SNT5487-2023 十足目虹彩病毒1感染檢疫技術(shù)規(guī)范

S中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標(biāo)T十足目虹彩病毒1感染檢疫技術(shù)規(guī)9發(fā) 1實中華人民共和國海關(guān)總 發(fā)中華人民共和國出入境檢驗檢行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)十足目虹彩病毒1感染檢疫技術(shù)規(guī)*中國海關(guān)出版社有限公司出版發(fā)北京市朝陽區(qū)東四環(huán)南路甲1號)編輯部中國標(biāo)準(zhǔn)出版社秦皇島印刷廠印*521千字年1月第一版年1月第一次印刷1—*書號0T 本文件按照標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由中華人民共和國海關(guān)總署提出并歸口。本文件起草單位中華人民共和國深圳海關(guān)深圳市檢驗檢疫科學(xué)研究院深圳質(zhì)標(biāo)科技有限公司、深圳技術(shù)大學(xué)中華人民共和國武漢海關(guān)中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所中華人民共和國湛江海關(guān)廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)科學(xué)研究院。本文件主要起草人賈鵬溫智清吳江劉葒張娜王津津鄭曉聰劉瑩邱亮陳孝宇童桂香、楊冰。ⅠT十足目虹彩病毒1感染檢疫技術(shù)規(guī)范圍本文件規(guī)定了十足目虹彩病毒感染的臨床癥狀規(guī)定的套PCR檢測方法實時熒光PCR檢測方法和綜合判定。本文件適用感染的檢測和診斷規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中注日期的引用文件僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件不注日期的引用文件其最新版本包括所有的修改單適用于本文件。 分析實驗室用水規(guī)格和實驗方法出入境動物檢疫采樣實驗室生物安全通用要求術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義縮略語下列縮略語適用于本文件磷酸腺苷酶CTAB十六烷基三甲基溴化胺m)t循環(huán)閾值)十足目虹彩病毒)DNA脫氧核糖核酸)dNTPs三磷酸脫氧核糖核苷酸)EB溴化乙錠)MCP主要衣殼蛋白儀器和設(shè)備冷凍離心機微量移液器1T水平電泳儀凝膠成像儀超凈工作臺二級生物安全柜試劑和材料水2中一級水的規(guī)格陽性對照感染的甲殼類動物組織由海關(guān)總署指定單位提供陰性對照的甲殼類動物組織空白對照DNA酶的水A1無水乙醇分析純使用前預(yù)冷至-20%0乙酸銨0s飽和酚分析純。三氯甲烷/異戊醇A2A3酶20℃保存避免反復(fù)凍融或溫度劇烈變化A4A52×實時熒光PCR預(yù)混液套式PCR引物濃度序列如下1e基因p的片段1e基因p的片段實時熒光PCR引物和探針濃度序列如下:MCP基因p的片段采樣采樣對象和數(shù)量采樣對象包括凡納濱對蝦羅氏沼日本沼M2T脊尾白蝦氏原螯紅螯螯蝦x斑節(jié)對蝦P中國對蝦P日本對蝦Ps和三疣梭子蟹應(yīng)采集有臨床癥狀的樣品參見附。采樣數(shù)量和樣品運送及保存按照8規(guī)定執(zhí)行。樣品前處理實驗室取樣檢測時仔蝦采集除眼球和眼柄外的完整個體幼蝦至成蝦階段可采集鰓肝胰腺造血組織附肢或血淋巴親蝦的非致死檢測采集血淋巴附肢或糞便。所取樣品組織置于離心管中立即進(jìn)行A提取或暫存于0℃冰箱。實驗室檢測條件應(yīng)符合9的規(guī)定。診斷方法設(shè)立對照從提取DNA開始每個步驟均需設(shè)立陽性對照陰性對照空白對照核酸提取7K25L等體s飽和酚顛倒混合10于n離心3。取上層水相移至新的離心管中加入等體積酚/三氯甲烷/異戊醇顛倒混合10于n離心1。取上層水相移至新的離心管中加入等體積三氯甲烷/異戊醇顛倒混合10于n離心1。取上層水相移至新的離心管中加入0L乙酸銨混勻后再加入兩倍體積預(yù)冷無水n%每次n離心5傾去上清沉淀于室溫干燥30DNA沉淀中加入50μLTE緩沖液20℃保存?zhèn)溆?。可使用同等效果的商品化核酸提取試劑盒代替以上方法使用引物F1R1PCR反應(yīng)體系。在反應(yīng)管中加10×PCR擴(kuò)增緩沖液01上游引物01下游引物01q酶5APCR反應(yīng)條件如下5℃預(yù)變性35℃變性9℃退火2℃延伸共5環(huán)2℃再延伸24℃保存第一步反應(yīng)結(jié)束后可先將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析若出現(xiàn)大小目的條帶可直接進(jìn)行測序分析否則需進(jìn)行第二步PCR反應(yīng)。使用引物F2R2PCR反應(yīng)體系。在反應(yīng)管中加10×PCR擴(kuò)增緩沖液01上游引物01下游引物01q酶5第一PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2μL,雙蒸水補充總體積至25μL。瞬時離心后置PCR擴(kuò)增儀。3TPCR反應(yīng)條件如下5℃預(yù)變性35℃變性9℃退火2℃延伸共5個循環(huán)2℃再延伸24℃保存。瓊脂糖凝膠電泳用TBE電泳緩沖液配制5%瓊脂糖含L溴乙啶或其替代物凝膠板。將其放入水平電泳槽使電泳緩沖液蓋過膠面。取5μLPCR產(chǎn)物和1μL6×上樣緩沖液混勻后加入樣品孔5m電泳約40n后置于凝膠成像儀觀察結(jié)果。可采用同等效果的其他方法替代測序?qū)或p特異PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行基因測序并將測序結(jié)果與參考序列參見附C)k數(shù)據(jù)基因序列進(jìn)行同源性比較分析。結(jié)果判定陽性對照電泳可見和特異性目的條帶陰性對照和空白對照無p特異性目的條帶則陽性對照空白對照和陰性對照成立。若對照組不成立則實驗無效應(yīng)重新提取核酸并更換試劑和對照樣品重新實驗。7p9pk基因序列相符判定為套式PCR檢測結(jié)果為陽性被檢樣品經(jīng)套式PCR檢測均未擴(kuò)增出p或p特異性目的條帶或雖有目的條帶但測序結(jié)果與參考序列或k基因序列不相符則判定套式PCR檢測結(jié)果為陰性。設(shè)立對照見核酸提取見反應(yīng)體系反應(yīng)總體積為包含2×實時熒光PCR預(yù)混液上游引物下游引物5探針05X參比染料1μL,DNA5雙蒸水可使用其他等效的熒光PCR試劑盒代替以上方法反應(yīng)條件955℃8℃0PCRPCR反應(yīng)條件做適當(dāng)調(diào)整。結(jié)果判定當(dāng)陽性對照出現(xiàn)典型Ct值陰性對照和空白對照無Ct值且無擴(kuò)增曲線則陽性對照陰性對照和空白對照成立。若對照組不成立則實驗無效應(yīng)重新提取核酸更換試劑4T和對照樣品重新實驗Ct值且無擴(kuò)增曲線可判定為實時熒光PCR方法檢測結(jié)果為陰性。若被檢樣品Ct值≤6且有典型型擴(kuò)增曲線可判定實時熒光PCR方法檢測結(jié)果為陽性若被檢樣品36<Ct值應(yīng)重新提取核酸調(diào)整實時熒光PCR反應(yīng)的模板濃度后重新實驗。重新實驗后Ct值>6則判定實時熒光PCR方法檢測結(jié)果為陰性Ct值≤6則判定實時熒光PCR方法檢測結(jié)果為陽性。綜合判定符合下列條件之一判定為疑似感染有典型臨床癥狀套式PCR檢測結(jié)果陽性實時熒光PCR檢測結(jié)果陽性符合下列條件之一判定為感染有典型臨床癥狀且套式PCR或?qū)崟r熒光PCR方法檢測結(jié)果為陽性無臨床癥狀且套式PCR和實時熒光PCR方法檢測結(jié)果均為陽性5T附錄A規(guī)范性)試劑及配方抽提緩沖液1LsH 5LH 2加水定容 高壓蒸汽滅菌4保存LlH)5LH 2加入約mL的去離子水均勻混合。溶液定容至10001℃高壓滅菌20冷卻至室溫后4℃保存。0H) 硼 2AH2O 29g加水定容 L H室溫 明 6×上樣緩沖液溴酚藍(lán)mg加雙蒸水5在室溫下過夜待溶解后再稱取蔗糖25g加雙蒸水溶解后移入溴酚藍(lán)溶液中搖勻后定容至50NaOH溶液1滴調(diào)至藍(lán)色。為商業(yè)試劑。主要成分qdA聚合酶UNG酶,含有dUTP的實時熒可采用同等效果的其他試劑6T附錄資料性十足目虹彩病毒1感染疾病名稱十足目虹彩病毒1感染是由十足目虹彩病毒d感染引起的新發(fā)甲殼類急性傳染病。目前世界動物衛(wèi)生組織已將該病列疫病名錄。病原包含V5CQIV兩個分離株兩者基因組同源性達(dá)%。年7月在中國福建養(yǎng)殖的紅鰲螯蝦首次鑒定紅鰲螯蝦虹彩病毒-。4年2月從中國浙江發(fā)病的南美白對蝦中鑒定出CQIV類似病原蝦血細(xì)胞虹彩病毒。年基于CQIV和SHIV基因組分析國際病毒分類委員會認(rèn)定兩者為同一種病毒正式將其命名為十足目虹彩病毒1。該病毒是虹彩病毒科十足目虹彩病毒屬唯一已知b臨床癥狀該病最適發(fā)病水溫約為5℃2℃患病蝦表現(xiàn)為空腸空胃肝胰腺萎縮顏色變淺停止攝食、活力下降等癥狀。其中患病羅氏沼蝦因額劍基部甲殼下的造血組織被病毒侵染而呈現(xiàn)明顯白色病變區(qū)域即產(chǎn)業(yè)上所說的白頭或者白點部分患病凡納濱對蝦會出現(xiàn)體色發(fā)紅癥狀。自然條件下凡納濱對蝦和羅氏沼蝦感染后累計死亡率為%以上。實驗條件下凡納濱對蝦克氏原螯蝦和紅螯螯蝦感染后累計死亡率約%。易感宿主現(xiàn)已確認(rèn)1易感宿主包括凡納濱對蝦羅氏沼蝦日本沼蝦脊尾白蝦克氏原螯蝦紅螯螯蝦、斑節(jié)對蝦和三