備考2024屆高考生物一輪復(fù)習(xí)講義第十一章生物技術(shù)與工程課時6基因工程的基本工具與操作程序考點2　基因工程的基本操作程序

考點2基因工程的基本操作程序1.基因工程的基本操作程序教材補(bǔ)遺[選必3P77“相關(guān)信息”]Bt抗蟲蛋白只有在某類昆蟲腸道的堿性環(huán)境中才能表現(xiàn)出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，腸道細(xì)胞也沒有特異性受體。2.利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因PCR與體內(nèi)DNA復(fù)制的異同類型PCR體內(nèi)DNA復(fù)制時期人工控制，隨時進(jìn)行有絲分裂和減數(shù)分裂前的間期場所細(xì)胞外細(xì)胞內(nèi)解旋方式90℃以上高溫條件下變性解旋解旋酶催化酶耐高溫的DNA聚合酶解旋酶、DNA聚合酶等子鏈合成方式從兩條引物的3'端開始連續(xù)合成一條連續(xù)合成，另一條不連續(xù)合成結(jié)果擴(kuò)增DNA片段或基因合成整個DNA分子相同點①都需要DNA模板、引物、能量和一定的溫度條件；②都遵循堿基互補(bǔ)配對原則；③DNA的合成都是從子鏈的5'端向3'端延伸基礎(chǔ)自測1.基因表達(dá)載體中含有啟動子和密碼子。（×）2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建是基因工程的核心。（√）3.啟動子是與RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，是起始密碼子。（×）4.Ti質(zhì)粒上的T－DNA可與雙子葉植物受體細(xì)胞的染色體DNA整合在一起。（√）5.將重組表達(dá)載體導(dǎo)入動物受精卵常用基因槍法。（×）6.PCR擴(kuò)增時，50℃左右，引物與作為模板的單鏈DNA特定部位相互配對、結(jié)合。（√）深度思考1.構(gòu)建基因表達(dá)載體時，為什么一般選用兩種限制酶切割目的基因和載體？提示因為用不同的限制酶分別處理目的基因和載體時，可以使目的基因兩側(cè)和載體上各自具有兩個不同的黏性末端，防止目的基因或載體發(fā)生自身環(huán)化及目的基因與載體反向連接。2.啟動子與起始密碼子、終止子與終止密碼子有什么不同？提示啟動子、終止子、起始密碼子、終止密碼子對比項目本質(zhì)位置功能啟動子DNA片段目的基因上游RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA終止子DNA片段目的基因下游使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來起始密碼子mRNA上三個相鄰的堿基mRNA首端翻譯的起始信號（編碼氨基酸）終止密碼子mRNA上三個相鄰的堿基mRNA尾端翻譯的結(jié)束信號（不編碼氨基酸）3.在構(gòu)建基因表達(dá)載體時，目的基因的序列中能否含有用到的限制酶的識別序列，為什么？提示不能，因為目的基因的序列中若含有用到的限制酶的識別序列，目的基因可能會被切斷。4.在用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的過程中，為什么一定要將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T－DNA上？提示Ti質(zhì)粒的T－DNA是可轉(zhuǎn)移的DNA，可轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并且整合到受體細(xì)胞染色體DNA上。將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T－DNA中，就可以使目的基因進(jìn)入植物細(xì)胞。5.復(fù)性時，引物與DNA模板的結(jié)合是隨機(jī)的，但兩條解開的DNA模板鏈結(jié)合的概率較低，其原因是什么？提示①模板鏈一般較長，比引物復(fù)雜得多，重新結(jié)合的概率低；②加入引物的量足夠多，而模板鏈較少，故引物和模板鏈結(jié)合的機(jī)會遠(yuǎn)大于模板鏈間的。研透高考明確方向命題點1PCR的過程和應(yīng)用分析1.[2021湖北]某實驗利用PCR技術(shù)獲取目的基因，實驗結(jié)果顯示除目的基因條帶（引物與模板完全配對）外，還有2條非特異條帶（引物和模板不完全配對）。為了減少反應(yīng)中非特異條帶的產(chǎn)生，以下措施中有效的是（D）A.增加模板DNA的量 B.延長熱變性的時間C.延長延伸的時間 D.提高復(fù)性的溫度解析PCR過程中，引物和模板不完全配對會形成非特異條帶，增加模板DNA的量可以提高反應(yīng)速率，但不會減少反應(yīng)中非特異條帶的產(chǎn)生，A錯誤；延長熱變性的時間和延伸的時間對延伸中的配對影響不大，故不能有效減少非特異性條帶的產(chǎn)生，B、C錯誤；非特異性條帶增加的原因可能是復(fù)性溫度過低使引物與模板的結(jié)合位點增加，故可通過提高復(fù)性的溫度來減少非特異性條帶的產(chǎn)生，D正確。2.[2022遼寧]抗蟲和耐除草劑玉米雙抗12－5是我國自主研發(fā)的轉(zhuǎn)基因品種。為給監(jiān)管轉(zhuǎn)基因生物安全提供依據(jù)，采用PCR方法進(jìn)行目的基因監(jiān)測，反應(yīng)程序如圖所示。下列敘述正確的是（B）A.預(yù)變性過程可促進(jìn)模板DNA邊解旋邊復(fù)制B.后延伸過程可使目的基因的擴(kuò)增更加充分C.延伸過程無需引物參與即可完成半保留復(fù)制D.轉(zhuǎn)基因品種經(jīng)檢測含有目的基因后即可上市解析預(yù)變性的溫度為94℃，在這個溫度下，雙鏈DNA解旋為單鏈，但模板鏈不易和引物結(jié)合，不能進(jìn)行復(fù)制，A錯誤。延伸的目的是合成新的子鏈，后延伸延長了延伸時間，使目的基因的擴(kuò)增更加充分，B正確。延伸過程需要引物與模板鏈結(jié)合，在引物的3'端加上相應(yīng)的核苷酸，C錯誤。轉(zhuǎn)基因品種經(jīng)檢測含有目的基因且已經(jīng)表達(dá)使生物體表現(xiàn)出相應(yīng)性狀后，還需要經(jīng)過系列的安全性評價，符合相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)后才能上市，D錯誤。命題點2基因工程的基本操作程序分析3.[2023全國乙節(jié)選，10分]GFP是水母體內(nèi)存在的能發(fā)綠色熒光的一種蛋白?？蒲腥藛T以GFP基因為材料，利用基因工程技術(shù)獲得了能發(fā)其他顏色熒光的蛋白，豐富了熒光蛋白的顏色種類?；卮鹣铝袉栴}。（1）構(gòu)建突變基因文庫。科研人員將GFP基因的不同突變基因分別插入載體，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌制備出GFP基因的突變基因文庫。（2）構(gòu)建目的基因表達(dá)載體。科研人員從構(gòu)建的GFP突變基因文庫中提取目的基因（均為突變基因）構(gòu)建表達(dá)載體，其模式圖如圖所示（箭頭為GFP突變基因的轉(zhuǎn)錄方向）。圖中①為終止子；②為啟動子，其作用是被RNA聚合酶識別并結(jié)合，驅(qū)動GFP突變基因的轉(zhuǎn)錄。（3）目的基因的表達(dá)?？蒲腥藛T將構(gòu)建好的表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌有的發(fā)綠色熒光，有的發(fā)黃色熒光，有的不發(fā)熒光。請從密碼子特點的角度分析，發(fā)綠色熒光的可能原因是密碼子的簡并使GFP基因突變后編碼的蛋白質(zhì)與突變前相同（答出1點即可）。（4）新蛋白與突變基因的關(guān)聯(lián)性分析。將上述發(fā)黃色熒光的大腸桿菌分離純化后，對其所含的GFP突變基因進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)其堿基序列與GFP基因的不同，將該GFP突變基因命名為YFP基因（黃色熒光蛋白基因）。若要通過基因工程的方法探究YFP基因能否在真核細(xì)胞中表達(dá)，實驗思路是選擇合適的運(yùn)載體，利用合適的限制酶和DNA連接酶將YFP基因和運(yùn)載體連接起來，構(gòu)建基因表達(dá)載體，之后將基因表達(dá)載體導(dǎo)入酵母菌，檢測酵母菌是否會發(fā)黃色熒光。解析（2）一個基因表達(dá)載體的組成，除了目的基因，還必須有啟動子、終止子以及標(biāo)記基因等。啟動子是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的上游，它是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終表達(dá)出人類需要的蛋白質(zhì)。終止子相當(dāng)于一盞紅色信號燈，使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來，位于基因的下游，也是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段。（3）結(jié)合題中信息可知，將構(gòu)建好的表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，發(fā)現(xiàn)有的大腸桿菌發(fā)綠色熒光，即GFP蛋白的熒光顏色，推測發(fā)綠色熒光的可能原因是密碼子的簡并使GFP基因突變后編碼的蛋白質(zhì)與突變前的相同。（4）基因工程的基本操作程序包括：①目的基因的篩選與獲取；②基因表達(dá)載體的構(gòu)建；③將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞；④目的基因的檢測與鑒定。欲通過基因工程的方法探究YFP基因能否在真核細(xì)胞中表達(dá)，可通過基因工程的方法將目的基因?qū)虢湍妇髾z測酵母菌是否發(fā)黃色熒光，如果發(fā)黃色熒光，則可證明YFP基因能在真核細(xì)胞中表達(dá)，否則，不能證明YFP基因能在真核細(xì)胞中表達(dá)。4.[2021福建節(jié)選，10分]微生物吸附是重金屬廢水的處理方法之一。金屬硫蛋白（MT）是一類廣泛存在于動植物中的金屬結(jié)合蛋白，具有吸附重金屬的作用。科研人員將棗樹的MT基因?qū)氪竽c桿菌構(gòu)建工程菌?；卮鹣铝袉栴}：（1）根據(jù)棗樹的MTcDNA的核苷酸序列設(shè)計了相應(yīng)的引物（圖中甲），通過PCR擴(kuò)增MT基因。已知A位點和B位點分別是起始密碼子和終止密碼子對應(yīng)的基因位置。選用的引物組合應(yīng)為引物1和引物4。（2）本實驗中，PCR所用的DNA聚合酶擴(kuò)增出的MT基因的末端為平末端。由于載體E只有能產(chǎn)生黏性末端的酶切位點，需借助中間載體P將MT基因接入載體E。載體P和載體E的酶切位點及相應(yīng)的酶切序列如圖中乙所示。①選用EcoRⅤ酶將載體P切開，再用T4DNA（填“T4DNA”或“E.coliDNA”）連接酶將MT基因與載體P相連，構(gòu)成重組載體P'。②載體P'不具有表達(dá)MT基因的啟動子和終止子。選用XhoⅠ和PstⅠ酶組合對載體P'和載體E進(jìn)行酶切，將切下的MT基因和載體E用DNA連接酶進(jìn)行連接，將得到的混合物導(dǎo)入用鈣離子處理的大腸桿菌，篩出MT工程菌。解析（1）據(jù)題中信息知，A位點和B位點分別是起始密碼子和終止密碼子對應(yīng)的基因位置，若要通過PCR技術(shù)擴(kuò)增MT基因，應(yīng)選用引物1和引物4。（2）①通過PCR技術(shù)擴(kuò)增出的MT基因的末端為平末端，載體P中有限制酶XhoⅠ、EcoRⅤ、PstⅠ、SmaⅠ的酶切位點，用限制酶XhoⅠ、PstⅠ切割載體P得到的均為黏性末端，而用限制酶EcoRⅤ和SmaⅠ切割載體P得到的均是平末端，但不能用限制酶SmaⅠ進(jìn)行酶切，若用