實(shí)驗(yàn)PCR基因擴(kuò)增

實(shí)驗(yàn)PCR基因擴(kuò)增生物藥學(xué)目的通過本實(shí)驗(yàn)了解并掌握PCR反應(yīng)的原理與實(shí)驗(yàn)技術(shù)。原理聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）是一種體外核酸擴(kuò)增系統(tǒng)，其原理類似DNA分子的天然復(fù)制過程，是將在待擴(kuò)增的DNA片段和與其兩側(cè)互補(bǔ)的兩個(gè)寡聚核苷酸引物，經(jīng)變性、退火和延伸若干個(gè)循環(huán)后，DNA擴(kuò)增2n倍。該技術(shù)已成為分子生物學(xué)中一種有助于DNA克隆及基因分析的必需工具。

PCR的工作程序?qū)嶋H上是一個(gè)在模板DNA、一對已知序列的寡核苷酸引物和四種脫氧核苷酸等存在的情況下，DNA聚合酶依賴的酶促合成反應(yīng)。擴(kuò)增的特異性取決于引物與模板DNA的結(jié)合。整個(gè)擴(kuò)增過程分三步：①變性，加熱使模板DNA雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈；②退火，突然降低溫度后模板DNA引物按堿基配對原則互補(bǔ)結(jié)合，也存在兩條模板鏈之間的結(jié)合，但由于引物的高濃度、結(jié)構(gòu)簡單等特點(diǎn)，主要的結(jié)合發(fā)生在引物與模板之間；③延伸，在DNA聚合酶及鎂離子等的存在條件下，從引物的3′端開始，結(jié)合單核苷酸，形成與模板鏈互補(bǔ)的新的DNA鏈。完成以上三步為一個(gè)循環(huán)，每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，樣本中的DNA量就增加一倍，新形成的DNA鏈又成為下一輪循環(huán)的模板。經(jīng)過25～40個(gè)循環(huán)后，DNA可擴(kuò)增106～109倍。儀器及試劑1.儀器：PCR儀、臺(tái)式離心機(jī)、移液器及吸頭、PCR薄壁管、電泳儀等

2.試劑：

10XPCR緩沖液配制（部分隨Taq酶提供）：

250～500mmol/LKCl100～500mmol/LTris-Cl（pH8.4）

15～20mmol/LMgCl20.5%Tween-201mg/LBSA

其它試劑：模板DNA、dNTP混合液、Taq聚合酶、上游和下游寡核苷酸引物、瓊脂糖凝膠等操作步驟

1.PCR體系（40ul）：

4ul10XPCR緩沖液

4ul25mMMgCl2（根據(jù)不同公司PCR緩沖液的不同而定）

Xul模板DNA≥50ng1ul上游引物（50-100ng）

1ul下游引物（50-100ng）

1uldNTPMixture（終濃度20－200uM）

0.4ulTaq聚合酶加ddH2O至40ul

視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。

2.將上述試劑依次加入PCR薄壁管。加樣后用手輕彈混勻，6000rpm離心15sec使反應(yīng)成分集于管底。3.PCR反應(yīng)熱循環(huán)程序設(shè)置：（1）95℃300s變性（2）94℃45s變性（3）55℃45s退火（4）72℃45s延伸重復(fù)步驟2-4共30循環(huán)（5）72℃600s延伸反應(yīng)結(jié)束后短暫離心，吸取少量（10ul）進(jìn)行分析，其余置4℃保存?zhèn)溆谩?.瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。注意事項(xiàng)

1.PCR體系所加成分的實(shí)際用量應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)者選用的該成分的終濃度及所擁有的貯備液濃度進(jìn)行核算。2.加樣時(shí)要認(rèn)真,吸頭垂直進(jìn)入試