YY-T 1447-2016 外科植入物 植入材料磷灰石形成能力的體外評估 含2023年第1號修改單

外科植入物植入材料磷灰石形成能力的體外評估2016-01-26發(fā)布國家食品藥品監(jiān)督管理總局發(fā)布I本標(biāo)準按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準使用翻譯法等同采用ISO23317:2012《外科植入物植入材料磷灰石形成能力的體外評——按照漢語習(xí)慣對一些編排格式進行了修改；——將一些適用于國際標(biāo)準的表述改為適用于我國標(biāo)準的表述；——將第2章“規(guī)范性引用文件”中已轉(zhuǎn)化為國標(biāo)和行標(biāo)的標(biāo)準用國標(biāo)和行標(biāo)代替。與本標(biāo)準中規(guī)范性引用的國際文件有一致性對應(yīng)關(guān)系的我國文件如下：——GB6682—2008分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法(ISO3696:1987,MOD);——YY/T0640—2008無源外科植入物通用要求(ISO14630:2005,IDT)。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別這些專利的責(zé)任。本標(biāo)準由國家食品藥品監(jiān)督管理總局提出。本標(biāo)準由全國外科植入物和矯形器械標(biāo)準化技術(shù)委員會骨科植入物分技術(shù)委員會(SAC/TC本標(biāo)準起草單位：國家食品藥品監(jiān)督管理局天津醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心、上海貝奧路生物材料有限公司。Ⅱ研究表明，各種不同材料通過磷灰石層與活體骨連接。在無細胞和蛋白質(zhì)而僅有與人體血漿相同離子濃度的模擬體液(SBF)中，材料表面能形成磷灰石層，而該條件下形成的磷灰石與骨礦化物的組成在SBF溶液中評估植入材料上的磷灰石形成能力，對在動物試驗前評估材料的體內(nèi)骨連接能力非常有意義。當(dāng)生物活性材料植入體內(nèi)后，在其表面會形成富含Ca和P的薄層。材料從而通過該磷灰石層與活體組織之間形成無明顯邊界的連接。研究證實，當(dāng)材料浸泡于SBF中時，在該材料表面同樣能形成這種磷灰石層，其組成和結(jié)構(gòu)與骨礦化物非常相似。隨著材料的生物活性增加，其表面短期內(nèi)形成的磷灰石也隨之增加。磷灰石層可通過薄膜X射線衍射光譜儀和(或)掃描電子顯微鏡檢測。在SBF中形成的磷灰石也可與下列形式的骨磷灰石相似：——缺鈣型磷灰石；——低鈣/磷原子比的磷灰石；注1:由于磷灰石具有生物活性，因此材料表面在體內(nèi)形成的磷灰石有助于材料與活體骨的連接。在體外通過SBF溶液浸泡，材料表面也能形成與體內(nèi)相同的磷灰石沉積。例如，Bioglass、CaO-SiO?玻璃、Na?O-CaO-SiO?玻璃、CeraboneA-W、Ceravital型玻璃陶瓷、羥基磷灰石陶瓷及堿熱處理鈦金屬表面在體內(nèi)均能形成鈣化，這與其在體外SBF中形成的鈣化有一定的相關(guān)性。但是，在體內(nèi)材料表面不形成磷灰石并不意味著沒有很好骨連接作用。有報道稱，一些可吸收材料如β-磷酸三鈣Ca?(PO?)?和碳酸鈣，其表面不形成磷灰石層卻也能連接到活體骨上。注2:有報道稱，在不同組成的Na?O-CaO-SiO?玻璃植入家兔骨缺損后，材料成骨能力與在體外SBF中磷灰石形成能力有著相關(guān)性。1外科植入物植入材料磷灰石形成能力的體外評估1范圍本標(biāo)準規(guī)定了在模擬體液(SBF)中材料表面形成的磷灰石的檢測方法。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。ISO3696:1987分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法(Waterforanalyticallaboratoryuse—Specifica-tionandtestmethods)ISO14630無源外科植入物通用要求(Non-activesurgicalimplants—Generalrequirements)3術(shù)語和定義ISO14630界定的以及下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準。磷酸鈣類，包括骨礦化物以及構(gòu)成骨骼和牙齒的主要無機成分，類似于羥基磷灰石[Ca??(PO?)?(OH)?]。磷灰石形成能力apatite-formingability材料表面形成磷灰石的能力。生物活性bioactivity在材料界面引發(fā)特定生物反應(yīng)，使得組織和材料形成連接的特性。誘導(dǎo)期inductionperiod樣品浸入模擬體液后檢測材料表面形成磷灰石的時間。模擬體液simulatedbodyfluid(SBF)與人體血漿組成相似而不含有機成分的無機溶液。在SBF中和植入動物體內(nèi)顯示特定的磷灰石形成能力、具有特定化學(xué)組成的標(biāo)準玻璃。2薄膜X射線衍射光譜法thinfilmX-raydiffractionspectrometry(TF-XRD)通過X射線與材料表面形成較小的入射角而獲得衍射圖譜，檢測材料表面薄層中礦物質(zhì)的方法。4儀器4.1電子天平，測量精度為±1mg。4.2配有磁力攪拌的水浴，保持溶液溫度4.3pH計，測量溶液pH值的精度為±0.01。4.4溫度計，測量溶液溫度的精度為±0.1℃。4.5薄膜X射線衍射光譜儀(TF-XRD),能夠檢測材料表面薄層中形成的磷灰石。4.6掃描電子顯微鏡(SEM),在達到10000倍的放大倍數(shù)下，觀測材料平整表面形成的磷灰石顆粒和5檢測樣品5.1樣品形狀和尺寸本標(biāo)準適用于取自植入部分和器械的任何形狀和尺寸的樣品。然而，由于評估材料的生物活性是通過TF-XRD和(或)SEM技術(shù)來確認材料表面磷灰石的形成，因此推薦使用圓形或矩形片狀樣品。推薦的樣品尺寸見圖1。單位為毫米a)圓形樣品b)矩形樣品本標(biāo)準允許有幾種不同的樣品制備方法。必要時應(yīng)通過機加工方式改變植入物原有的形狀。3以圖1b)所示矩形薄片樣品為例。樣品應(yīng)使用粒度120～400的金剛石砂輪打磨，打磨深度和速度等條件應(yīng)根據(jù)材料情況而定。水溶性材料(如生物活性標(biāo)準玻璃)應(yīng)在無水條件下進行加工。凡是能滿足磷灰石形成能力檢測的常規(guī)加工方法均可使用。6模擬體液SBF應(yīng)使用表1中規(guī)定的組成及濃度。表1SBF和人造血漿的離子濃度離子濃度(mmol/L)模擬體液(pH7.40)血漿(pH7.2～7.4)HCO3-注1:目前已發(fā)現(xiàn)，在表1規(guī)定的SBF溶液中的體外磷灰石形成能力與體內(nèi)成骨性能具有一定相關(guān)性。注2:有文獻還報道了其他幾種SBF配方。6.2配制SBF的試劑以下粉末類試劑級化學(xué)物質(zhì)應(yīng)存放在干燥器中。配制SBF的水應(yīng)符合ISO3696規(guī)定的2級標(biāo)準。6.2.4三水磷酸氫二鉀(K?HPO?·3H?O)6.2.5六水氯化鎂(MgCl?·6H?O)6.2.6鹽酸溶液c(HCl)=1mol/L6.2.7氯化鈣(CaCl?)或二水氯化鈣(CaCl?·2H?O)6.2.9三羥甲基氨基甲烷(TRIS)[(HOCH?)?CNH?]由于SBF對磷灰石過飽和，所以配制方法不當(dāng)會導(dǎo)致溶液中磷灰石均勻析出。4表2按溶解順序列出了配制1LSBF所需的試劑。順序試劑試劑量"稱量容器純度相對分子質(zhì)量1稱量紙2稱量紙3稱量瓶4稱量瓶5稱量瓶6量筒——7稱量瓶8稱量瓶9稱量紙滴管*試劑量取決于其純度。6表中列出的純度是絕大多數(shù)國家均可獲得的典型試劑純度?！叭绻褂枚然}，應(yīng)注意其相對分子質(zhì)量與氯化鈣不同：質(zhì)量：0.371g;純度：99.0%;相對分子質(zhì)量：147.0152。在1L的塑料燒杯中加入700mL離子交換蒸餾水和一個攪拌轉(zhuǎn)子，用蒸發(fā)皿或塑料薄膜覆蓋杯口，將其放置在磁力攪拌器上的水浴(4.2)中，同時攪拌加溫至(36.5±1.5)℃。附錄A給出了配制SBF的裝置示意圖。按照表2給出的順序在(36.5±1.5)℃恒溫下溶解試劑，同時應(yīng)注意以下事項：a)配制SBF溶液避免使用玻璃容器，推薦使用表面光滑且無劃痕的塑料容器，因為磷灰石會在玻璃容器表面或塑料容器的劃痕上成核。b)只有當(dāng)前一種試劑完全溶解之后，才能溶解下一種試劑。c)由于氯化鈣/二水氯化鈣通常以小顆粒形式存在，并且對磷灰石析出影響很大。所以氯化鈣/二水氯化鈣應(yīng)一顆一顆地緩慢溶解。d)量筒量取1mol/L鹽酸溶液前應(yīng)使用該溶液潤洗。e)稱量三水磷酸氫二鉀、六水氯化鎂、氯化鈣/二水氯化鈣、氯化鉀、硫酸鈉等吸濕性試劑應(yīng)盡量快速操作。在溶解TRIS前，插入pH計電極(4.3),此時溶液的pH應(yīng)為2.0±1.0。5設(shè)置溶液溫度在(36.5±1.5)℃。如果溶液總體積不足900mL,用蒸餾水補足至總體積900mL。溶液溫度在(36.5士1.5)℃,最佳為(36.5士0.5)℃。將TRIS緩慢加入到溶液中，同時密切關(guān)注pH值變化。在加入少量TRIS后，待其溶解完全且pH值穩(wěn)定，再加少量TRIS。建議不要一次性加入大量的TRIS,這樣會引起pH值的局部劇烈升高而導(dǎo)致磷灰石析出。如果溶液溫度沒有達到(36.5±0.5)℃,建議加入TRIS使其pH值為7.3±0.05,然后停止添加直到溶液溫度達到(36.5±0.5)℃。當(dāng)溫度為(36.5±0.5)℃時，加入TRIS將pH值調(diào)至7.45以下?？紤]到pH值隨確保溶液溫度保持在(36.5±0.5)℃。當(dāng)pH值上升到7.45±0.01時，停止溶解TRIS,使用移液器滴加1mol/LHCl將pH值調(diào)至7.42±0.01,注意確保pH值不要低于7.40。當(dāng)pH值降低至7.42±0.01時，逐漸加入剩余的TRIS溶液，直到pH值接近7.45。如果還有TRIS剩余，交替加入TRIS和1mol/LHCl。重復(fù)此操作，確保pH值在7.42～7.45范圍內(nèi)，直至TRIS加完。調(diào)節(jié)溶液的溫度至(36.5±0.2)℃,緩慢加入1mol/LHCl調(diào)節(jié)將pH值至7.42±0.01,并最終在36.5℃且升降溫速率小將pH計電極從溶液中移出，用蒸餾水沖洗電極，并將沖洗液回收到溶液中。將燒杯內(nèi)調(diào)節(jié)好pH值的溶液移入1000mL容量瓶，使用蒸餾水多次潤洗燒杯，并回收潤洗液至容量瓶中。用磁石固定攪拌轉(zhuǎn)子，防止其落到容量瓶內(nèi)。添加蒸餾水至標(biāo)線(此時不必精確定容，因為冷卻后體積會變小),容量瓶加蓋并用塑料薄膜密封。6.3.11第10步搖勻后將其放入水中冷卻至20℃。6.3.12第11步SBF溶液離子濃度應(yīng)按表1。由于SBF是相對于磷灰石過飽和的亞穩(wěn)定溶液，因此推薦使用化學(xué)分析方法確認SBF溶液的離子濃度。此外，還建議在配置好的SBF溶液中評估標(biāo)準玻璃表面磷灰石的形成能力。評估磷灰石形成能力的標(biāo)準玻璃的化學(xué)組成參見附錄B圖B.1。將標(biāo)準玻璃A、B、C浸入SBF中12h、24h、120h后，通過TF-XRD應(yīng)檢測到磷灰石層形成。6YY/T1447—2016/ISO23317:20126.5SBF的保存將配制好的SBF密封保存在塑料瓶中，置于(7.5±2.5)℃的冰箱內(nèi)。SBF應(yīng)在制備后30天內(nèi)使用。推薦將最終的SBF通過過濾方式滅菌，從而消除灰塵顆粒和細菌。因為灰塵能促使磷灰石異相成核，細菌經(jīng)常吞噬SBF中形成的磷灰石。滅菌應(yīng)在制備后和(或)評價磷灰石形成能力之前進行。對于制備后(保存前)的滅菌，使用蠕動泵將全部SBF通過一個帶有0.22μm孔徑的無菌通氣過濾器過濾，蠕動泵流速為85mL/min～100mL/min。對于在評價磷灰石形成能力之前的滅菌，使用連有0.22μm孔徑的無菌通氣過濾器的注射器來過濾SBF。使用者可根據(jù)具體情況進行選擇。7操作步驟7.1對于致密材料，薄片樣品測量尺寸精確到±0.1mm,計算表面積精確到2mm2。7.2試驗所用SBF體積計算公式見式(1):V,=100mm·S………(1)S.——樣品的表觀面積，mm2。對于多孔材料，SBF用量應(yīng)大于計算量V.。7.3取計算用量的SBF加入到塑料瓶或燒杯中，加熱到36.5℃,然后按照圖2的方法放置樣品。整個樣品應(yīng)被浸沒在SBF中。在極少數(shù)情況下，磷灰石既會在SBF溶液中均勻析出，也會沉積在樣品表面。所以樣品放置在SBF溶液中應(yīng)如圖2a)或圖2b)所示。如果樣品放置呈現(xiàn)圖2b)情況，則應(yīng)檢測樣品底面形成磷灰石的情況。圖2SBF中的樣品7.4樣品在36.5℃恒溫的SBF溶液浸泡后，按不同時間(不超過4周)取樣，并用純水輕柔沖洗。建議浸泡期為4周。樣品放入干燥器中常溫干燥。樣品一旦從SBF溶液中取出，就不能再次浸入SBF溶液中。7.5使用TF-XRD(4.5)或(和)SEM(4.6)檢測樣品表面的磷灰石。TF-XRD測試以CuKa(λ=0.15405nm)作為輻射束，20角在3°~50°范圍內(nèi)，掃描速率為2°/min,入射束與樣品表面形成1°入射角。7應(yīng)對干燥的SEM樣品噴金屬膜使其具有導(dǎo)電性。分別在高倍(×10000),低倍(×1000)下拍攝注：TF-XRD可以清晰地辨別樣品表面形成的磷灰石。SEM能觀察到樣品表面的物質(zhì)形成，而不能辨別表面沉積物是否是磷灰石。所以，SEM必須同TF-XRD一起使用。但是，當(dāng)形成的磷灰石顆粒和薄膜具有可識別的特征時，可以僅使用SEM進行評估。8檢測報告檢測報告應(yīng)包括以下信息：b)樣品制備過程，包括樣品表面加工情況；c)材料孔隙率(可選);d)制樣中SBF溶液用量；e)SBF浸泡溫度(℃);f)檢測樣品表面磷灰石的方法(TF-XRD或/和SEM);g)驗證磷灰石存在的TF-XRD衍射圖的檢測條件和(或)SEM照片的觀察條件；h)通過每個時期磷灰石的存在與否，判斷其誘導(dǎo)期(可選);i)每個條件的樣品數(shù)量；j)實驗室名稱和檢測日期；k)參照本標(biāo)準。8(資料性附錄)2——聚乙烯燒杯；3——磁力轉(zhuǎn)子；4——水??；5——磁力攪拌器。圖A.1制備SBF的裝置示例9(資料性附錄)評估磷灰石形成能力標(biāo)準玻璃的制備標(biāo)準玻璃的組成見表B.1。應(yīng)采用高純度的二氧化硅、碳酸鈉和碳酸鈣試劑來制備標(biāo)準玻璃(圖B.1)。表B.1Na?O-CaO-SiO?系統(tǒng)中標(biāo)準玻璃的組成標(biāo)準玻璃摩爾組成/%Na?OCaOSiO?22.522.535說明：1——玻璃形成；2——無玻璃形成；3——磷灰石形成；4——無磷灰石形成；5——溶解。圖B.1Na?O-CaO-SiO?系統(tǒng)中標(biāo)準玻璃和其浸入SBF后形成磷灰石的能力考慮到在高溫煅燒后會造成質(zhì)量損失，應(yīng)按照表B.2所示量準備試劑。(或者使用預(yù)先加熱過的試劑以消除質(zhì)量損失，如碳酸鈉，碳酸鈣和二氧化硅分別在1000℃加熱10h,600℃加熱2h,550℃加熱將稱量好的試劑放入氧化鋁研缽中，混合研磨30min。將制備玻璃A、B、C的粉末置于鉑金坩堝中經(jīng)1400℃熔化1.5h,隨后倒入帶2mm厚可拆卸邊框的不銹鋼板，立即用另一塊不銹鋼板按壓玻璃，形成2mm厚的玻璃板。將該玻璃板移至另一塊預(yù)熱到500℃的不銹鋼板。退火后，在非水冷卻條件下切割成樣品，用400號砂紙打磨拋光，最后在丙酮中超表B.2制備標(biāo)準玻璃的試劑的質(zhì)量分數(shù)標(biāo)準玻璃質(zhì)量分數(shù)/%Na?CO?CaCO?SiO?32.5430.7336.7330.0828.4141.5127.4925.9646.55[1]KOKUBOT,KUSHITANIH,SAKKAS,KITSUGIT,YAMAMUROT.Solutionsabletoreproduceinvivosurface-structurechangesinbioactiveglass-ceramicA-W,J.Biomed.Mater.Res.,24,pp.721-734,1990[2]FILGUERIASMR,LATORREG,HENCHLL.Solutioofabioactiveglass,J.Biomed.Mater.Res.,27,pp.445-453,1993[3]HENCHLL.Bioceramics:fromconcepttoclinic,J.Am.Ceram.Soc.,74pp.1487-[4]KOKUBOT,KUSHITANIHY,EBISAWAY,KITSUGIT,KOTANIS,OUYAMAMUROT.Apatiteformationonbioceramicsinbodyenvironment,editedbyHOonishi,HAo-kiandKSawai,IshiyakuEuroAmerica,Tokyo,Bioceramics,1,pp.157-162,1989[5]LEGEROSRZ,LEGEROSJP.DensehydroxyapatedbyLLHench,JWilson,WorldSci.,Singapore,pp.139-180,1993[6]KOKUBOT,ITOS,HUANGZT,HAYASHIT,SAKKAS,KITSUGIT,YAMAMU-ROT.Ca,P-richlayerformedonhigh-strengthbioactiveglass-ceramicsA-W,J.Biomed.Mater.Res.,24,pp.331-343,1990[7]NEOM,NAKAMURAT,OHTSUKIC,KOKUBOT,YAMAMUROT.Apatiteforma-tiononthreekindsofbioactivematerialatanearlystageinvivo:acomparativestudybytransmissionelectronmicroscopy,J.Biomed.Mater.Res.,27,pp.999-1006,1993[8]KIMH-M,MIYAJIF,KOKUBOT,NAKAMURAT.PreparationofbioactiveTianditsalloysviasimplechemicalsurfacetreatment,J.Biomed.Mater.Res.,32,pp.40[9]NISHIGUCHIS,FUJIBAYASHISofAlkali-andHeattreatedTitaniumImplants,J.Biomed.Mater.Res,67A,pp.28-35,2003[10]GIBSONI,HUANGJ,BESTS,BONFIELDW.EnhancedinvitroOhgushiGHastings,TYoshikawa,WorldScientificPublishing,12,1999[11]GIBSONI,HINGK,REVELLP,SANTOSJ,BESTS,BONFIELDW.Enhancedintions,Switzerland,218-220,pp.203-206,2002KITSUGIT,YAMAMUROT.Dependenceofapatiteformationonsilicagelonitsstructure:effectofheattreatment,J.Am.Ceram.Soc.,78[7],pp.1769-1774,1995[13]NEOM,KOTANIS,NAKAMURAT,YAMAMUROtiveceramicandbone,J.Biomed.Mater.Res.,26,pp.1419-1432,1992[14]HOLANDW,VOGELW,NAUMANNK,GUMMELJ.Interfacereactionsbetweenma-chinablebioactiveglass-ceramicsandbone,J.Biomed.Mater.Res.,19,pp.303-312,1985[15]OHURAK,NAKAMURAT,YAMAMUROT,EBISAWAY,KOKUBOT,KOTOU-RAY,OKAM.BioactivityofCaO·SiO?glassesaddedwithvariousions,J.Mater.Sci.:MaterialsinMedicine,3,pp.95-100,1992[16]HIMENOT,KIMH-M,KANEKOH,KAWASHITAM,KOKUBOT,NAKAMURAT.Surfacestructuralchangesofsinteredhydroxyapatiteintermsofsurfacecharge,inBioceramics,editedbyBBen-Nissan,DSher,WWalsh,TransTechPublicationLtd.,Switzerland,15,Pp.457-460,2002[17]OHTSUKIC,KUSHITANIH,KOformationonthesurfaceofceravital-typeglass-ceramicinthebody,J.Biomed.Mater.Res.,25,pp.[18]EBISAWAY,KOKUBOT,OHURAK,YAMAMUROT.BioactivityofCaO-SiO?-basedglasses:invitroevaluation,J.Mat.Sci.:Mater.Med.,1,pp.239-244,1990[19]KIMH-M,MIYAJIF,KOKUBOT,OHTSUKIC,NAKAMURAT.BioactivityofNa?O-CaO-SiO?glasses,J.Am.Ceram.Soc.,78[9],pp.2405-2411,1995[20]FUJIBAYASHIS,NEOM,KIMH-M,KOKUBOT,NAKAMURAT.AcomparativestudybetweeninvivoboneingrowthandinvitroapatiteformationonNa?O-CaO-SiO?glasses,Bio-[21]OYANEA,KIMH-M,FURUYAT,KOKUBOT,MIYAZAKIT,NAKAMURAT.Preparationandassessmentofrevisedsimulatedbodyfluids,J.Biomed.Mater.Res.,65A,pp.188-[22]OYANEA,ONUMAK,ITOAKIMH-M,KOKUBOT,NAKAMURAT.Formationandgrowthofclustersinconventionalandnewkindsofsimulatedbodyfluids,J.Biomed.Mater.Res.,[23]OYANEA,KAWASHITAM,NAKA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