海洋生物體中金剛烷胺的測定液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法

1海洋生物體中金剛烷胺的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法警告：實驗中使用的標準溶液、有機溶劑等均具有一定的毒性和揮發(fā)性，實驗人員應避免與其直接接觸，樣品前處理過程應在通風櫥中進行。本文件描述了海洋生物體中金剛烷胺液的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法，包括原理、試劑及配制、儀器和設備、樣品、分析步驟、結(jié)果計算與表示、準確度、質(zhì)量控制和質(zhì)量保證、廢物處置等。本文件適用于海洋生物體魚、蝦、海參、海帶和貝類中金剛烷胺的測定。當稱樣量為3.00g時，金剛烷胺檢出限為0.5μg/kg，測定下限為1.0μg/kg。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法3術語和定義本文件沒有需要界定的術語和定義。4原理海洋生物體樣品用1%乙酸乙腈提取后，經(jīng)固相萃取柱凈化，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定，內(nèi)標法定量。5試劑及配制5.1實驗室用水：GB/T6682，一級。5.2甲醇（CH3OH）：色譜純。5.3甲酸（HCOOH）：色譜純。5.4乙腈（CH3CN）：色譜純。5.5氨水（NH4OH）：優(yōu)級純。5.6乙酸（CH3COOH）：優(yōu)級純。5.71%乙酸乙腈溶液（體積分數(shù)）。取1mL乙酸，用乙腈定容至100mL。5.85%氨水甲醇溶液（體積分數(shù)）。取5mL氨水，用甲醇定容至100mL。25.90.1%甲酸溶液（體積分數(shù)）。取0.10mL甲酸，用水定容至100mL。5.100.1%甲酸乙腈定容液（體積分數(shù)）。將1mL甲酸與300mL乙腈，加入到700mL水中。5.11金剛烷胺標準品：CAS號768-94-5，純度大于99.0%。5.12D15-金剛烷胺內(nèi)標溶液：CAS號33830-10-3，1mg/mL。5.13金剛烷胺標準貯備液。稱取金剛烷胺0.0100g，用乙腈溶解，并定容至10mL，配制成1.0mg/mL標準貯備液，-20℃下避光保存，有效期為90d。5.14金剛烷胺標準工作液。移取100μL金剛烷胺標準貯備液（5.13），用乙腈溶解，并定容至100mL，配制成1.0μg/mL標準工作液，4℃下避光保存，有效期為30d。5.15D15-金剛烷胺內(nèi)標標準中間液。移取100μLD15-金剛烷胺內(nèi)標溶液（5.12），用乙腈溶解，并定容至100mL，配制成1.0μg/mL內(nèi)標標準中間液，4℃下避光保存，有效期為30d。5.16D15-金剛烷胺內(nèi)標標準工作液。移取1mLD15-金剛烷胺內(nèi)標標準中間液（5.15），用乙腈定容至10mL，配制成100μg/L內(nèi)標標準工作液，4℃下避光保存，有效期為7d。6儀器和設備6.1液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：配電噴霧電離源（ESI源）。6.2天平：感量分別為0.01g和0.0001g。6.3均質(zhì)機。6.4高速離心機：10000r/min。6.5超聲波清洗器。6.6渦旋混合器。6.7固相萃取裝置。6.8固相萃取柱：MCX（混合型陽離子固相萃取柱），60mg/3mL，或相當者。6.9氮吹儀。6.10聚丙烯離心管：50mL。6.11濾膜：聚偏氟乙烯濾膜，孔徑為0.22μm。7樣品7.1制備魚，去鱗、去皮，沿脊背取肌肉，將鱗、皮單獨收集；蝦，去頭、去殼、去腸腺，取肌肉部分；海參、海帶、貝等取可食部分，樣品充分攪碎、混勻。如不能及時檢測，-18℃以下冷凍保存?zhèn)溆谩Ｈ∵m量新鮮或解凍的空白或供試組織，絞碎，并使均質(zhì)。7.2提取3稱取3.00(±0.01）g樣品至50mL離心管中，加入100μL內(nèi)標標準工作液（5.16）和15mL1%乙酸乙腈溶液（5.7），渦旋30s，超聲提取15min，8000r/min離心10min，待凈化。7.3凈化MCX固相萃取柱經(jīng)6mL甲醇（5.2）和6mL水（5.1）活化后，取5mL上清液移入固相萃取柱，3mL水（5.1）淋洗，6mL5%氨水甲醇溶液（5.8）洗脫，全程控制流速為2mL/min～3mL/min。收集洗脫液，用氮吹儀于40℃下吹至近干，用定容液（5.10）定容至1mL，過濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀分析。7.4空白試樣的制備除不加試料外，均按上述測定步驟進行。8分析步驟8.1液相色譜質(zhì)譜條件8.1.1液相色譜條件：a)色譜柱：C18(100mm×2.1mm，1.8μm)，或相當者；b)色譜柱溫度：40℃;c)流速：0.25mL/min；d)進樣量：10μL；e)流動相：A為乙腈（5.4）；B為0.1%甲酸溶液（5.9）；流動相梯度洗脫程序見表1。表1流動相梯度洗脫程序表mL/min%%5555558.1.2質(zhì)譜條件：a)離子化模式：ESI+；b)電離電壓：2.50kV；c)錐孔電壓：25V；d)離子源溫度：140℃;e)錐孔反吹氣流速：50L/h；f)脫溶劑氣溫度：400℃;g)脫溶劑氣流速：700L/h；h)氬氣流速：0.12mL/min；i)測定方式：選擇反應監(jiān)測模式（SRM），定量離子和定性離子參數(shù)見表2。4表2待測物定量離子和定性離子參數(shù)Vaa8.2標準曲線的建立移取金剛烷胺標準工作液（5.14）10μL、20μL、40μL、50μL、100μL于進樣瓶中，分別加入100μL內(nèi)標標準工作液（5.16用定容液（5.10）定容至1mL，使金剛烷胺濃度分別為10.0μg/L、20.0μg/L、40.0μg/L、50.0μg/L、100μg/L，現(xiàn)用現(xiàn)配。以各標準工作液金剛烷胺峰面積與內(nèi)標峰面積的比值為縱坐標，以各標準工作液濃度為橫坐標，繪制標準曲線。8.3試樣測定按照儀器條件（8.1），分別測定金剛烷胺標準工作液（8.2）、試樣（7.3）、空白試樣（7.4），金剛烷胺標準溶液、空白樣品和加標樣品的色譜圖參見附錄A。9結(jié)果計算與表示9.1定性分析在同樣測試條件下，陽性樣品的保留時間與標準工作液中待測物的保留時間偏差在±2.5%以內(nèi)，在扣除背景后的樣品質(zhì)譜圖中，所選擇的特征離子均應出現(xiàn)，且檢測到的離子的相對豐度，應與濃度相當?shù)男Ｕ龢藴嗜芤合鄬ωS度一致。定性確證時相對離子豐度的允許偏差應符合表3的要求。表3定性確證時相對離子豐度的允許偏差%%>50>20～50>10～209.2定量分析按8.1設定儀器條件，待儀器穩(wěn)定后，根據(jù)表2中的定量離子分別對金剛烷胺和內(nèi)標進行測定，記錄保留時間和峰面積，以峰面積比按內(nèi)標法進行單點或多點校準定量，標準工作液和試樣溶液中待測物的響應值均應在儀器檢測線性范圍內(nèi)。9.3結(jié)果計算樣品中金剛烷胺的含量按公式（1）計算：x= m5式中：x——樣品中金剛烷胺的含量，單位為微克每千克(μg/kgc——試樣溶液中金剛烷胺的濃度，單位為微克每升(μg/L）；c0——空白試樣溶液中金剛烷胺的濃度，單位為微克每升(μg/L）；V——試樣溶液的定容體積，單位為毫升（mL）；m——樣品的濕重，單位為克（g）。9.4結(jié)果表示計算結(jié)果扣除空白值，測定結(jié)果用兩次平行測定的算術平均值表示，保留三位有效數(shù)字。10準確度10.1精密度本方法批內(nèi)相對標準偏差和批間相對標準偏差均小于15%。詳見表B.1。10.2正確度金剛烷胺在添加濃度1.0μg/kg～100μg/kg時，回收率為70%～120%。詳見表B.2。11質(zhì)量控制和質(zhì)量保證11.1空白試驗每20個樣品或每批次（少于20個樣品/批）應至少分析1個空白試驗，空白中金剛烷胺的濃度應低于方法檢出限。11.2校準標準曲線建立應與批樣測定同時進行；每20個樣品或每批次（少于20個樣品/批）應至少分析1個中間點濃度的標準溶液，測定值與該點初始濃度的相對誤差應≤30%；金剛烷胺標準曲線的相關系數(shù)r一般應大于0.99。11.3平行樣每20個樣品或每批次（少于20個樣品/批）應至少測定一個平行樣。平行樣測定結(jié)果的相對偏差應在±10以內(nèi)。11.4基體加標每20個樣品或每批次（少于20個樣品/批）應至少測定一個基體加標樣品，金剛烷胺回收率應在70%~120%之間，見附錄B。12廢物處置實驗過程中產(chǎn)生的廢液和廢物應分類收集，集中保管，委托有資質(zhì)的單位進行處理。（資料性）色譜圖圖A.1、圖A.2、圖A.3給出了金剛烷胺標準溶液色譜圖、空白樣品色譜圖和加標樣品色譜圖。 圖A.1金剛烷胺標準溶液色譜圖（10.0μg/L） 圖A.2空白樣品色譜圖