烷等小分子與鍵合了C18以后的硅膠進(jìn)行進(jìn)一步的反響。由于硅烷相對(duì)很大的體積，使得C18和其它鍵合相在發(fā)生鍵合反響時(shí)只能覆蓋不到硅膠外表的50%。硅膠外表未被鍵合的酸性硅羥基將會(huì)與被分析物相互作用，特別是在中性條件下會(huì)對(duì)強(qiáng)堿性化合物產(chǎn)生嚴(yán)重的峰形拖尾。封尾工藝使得外表剩余的硅羥基被進(jìn)一步的消除，為小分子所取代。封尾工藝能促使色譜柱對(duì)極性和堿性化合物的別離具有良好的峰形。128