食品酶學(xué)課件

緒論

什么是酶？酶是生物體產(chǎn)生的一類具有生物催化活性的生物大分子。1.1酶學(xué)研究簡(jiǎn)史酶的研究處于生物學(xué)和化學(xué)的銜接點(diǎn)，是一門內(nèi)容廣泛、發(fā)展迅速的科學(xué)。它的分支遍及很多領(lǐng)域，并與許多學(xué)科緊密聯(lián)系，特別同生物化學(xué)、物理化學(xué)、微生物學(xué)、遺傳學(xué)、植物學(xué)、農(nóng)學(xué)、藥理學(xué)、毒理學(xué)、生理學(xué)、醫(yī)學(xué)以及生物工程的關(guān)系更為密切。由于酶獨(dú)特的催化功能，近年來已在食品、輕工、化工、醫(yī)藥、環(huán)保、能源和科學(xué)研究等各個(gè)領(lǐng)域得以廣泛應(yīng)用。1.1.1酶的早期研究4000多年前，人們就已經(jīng)在釀酒、制飴、制醬等過程中不自覺地利用了酶的催化作用。在我國(guó)古書《書經(jīng)》中有“若作酒醴，爾維麴蘗”的記載，其意為：若要釀酒，就必須使用麴和蘗。麴是指長(zhǎng)了微生物的谷物，蘗是指發(fā)了芽的谷物，它們都含有豐富的酶。這些都說明了酶的應(yīng)用首先是從食品生產(chǎn)開始的。西方各國(guó)在17世紀(jì)也有了關(guān)于酶的記載。然而，人們真正認(rèn)識(shí)酶的存在和作用，是從19世紀(jì)開始的。1833年法國(guó)化學(xué)家Payen和Persoz從麥芽汁提取物中首次發(fā)現(xiàn)了淀粉酶，他們將這種由酒精沉淀后得到的可使淀粉水解成可溶性糖的物質(zhì)命名為淀粉糖化酵素，并指出了它的熱不穩(wěn)定性，初步觸及了酶的一些本質(zhì)問題。到19世紀(jì)中期，科學(xué)家們已陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了胃蛋白酶、多酚氧化酶、過氧化物酶和轉(zhuǎn)化酶等。1855年，Schoenbein在植物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了過氧化物酶，由此解決了愈創(chuàng)樹脂變色的難題。隨后在1856年，Schoenbein又在蘑菇中發(fā)現(xiàn)了另外一種酶——多酚氧化酶，能夠在氧存在的條件下催化反應(yīng)生成有色氧化物。另外，在這個(gè)時(shí)期，許多科學(xué)家發(fā)現(xiàn)酶的催化作用與酵母在發(fā)酵期間的作用相似，因而微生物學(xué)家巴斯德（Pasteur）和化學(xué)家李比希（Liebig）提出了兩種不同觀點(diǎn)。巴斯德主張：發(fā)酵和活細(xì)胞有關(guān)，酒精發(fā)酵是酵母細(xì)胞生活的結(jié)果。巴斯德（1822-1895）微生物學(xué)的奠基人提出分子不對(duì)稱性理論，開創(chuàng)了立體化學(xué)研究的途徑。創(chuàng)立了發(fā)酵的生物學(xué)理論，低溫消毒技術(shù)（巴氏殺菌）免疫學(xué)--預(yù)防接種，研制出狂犬疫苗李比希認(rèn)為：發(fā)酵及其他類似過程，是由于化學(xué)物質(zhì)的作用，純粹是化學(xué)過程。從1901年到1910年最早的十次諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)獲得者中，李比希的學(xué)生就有七位。李比希(1803—1873)德國(guó)化學(xué)家化學(xué)教育改革家有機(jī)化學(xué)創(chuàng)始人農(nóng)業(yè)化學(xué)之父關(guān)于發(fā)酵本質(zhì)的長(zhǎng)期論戰(zhàn)1897年，布希納兩兄弟(EduardBuchner&HansBuchner)成功的從酵母細(xì)胞分離出具有發(fā)酵作用的物質(zhì)，能使糖發(fā)酵。他們當(dāng)時(shí)的興趣是制備用于治療疾病的酵母無細(xì)胞提取物，這些提取物的保存必須不加防腐劑，例如不能加酚。于是他們決定試用蔗搪，這是在烹調(diào)化學(xué)中常用的防腐劑。他們得到了驚人的結(jié)果:酵母汁液迅速將蔗糖發(fā)酵產(chǎn)生了酒精。這說明巴斯德和李比希的兩種觀點(diǎn)實(shí)質(zhì)上是一致的。生物化學(xué)就是在解決發(fā)酵本質(zhì)的著名論戰(zhàn)中產(chǎn)生的。HansBuchner（1850-1902）德國(guó)細(xì)菌學(xué)家EduardBuchner(1860-1917)1907年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)通常以Buchner(布氏)漏斗而留名Enzyme的詞源而“酶”（Enzyme）的概念，是由德國(guó)科學(xué)家Kuhne在1878年首先提出用以表示未統(tǒng)一名稱的已知的各種酵素。這個(gè)詞（enzyme）本身的意思是“在酵母中”，起源于希臘語，其中en表示“在之內(nèi)"，zyme表示酵母或酵素。1.1.2酶催化的專一性在大量實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，F(xiàn)ischer于1894年提出了“鎖和鑰匙”模型，成功解釋了酶的催化反應(yīng)機(jī)制。酶催化專一性理論研究的另一重要成就是1959年Koshland提出的“誘導(dǎo)契合”理論，以解釋酶的催化理論和專一性，同時(shí)也搞清了某些酶的催化活性與生理?xiàng)l件變化有關(guān)。1.1.3酶學(xué)的理論研究20世紀(jì)初期，定量描述酶作用的方法得到了很大發(fā)展。1902年Henri和Brown各自獨(dú)立地提出了以下觀點(diǎn)：在固定酶濃度的條件下，逐步增加底物濃度而得到的反應(yīng)速度—底物濃度的飽和類型曲線是由于形成酶—底物中間絡(luò)合物的結(jié)果。1913年，Michaelis和Menten提出中間產(chǎn)物學(xué)說，推導(dǎo)出酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程，即著名的米氏方程，定量地描述酶的上述性質(zhì)：V=Vmax[S]/Km+[S]而20世紀(jì)50年代起酶學(xué)理論方面的研究也十分活躍，在蛋白質(zhì)（或酶）的生物合成理論方面獲得了許多突破性進(jìn)展。1955年，Sanger等報(bào)道了胰島素中氨基酸排列的次序以及荷爾蒙的分子量為6000，這是在測(cè)定蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)上的第一次突破。1957年Kornberg等人發(fā)現(xiàn)DNA聚合酶并進(jìn)行DNA復(fù)制的系列研究。20世紀(jì)50年代開始，由于分子生物學(xué)和生物化學(xué)的發(fā)展，對(duì)生物細(xì)胞核中存在的脫氧核糖核酸（DNA）的結(jié)構(gòu)與功能有了比較清晰的闡述。70年代初實(shí)現(xiàn)了DNA重組技術(shù)或稱克隆技術(shù)，極大地推動(dòng)著食品科學(xué)與工程的發(fā)展，也促使酶學(xué)研究進(jìn)入新的發(fā)展階段。另外，近20年來的研究發(fā)現(xiàn)，除蛋白質(zhì)以外，核糖核酸（RNA）也有催化活性。例如，1982年Cech等人在四膜蟲的RNA分子中發(fā)現(xiàn)一個(gè)具有自身切接功能的片段，稱之為“內(nèi)含子”，它可以從前體RNA中特異地把與它本身相同的片段（413個(gè)核苷酸）切下來，然后把剩余的RNA部分重新接起來。切下的片段環(huán)化成為具有催化活性的RNA，稱之為核酸類酶或催化活性RNA。這個(gè)結(jié)果使酶的傳統(tǒng)概念受到了挑戰(zhàn)，提出酶并不一定是蛋白質(zhì)的問題。我們究竟是否把RNA看作酶，或是酶是蛋白質(zhì)的概念應(yīng)該改變，隨著科學(xué)研究的發(fā)展，相信在不久的將來會(huì)得到解決。1.1.4酶的純化和固定化酶的純化在1920年后取得了重大的突破。1926年美國(guó)人Sumner首先從刀豆中獲得了不負(fù)載任何其他催化劑的脲酶蛋白質(zhì)結(jié)晶，從此確立了酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)的觀點(diǎn)，為酶的理化特性研究奠定了基礎(chǔ)。20世紀(jì)30年代掀起了酶結(jié)晶研究的熱潮。最有代表性的成果是1930年至1936年間Northrop等人制取了胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和羧肽酶A的結(jié)晶。至此人們已經(jīng)獲取了上百種酶的結(jié)晶，另外還有超過600種酶被提取純化。從20世紀(jì)50年代開始，酶及產(chǎn)酶細(xì)胞的固定化技術(shù)從酶學(xué)理論到生產(chǎn)實(shí)踐得到了迅速的發(fā)展。1953年，德國(guó)科學(xué)家Grubhofer和Schleith首先將聚氮基苯乙烯樹脂重氮化，將淀粉酶、胃蛋白酶、羧肽酶和核糖核酸酶結(jié)合，制成固定化酶，有效地進(jìn)行了酶的固定化研究。1971年，出現(xiàn)了固定化菌體技術(shù)，70年代后期人們開始運(yùn)用固定化細(xì)胞技術(shù)生產(chǎn)胞外酶。酶的純化和固定化到了80年代中期，固定化原生質(zhì)體技術(shù)則被用于生產(chǎn)胞內(nèi)酶，以去除細(xì)胞壁擴(kuò)散的障礙。酶固定化技術(shù)的發(fā)展也引起了食品、發(fā)酵工業(yè)一場(chǎng)大變革。美國(guó)在20世紀(jì)70年代初開始采用這一新技術(shù)，使玉米淀粉經(jīng)酶法液化、糖化、異構(gòu)化和固定化后，成功地工業(yè)化生產(chǎn)第一代、第二代和第三代高果糖漿，代替蔗糖作為可口可樂和百事可樂等飲料食品的甜味劑，提高了飲料質(zhì)量，是一項(xiàng)非常成功的技術(shù)創(chuàng)新。酶的純化和固定化目前為止，已發(fā)現(xiàn)自然界存在的酶有3000多種，但真正形成工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)的只有幾十種。因此，當(dāng)今食品酶學(xué)的研究開發(fā)具有廣闊的發(fā)展前景。隨著酶生產(chǎn)的發(fā)展，酶的應(yīng)用越來越廣泛。在生產(chǎn)應(yīng)用過程中，人們逐漸發(fā)現(xiàn)酶的穩(wěn)定性較差、不能重復(fù)使用等不足之處。于是，為了更好地發(fā)揮酶的催化功能，人們開始嘗試對(duì)酶進(jìn)行分子修飾，即通過各種方法，使酶分子結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而使酶的某些特性和功能發(fā)生改變，以滿足人們對(duì)酶應(yīng)用的要求。其方法之一就是固定化酶的研究。酶的純化和固定化1.1.5酶工程的發(fā)展自1969年日本的千畑一郎首次在工業(yè)上應(yīng)用固定化氨基?；笍腄L-氨基酸生產(chǎn)L-氨基酸后，學(xué)者們開始用“酶工程”這個(gè)新名詞來代表有效地利用酶的科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。而近20多年來，在酶和細(xì)胞固定化技術(shù)發(fā)展的同時(shí)，其他酶分子修飾技術(shù)也在不斷發(fā)展進(jìn)步。此外，酶的化學(xué)合成、人工模擬，以及各種酶的應(yīng)用技術(shù)研究，使酶工程不斷向廣度和深度發(fā)展，顯示出廣闊而誘人的前景。1.2酶的一般特征酶既然是生物催化劑，它就具有催化劑一般的特征。酶和一般催化劑一樣，只能催化熱力學(xué)上允許進(jìn)行的反應(yīng)，因?yàn)樵诜磻?yīng)中其本身不被消耗，因此有極少量就可大大加速化學(xué)反應(yīng)的進(jìn)行。它對(duì)化學(xué)反應(yīng)正逆兩個(gè)方向的催化作用是相同的。所以它可以縮短平衡到達(dá)的時(shí)間，而不改變反應(yīng)的平衡點(diǎn)。但酶和一般催化劑比較，又有其不同之處。重要1.2.1酶的催化效率高酶的一個(gè)突出的特點(diǎn)是催化效率極高。同一反應(yīng)，酶催化反應(yīng)的速度比一般催化劑催化的反應(yīng)速度要大106～1013倍。有極少量酶就可催化大量反應(yīng)物發(fā)生轉(zhuǎn)變。重要例如，鐵離子和過氧化氫酶都可以催化雙氧水（H202）分解成為水和氧氣。在一定條件下，1mol鐵離子可催化6×10-4mol雙氧水分解。在相同條件下，1mol過氧化氫酶卻可催化5×106mol的雙氧水分解。過氧化氫酶的催化效率達(dá)到鐵離子的1010倍。1.2.2酶作用的專一性酶的另外一個(gè)特點(diǎn)是它具有高度的專一性。酶對(duì)其所作用的物質(zhì)（稱為底物）有著嚴(yán)格的選擇性。一種酶僅能作用于一種物質(zhì)，或一類分子結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)，促其進(jìn)行一定的化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生一定的反應(yīng)產(chǎn)物，這種選擇性作用稱為酶的專一性。酶的專一性是酶的特性之一。重要例如，蛋白酶只能催化蛋白質(zhì)的水解，酯酶只催化酯類的水解，而淀粉酶只能催化淀粉的水解。若用一般催化劑，對(duì)作用物的要求就不那么嚴(yán)格，以上三類物質(zhì)都可以在酸或堿的催化下水解。

鍵專一性這種酶只對(duì)底物分子中其所作用的鍵要求嚴(yán)格，而不管鍵兩端所連基團(tuán)的性質(zhì)。例如，酯酶可以水解任何酸與醇所形成的酯，它不受酯鍵兩端基團(tuán)R和Rˊ的限制。基團(tuán)專一性有些酶對(duì)底物的要求較高，它們不但要求底物具有一定的化學(xué)鍵，而且對(duì)鍵的某一端所連的基團(tuán)也有一定的要求。例如，α-葡萄糖苷酶能催化任何α-葡萄糖苷的水解：此酶要求底物必須是D-葡萄糖通過α-糖苷鍵所形成的糖苷，但并不要求R基團(tuán)的性質(zhì)。胰蛋白酶能夠催化水解堿性氨基酸，如精氨酸或賴氨酸的羧基所形成的肽鍵，而對(duì)此肽鍵氨基端的氨基酸殘基沒有什么要求。絕對(duì)專一性這類酶具有高度的專一性。它們對(duì)底物的要求很嚴(yán)格，甚至有時(shí)只能催化一種底物，進(jìn)行一種化學(xué)反應(yīng)。例如脲酶只能作用于尿素，催化其水解產(chǎn)生氨及二氧化碳。而對(duì)尿素的各種衍生物，一般均不起作用。

此外，過氧化氫酶只能催化過氧化氫的分解，琥珀酸脫氫酶只能催化琥珀酸脫氫生成延胡索酸。凝血酶只能水解蛋白質(zhì)分子中精氨酸殘基的羧基與甘氨酸殘基的氨基所形成的肽鍵，因而這些酶對(duì)于其所作用的底物都具有高度的專一性。立體異構(gòu)專一性幾乎所有的酶對(duì)于立體異構(gòu)體都具有高度的專一性。即酶只能催化一種立體異構(gòu)體發(fā)生某種化學(xué)反應(yīng)，而對(duì)另一種立體異構(gòu)體則無作用。例如乳酸脫氫酶能催化L-乳酸脫氫變?yōu)楸?，?duì)D-乳酸則無作用。

D-氨基酸氧化酶能作用于各種D-氨基酸，催化其氧化脫氫，但對(duì)L-氨基酸則毫無作用。1.2.3大多數(shù)酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)酶是由生物活細(xì)胞產(chǎn)生的有催化能力的蛋白質(zhì)，只要不是處于變性狀態(tài)，無論是在細(xì)胞內(nèi)還是細(xì)胞外都可發(fā)揮催化作用。目前在食品工業(yè)應(yīng)用的酶也都是蛋白質(zhì)。紫外線、熱、表面活性劑、重金屬鹽以及酸堿變性劑等能使蛋白質(zhì)變性的因素，往往也能使酶失效。酶本身能被水解蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)水解酶分解而喪失活性。重要酶在生活細(xì)胞中產(chǎn)生，但有些酶被分泌到細(xì)胞外發(fā)揮作用。如人和動(dòng)物消化管中以及某些細(xì)菌所分泌的水解淀粉，脂肪和蛋白質(zhì)的酶，這類酶稱胞外酶。其他大部分酶在細(xì)胞內(nèi)起催化作用，稱為胞內(nèi)酶。這些酶在細(xì)胞內(nèi)常與顆粒體結(jié)合，并有著一定的分布。如線粒體上分布著三羧酸循環(huán)酶系和氧化磷酸化酶系，而蛋白質(zhì)生物合成的酶系則分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的核糖體上。1.3酶的分類和命名1833年P(guān)ayen和Persoz發(fā)現(xiàn)麥芽提取液的酒精沉淀物中包含一種熱敏性物質(zhì)可將淀粉水解變?yōu)樘?，由于其能從不可溶的淀粉顆粒中分離出可溶性的糊精，他們將此物質(zhì)命名為“diastase”意思是“分離”（中文現(xiàn)譯為“淀粉酶”），這樣隨意的方式成為酶命名的開端，后來命名一種酶時(shí)常加詞尾“ase”。在隨后的很長(zhǎng)一段時(shí)間里，出現(xiàn)了各種各樣的命名方式。有根據(jù)純化后酶的顏色來命名的，如老黃酶（oldyellowenzyme）；有根據(jù)酶的來源命名的，如無花果蛋白酶（ficin），胃蛋白酶（pepsin）；有根據(jù)酶作用的底物來命名的，如果膠酶（pectase）。1955年，為避免酶的命名混亂，當(dāng)時(shí)的國(guó)際生物化學(xué)協(xié)會(huì)（現(xiàn)發(fā)展為國(guó)際生物化學(xué)和分子生物學(xué)聯(lián)合會(huì)，IUBMB）決定成立了國(guó)際酶學(xué)委員會(huì)（EnzymeCommission）以規(guī)范酶的命名。http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/酶學(xué)委員會(huì)提出的命名規(guī)則酶學(xué)委員會(huì)提出以酶所催化的化學(xué)反應(yīng)性質(zhì)作為酶的分類和命名規(guī)則的主要依據(jù)，每一種酶都給以三個(gè)名稱：系統(tǒng)名，慣用名和一個(gè)數(shù)字編號(hào)。系統(tǒng)名要求能確切地表明底物的化學(xué)本質(zhì)及酶的催化性質(zhì)，它包括兩部分，底物名稱及反應(yīng)類型。若酶催化的反應(yīng)中有兩種底物起反應(yīng)，則這兩種底物均需表明，當(dāng)中用“：”隔開，例如多酚氧化酶其系統(tǒng)名稱為：1,2-苯二酚：氧氧化還原酶。慣用名慣用名不需要非常的精確，要求比較簡(jiǎn)短，使用方便，一般根據(jù)酶所作用的底物名稱、催化的反應(yīng)性質(zhì)、酶的來源或其他特點(diǎn)來進(jìn)行命名。許多酶的慣用名是延用系統(tǒng)命名之前就使用的名稱。酶的數(shù)字編號(hào)系統(tǒng)系統(tǒng)酶的數(shù)字編號(hào)系統(tǒng)系統(tǒng)根據(jù)酶所催化反應(yīng)的類型將酶分為6大類，并以4個(gè)阿拉伯?dāng)?shù)字來對(duì)每一種酶進(jìn)行編號(hào)。例如乙醇脫氫酶，編號(hào)為EC。EC是指酶學(xué)委員會(huì)（EnzymeCommission）。第一個(gè)數(shù)字代表酶的6個(gè)大分類，以1，2，3，4，5，6來分別代表如下6大酶類：（1）氧化還原酶（Oxidoreductases）催化氧化還原反應(yīng)；（2）轉(zhuǎn)移酶（Transferases）催化分子間基團(tuán)轉(zhuǎn)移的反應(yīng)；（3）水解酶（Hydrolases）催化水解反應(yīng)；（4）裂合酶（Lyases）催化非水解地除去底物分子中的基團(tuán)及其逆反應(yīng)；（5）異構(gòu)酶（Isomerases）催化分子的異構(gòu)反應(yīng)；（6）連接酶（Ligases）（也稱為合成酶）催化兩分子連接的反應(yīng)，反應(yīng)中酶與ATP的一個(gè)焦磷酸鍵相偶聯(lián)。同工酶的命名：同工酶是指在生物體內(nèi)或組織中催化相同反應(yīng)而具有不同分子形式（包括不同的氨基酸序列、空間結(jié)構(gòu)等）的酶，這種分子形式差異是由于酶蛋白的編碼基因不同，或者雖然基因相同，但基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA或者其翻譯產(chǎn)物是經(jīng)過不同的加工過程產(chǎn)生的。國(guó)際生化協(xié)會(huì)同工酶分委員會(huì)建議同工酶的名稱根據(jù)他們?cè)陔娪局蟹蛛x的位置確定，從電泳中向著陽(yáng)極移動(dòng)最遠(yuǎn)的酶開始依次編號(hào)。酶名稱的使用建議：系統(tǒng)名一般都比較長(zhǎng)，使用起來不方便，在許多場(chǎng)合下仍采用慣用名。但在科技文獻(xiàn)中，當(dāng)一種酶作為主要研究對(duì)象時(shí)，應(yīng)在文中第一次出現(xiàn)時(shí)標(biāo)明其系統(tǒng)名、數(shù)字編號(hào)以及酶的來源。例如乙醇脫氫酶在文中第一次出現(xiàn)時(shí)應(yīng)標(biāo)明“乙醇：NAD+

氧化還原酶（EC），來源于酵母”，其后則可以使用慣用名“乙醇脫氫酶”。如果酶不是文獻(xiàn)中的主要研究對(duì)象（例如只是作為試劑使用），則只需在第一次出現(xiàn)時(shí)在慣用名后的括號(hào)中標(biāo)明酶的數(shù)字編號(hào)如“乙醇脫氫酶（EC）”1.4酶學(xué)對(duì)食品科學(xué)的重要性酶的應(yīng)用已有幾千年的歷史，盡管那時(shí)人們并沒有任何有關(guān)催化劑和化學(xué)反應(yīng)本質(zhì)方面的知識(shí)，但在這些食品的制作加工過程中，人們已經(jīng)開始不自覺地利用微生物細(xì)胞產(chǎn)生的各種酶的催化作用。例如：在釀造中利用發(fā)芽的大麥轉(zhuǎn)化淀粉，用破碎的木瓜樹葉包裹肉以使肉嫩化，都是古代食品制備中應(yīng)用酶的例子。而這些利用酶進(jìn)行食品生產(chǎn)的古老技術(shù)也已代代相傳至今。重要酶學(xué)和食品科學(xué)的關(guān)系是十分密切的。早在科學(xué)家們最初開始研究消化、發(fā)酵和水解反應(yīng)中的酶時(shí)就都涉及到了食品。很長(zhǎng)時(shí)間以來，食品科學(xué)家們對(duì)酶在食品中的各種作用，尤其是導(dǎo)致食品變質(zhì)敗壞的酶作用進(jìn)行了細(xì)致研究，而近幾十年來隨著酶研究的不斷深入和酶生產(chǎn)的快速發(fā)展，酶在食品科學(xué)的重要性日益凸現(xiàn)。1.4.1酶對(duì)食品加工和保藏的重要性（1）控制動(dòng)植物原料中的酶（2）利用酶的催化活性進(jìn)行生產(chǎn)活動(dòng)（1）控制動(dòng)植物原料中的酶動(dòng)植物和微生物生長(zhǎng)發(fā)育的過程中，伴隨著許多重要的酶催化反應(yīng)的發(fā)生和作用。植物采摘或動(dòng)物屠宰后，體內(nèi)的酶催化作用仍然在繼續(xù)進(jìn)行，直至酶系的底物耗盡或pH不再適合反應(yīng)進(jìn)行時(shí)才終止。因此利用酶的這一性質(zhì)，人們即可以通過控制食品原料中的酶活力有效改善食品原料的風(fēng)味和質(zhì)地結(jié)構(gòu)?？刂品椒刂泼富盍Φ姆椒ㄖ饕菬崽幚矸ê屠鋬龇āＴ诓粨p害食品原料品質(zhì)的前提下，適當(dāng)?shù)貙?duì)其進(jìn)行熱處理，能夠在一定程度上降低原料中微生物產(chǎn)生的酶的活力。進(jìn)行熱處理加工時(shí)可將過氧化物酶殘留量作為指標(biāo)以確定果蔬產(chǎn)品最適熱處理?xiàng)l件。通過冷凍法使食品處于低溫環(huán)境下，也能夠降低酶活力延長(zhǎng)食品保藏期，但在冷凍前必須預(yù)先將原料熱處理，否則解凍后酶活將會(huì)顯著回升。（2）利用酶的催化活性另外，酶作為一種反應(yīng)的催化劑，在食品加工及保藏的應(yīng)用中，有著其他物理或化學(xué)手段無法比擬的優(yōu)越性。首先，它不會(huì)有任何有害殘留物質(zhì)；其次，由于酶催化反應(yīng)有著高度的專一性和高效性，酶制劑用量小，經(jīng)濟(jì)合算；第三，酶催化反應(yīng)條件溫和，食品營(yíng)養(yǎng)成分損失少，易于操作且能耗較低。因此，酶制劑在食品工業(yè)中的應(yīng)用開始得很早，且成效顯著，研究也相當(dāng)活躍。例如葡萄糖氧化酶作為除氧劑普遍應(yīng)用于食品保鮮及包裝中，延長(zhǎng)食品保質(zhì)期。除氧是食品保藏中的必要手段，葡萄糖氧化酶是一種對(duì)氧非常專一理想的除氧劑，能夠有效防止食品變質(zhì)，而對(duì)于已經(jīng)發(fā)生的氧化變質(zhì)作用，它也可以阻止其進(jìn)一步發(fā)展。另外，葡萄糖氧化酶又具有酶的催化專一性，在除氧的同時(shí)不會(huì)與食品中其他物質(zhì)發(fā)生作用。溶菌酶能夠水解細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖的β-1，4糖苷鍵，導(dǎo)致細(xì)菌自溶死亡，并且溶菌酶在食鹽、蔗糖等溶液中穩(wěn)定，耐酸耐熱性強(qiáng)，因此非常適宜用于各種食品的防腐。它對(duì)多種細(xì)菌有抗菌作用，還能殺死腸道腐敗球菌增加抗感染力，同時(shí)還能促進(jìn)嬰兒腸道雙歧乳酸桿菌增殖，促進(jìn)乳酪蛋白凝乳利于消化。溶菌酶對(duì)人體完全無毒副作用，是天然安全的食品防腐劑。1.4.2酶對(duì)食品安全的重要性食品是人類賴以生存和發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)，而食品安全問題則是關(guān)系到人民健康和國(guó)計(jì)民生的重大問題。近幾年來，酶制劑工業(yè)迅速不斷地發(fā)展。特別是隨著生物科技的日新月異，人們已經(jīng)能夠通過基因工程手段改造部分微生物基因，從而改變酶蛋白的基本結(jié)構(gòu)，達(dá)到強(qiáng)化酶在某方面功能特性的目的。然而，這種做法也給食品酶的應(yīng)用帶來很大的安全隱患。所有新鮮食品當(dāng)中都富含各種酶類，相當(dāng)數(shù)量的酶會(huì)隨人們食用食品而攝入人體內(nèi)。在攝入的酶中，不僅有動(dòng)物和植物來源的，而且還有微生物來源的。作為微生物來源的食品酶制劑，通常除了包括酶蛋白本身以外，還含有微生物的代謝產(chǎn)物，以及添加的保存劑和穩(wěn)定劑。如果將加入食品中的酶看作為食品添加劑，那么就應(yīng)該考慮到衛(wèi)生和安全方面的問題。酶作用會(huì)使食品品質(zhì)特性發(fā)生改變，甚至?xí)a(chǎn)生毒素和其他不利于健康的有害物質(zhì)。由于在生物材料中，酶和底物處在細(xì)胞的不同部位，故僅當(dāng)生物材料破碎時(shí)，酶和底物的相互作用才有可能發(fā)生，此外酶與底物作用也受到環(huán)境條件的影響。有時(shí)本身無毒的底物會(huì)在酶催化降解下轉(zhuǎn)變成有害物質(zhì)。例如，木薯含有生氰糖苷，雖然它本身并無毒，但是在內(nèi)源糖苷酶的作用下，產(chǎn)生氫氰酸。十字花科植物的種子以及皮和根含有葡萄糖芥苷，葡萄糖芥苷屬于硫糖苷，在芥苷酶作用下會(huì)產(chǎn)生對(duì)人和動(dòng)物體有害的甲狀腺腫素。雖然一些酶的作用會(huì)產(chǎn)生毒素和有害物質(zhì)，但是我們也可以利用酶的作用去除食品中的毒素。例如，利用乳糖酶預(yù)先處理乳制品，可以有效緩解或消除人體因消化乳糖困難而引起的胃脹氣、腹痛、嘔吐或拉肚子等癥狀。另外，由于人體內(nèi)缺乏α-D-半乳糖苷酶和β-D-果糖苷酶，不能水解豆類中的一些寡糖，這不但減少了人體對(duì)一些單糖的吸收，而且這些寡糖在腸道中發(fā)酵所產(chǎn)生的氣體還會(huì)引起人體不適，利用植酸酶作用即可顯著改善這種情況。另有研究發(fā)現(xiàn)，α-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶用于甜葉菊加工，可以脫苦澀味，黃曲霉毒素B1經(jīng)黃曲霉毒素脫毒酶處理后毒性、致畸性將極大降低。所有這些都證明酶法解毒是一種安全、高效的解毒方法，對(duì)食品無污染、有高度的選擇性，且不影響食品的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。1.4.3酶對(duì)食品營(yíng)養(yǎng)的重要性酶作用有可能導(dǎo)致食品中營(yíng)養(yǎng)組分的損失。雖然在食品加工中營(yíng)養(yǎng)組分的損失是由于非酶作用所引起的，但是食品材料中一些酶的作用也是不能忽視的。例如，脂肪氧合酶催化胡蘿卜素降解使面粉漂白，在其他食品如一些蔬菜的加工過程中脂肪氧合酶也參與了胡蘿卜素的破壞過程。另外，在食品加工過程中，酶也參與了維生素B的破壞過程，例如，在一些用發(fā)酵方法加工的魚制品中，由于魚和細(xì)菌中的硫胺素酶的作用，使這些食品缺少維生素B。抗壞血酸是最不穩(wěn)定的維生素，在食品加工和保藏中，Vc常由于酶或非酶的因素而被氧化。同樣的，我們也可以利用酶作用去除食品中的抗?fàn)I養(yǎng)素，提高食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，使食品中的營(yíng)養(yǎng)元素更利于人體的吸收利用。例如，由于植酸以鈣、鎂、和鉀鹽的形式存在于豆類和谷類中，易于同膳食中的鐵、鋅和其他金屬離子形成難溶的絡(luò)合物，因而使人體吸收這些元素變得困難。此外，植酸還能同蛋白質(zhì)形成穩(wěn)定的復(fù)合物，從而降低豆類蛋白質(zhì)的生理價(jià)值。植酸酶能催化植酸水解成磷酸和肌醇，如果在加熱處理豆類食物之前，先將其粉碎并調(diào)成糊狀，然后在55℃和pH5.2條件下利用豆中內(nèi)源的植酸酶和α-D-半乳糖苷酶分解，這樣處理可以顯著降低這些酶的含量。由于豆類和谷類中植酸酶的活力通常是較低的，因此，可以外加植酸酶或富含植酸酶的小麥芽，以促進(jìn)植酸的分解。近幾年植酸酶還用于釀造，以改善原料中磷的利用，以及用于去鉀大豆蛋白食物的生產(chǎn)，成為腎臟病人蛋白質(zhì)的來源。1.4.4酶對(duì)食品分析的重要性酶在食品分析中也有相當(dāng)重要的應(yīng)用。酶在定量分析中的應(yīng)用可以追溯到19世紀(jì)中期。當(dāng)時(shí)科學(xué)家們?cè)捎名溠刻崛∽鳛檫^氧化物酶源，以愈創(chuàng)木酚作為共底物或指示劑測(cè)定過氧化氫。然而，酶法分析真正的發(fā)展應(yīng)歸于它在臨床實(shí)驗(yàn)室中的廣泛應(yīng)用。淀粉的測(cè)定早在1914年臨床上就開始采用脲酶測(cè)定尿中的尿素，但是在臨床實(shí)驗(yàn)室中酶分析的真正突破要推遲到1958年，當(dāng)時(shí)轉(zhuǎn)氨酶分析發(fā)展成為診斷肝病和心臟病的一個(gè)有效手段。到了20世紀(jì)50年代前已有60種物質(zhì)能借助于酶法分析。這以后，酶法分析的進(jìn)展主要取決于能否以合理的價(jià)格提供純酶、底物和輔助因子。酶法分析具有準(zhǔn)確、快速、專一性和靈敏性強(qiáng)等特點(diǎn)，其中最大優(yōu)點(diǎn)就是酶的催化專一性強(qiáng)。當(dāng)待測(cè)樣品中含有結(jié)構(gòu)和性質(zhì)與待測(cè)物十分相似（如同分異構(gòu)體）的共存物時(shí)，要發(fā)現(xiàn)待測(cè)物特性或要分離純化待測(cè)物往往十分困難。而利用僅作用于待測(cè)物的酶，不需要分離就能辯識(shí)待測(cè)組分，即可對(duì)待測(cè)物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析。所以酶法分析的樣品一般不需要進(jìn)行很復(fù)雜的預(yù)處理，尤其適合食品這一復(fù)雜體系。此外，由于酶催化的高效性，酶法分析的分析速度大多比較快。目前酶在食品分析中的應(yīng)用涉及食品組分的酶法測(cè)定、食品質(zhì)量的酶法評(píng)價(jià)及食品衛(wèi)生與安全檢測(cè)等多個(gè)方面。近年來，食品酶法分析由于其的方便快捷和技術(shù)的不斷發(fā)展進(jìn)步，已逐漸成為食品分析檢測(cè)中的一個(gè)重要分支和一種非常有效的分析手段。1.4.5酶與食品生物技術(shù)食品生物技術(shù)是生物技術(shù)的重要分支學(xué)科，主要研究基因工程、細(xì)胞工程、酶工程、發(fā)酵工程在食品工業(yè)上的應(yīng)用。酶工程的主要研究?jī)?nèi)容是把游離酶固定化，或者把經(jīng)過培養(yǎng)發(fā)酵產(chǎn)生目的酶活力高峰時(shí)的整個(gè)微生物細(xì)胞再固定化，然后直接應(yīng)用于食品生產(chǎn)過程中物質(zhì)的轉(zhuǎn)化。酶不僅作為一類重要的研究對(duì)象，同時(shí)也作為重要的研究工具。例如以內(nèi)切酶和連接酶作為工具酶將外源DNA或目的基因連接到載體上，獲得DNA重組體，以欲改造的動(dòng)植物作為受體，使重組DNA進(jìn)入受體細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)外源DNA的轉(zhuǎn)化，從而生產(chǎn)出具有特定優(yōu)良性狀的轉(zhuǎn)基因食品。

酶的生產(chǎn)與分離純化2.1國(guó)內(nèi)外酶制劑工業(yè)生產(chǎn)及應(yīng)用現(xiàn)狀2.1.1．新技術(shù)在生產(chǎn)中的應(yīng)用：三種方法：組織提取：木瓜蛋白酶、凝乳蛋白酶微生物發(fā)酵：最大量的來源化學(xué)及生物合成：生物重組高新技術(shù)的應(yīng)用：酶的修飾、固定化、基因重組、膜分離技術(shù)、冷凍干燥、微膠囊2.1.2.集中壟斷，市場(chǎng)全球化：規(guī)模企業(yè)由20世紀(jì)80年代初的80多家減少至20多家，占市場(chǎng)90%丹麥諾和諾得公司（諾維信novozymes）→1978年進(jìn)入中國(guó)諾維信公司，占50%市場(chǎng)（天津）；美國(guó)杰能科公司（Genencor）→98年進(jìn)入中國(guó)，與無錫合資，控股80%（無錫），兩家公司銷售額占全球2/3；（2005年杰能科國(guó)際公司被丹尼斯克公司收購(gòu)）；芬蘭科特公司和丹麥丹尼斯克公司酶制劑業(yè)務(wù)合并，Pfizer，Rhone，SKW,Biosystems，日本天野2.1.3.品種、規(guī)模不斷擴(kuò)大目前30多家600多個(gè)品種，應(yīng)用于18個(gè)工業(yè)領(lǐng)域。我國(guó)2000年酶制劑產(chǎn)量為30萬噸，100家，市場(chǎng)份額僅占5%，以未經(jīng)除菌去渣的粗制品粉狀酶為主。國(guó)際以液體、顆粒為主。國(guó)內(nèi)糖化酶、ａ-淀粉酶、蛋白酶三大類占了97%，顯然不合理。重要產(chǎn)品普魯蘭酶、真菌淀粉酶、系列果膠酶、低溫堿性蛋白酶，國(guó)內(nèi)尚未投入生產(chǎn);我國(guó)有7家上市公司介入酶制劑開發(fā)生產(chǎn)。2.1.4.應(yīng)用領(lǐng)域不斷擴(kuò)大：美國(guó)酶制劑年產(chǎn)值6.25億美元，食品工業(yè)占62%，拓展飼料工業(yè)、洗滌劑工業(yè)、化學(xué)工業(yè)。2.2酶的發(fā)酵技術(shù)利用微生物產(chǎn)酶的優(yōu)點(diǎn)是：(1)微生物種類多、酶種豐富，且菌株易誘變，菌種多樣。(2)微生物生長(zhǎng)繁殖快，易提取酶，特別是胞外酶。(3)微生物培養(yǎng)基來源廣泛、價(jià)格便宜。(4)可以采用微電腦等新技術(shù)，控制酶發(fā)酵生產(chǎn)過程，生產(chǎn)可連續(xù)化、自動(dòng)化，經(jīng)濟(jì)效益高。(5)可以利用以基因工程為主的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，選育菌種、增加酶產(chǎn)率和開發(fā)新酶種。因此，下面將主要介紹微生物發(fā)酵法產(chǎn)酶的一般原理和工藝。2.2.1產(chǎn)酶微生物菌種是發(fā)酵生產(chǎn)酶的重要條件。菌種不僅與產(chǎn)酶種類、產(chǎn)量密切相關(guān)，而且與發(fā)酵條件、工藝等關(guān)系密切。已經(jīng)在自然界中發(fā)現(xiàn)的酶有數(shù)千種，目前投入工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)的酶約有50～60種。它們的生產(chǎn)菌種十分廣泛，包括細(xì)菌、放線菌、酵母菌、霉菌。2.2.2酶的發(fā)酵技術(shù)

培養(yǎng)基培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分是微生物發(fā)酵產(chǎn)酶的原料，主要是碳源、氮源，其次是無機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子和產(chǎn)酶促進(jìn)劑等。重要（1）碳源碳素是構(gòu)成菌體成分的主要元素，也是細(xì)胞貯藏物質(zhì)和生產(chǎn)各種代謝產(chǎn)物的骨架，還是菌體生命活動(dòng)的能量的主要來源。當(dāng)前酶制劑生產(chǎn)上使用的菌種大都是只能利用有機(jī)碳的異養(yǎng)型微生物。有機(jī)碳的主要來源有：一是農(nóng)副產(chǎn)品中如甘薯、麩皮、玉米、米糠等淀粉質(zhì)原料；二是野生的如土茯苓、橡子、石蒜等淀粉質(zhì)原料。此外，以石油產(chǎn)品中12～16碳的成分來作碳源，如以某些嗜石油微生物生產(chǎn)蛋白酶、脂酶，均已獲得成功。重要不同的細(xì)胞對(duì)各種碳源的利用差異很大，所以在配制培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)根據(jù)不同細(xì)胞的不同要求而選擇合適的碳源。另外，選擇碳源除考慮營(yíng)養(yǎng)要求外，還要考慮酶生物合成的誘導(dǎo)作用和是否存在分解代謝物阻遏作用。盡量選用具有誘導(dǎo)作用的碳源，盡量不用或少用有分解代謝物阻遏作用的碳源。例如，α－淀粉酶的發(fā)酵生產(chǎn)中，應(yīng)該選用有誘導(dǎo)作用的淀粉作為碳源，而不用對(duì)該酶有分解代謝物阻遏作用的果糖作為碳源。重要（2）氮源氮是生物體內(nèi)各種含氮物質(zhì)，如氨基酸、蛋白質(zhì)、核苷酸、核酸等的組成成分。酶制劑生產(chǎn)中的氮源主要有有機(jī)氮源和無機(jī)氮源兩種，常用的有機(jī)氮源有：豆餅、花生餅、菜籽餅、魚粉、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、多肽、氨基酸等；無機(jī)氮源有：(NH4)2SO4、NH4Cl、NH4NO3、(NH4)3P04、尿素等。重要不同的細(xì)胞對(duì)各種氮源的要求各不相同，應(yīng)根據(jù)要求進(jìn)行選擇和配制。一般來說，動(dòng)物細(xì)胞要求有機(jī)氮，植物細(xì)胞主要要求無機(jī)氮。多數(shù)情況下將有機(jī)氮源和無機(jī)氮源配合使用才能取得較好的效果。例如黑曲霉酸性蛋白酶生產(chǎn)，只用銨鹽或硝酸鹽為氮源時(shí)，酶產(chǎn)量?jī)H為有胨時(shí)的30%。只用有機(jī)氮源而不用無機(jī)氮源時(shí)產(chǎn)量也低，故一般除使用高濃度有機(jī)氮源外尚需添加1%~3%的無機(jī)氮源。重要（3）碳氮比在微生物酶生產(chǎn)培養(yǎng)基中碳源與氮源的比例是隨生產(chǎn)的酶類、生產(chǎn)菌株的性質(zhì)和培養(yǎng)階段的不同而改變的。一般蛋白酶(包括酸性、中性和堿性蛋白酶)生產(chǎn)采用碳氮比低的培養(yǎng)基比較有利，例如黑曲霉3.350酸性蛋白酶生產(chǎn)采用由豆餅粉3.75%、玉米粉0.625%、魚粉0.625%。NH4Cl1%、CaCl20.5%、Na2HP040.2%、豆餅石灰水解液10%組成的培養(yǎng)基；重要淀粉酶(包括α－淀粉酶、糖化酶、β－淀粉酶等)生產(chǎn)的碳氮比一般比蛋白酶生產(chǎn)略高，例如枯草桿菌TUD127α－淀粉酶生產(chǎn)采用由豆餅粉4%、玉米粉8%、Na2HP040.8%、(NH4)2SO40.4%、CaCl20.2%組成的培養(yǎng)基。而在淀粉酶生產(chǎn)中糖化酶生產(chǎn)培養(yǎng)基的碳氮比是最高的。以上是蛋白酶和淀粉酶生產(chǎn)培養(yǎng)基碳氮比的一般規(guī)律，但是由于菌種很多而其性質(zhì)各異。很難說都是符合上述規(guī)律的。重要在微生物酶生產(chǎn)過程中，培養(yǎng)基的碳氮比也因培養(yǎng)過程不同而異。例如種子培養(yǎng)時(shí)，為了適應(yīng)菌體生長(zhǎng)繁殖的需要，要求提供合成細(xì)胞蛋白質(zhì)的氮多些，容易利用的氮源的比例大些，種子培養(yǎng)基的碳氮比一般要比發(fā)酵培養(yǎng)基低些。發(fā)酵時(shí)，不同發(fā)酵階段要求的碳氮比也是不同的。例如在枯草桿菌BF－7658生產(chǎn)α－淀粉酶的發(fā)酵過程中，發(fā)酵前期要求培養(yǎng)基的碳氮比適當(dāng)降低，以利菌體生長(zhǎng)繁殖，發(fā)酵中后期要求培養(yǎng)基的碳氮比適當(dāng)提高，以促進(jìn)淀粉酶的生成。重要（4）無機(jī)鹽微生物酶生產(chǎn)和其他微生物產(chǎn)品生產(chǎn)一樣，培養(yǎng)基中需要有磷酸鹽及硫、鉀、鈉、鈣、鎂等元素存在。在酶生產(chǎn)中常以磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀等磷酸鹽作為磷源，以硫酸鎂為硫源和鎂源。鈣離子對(duì)淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等多種酶的活性有十分重要的穩(wěn)定作用，例如在無Ca2+存在時(shí)灰色鏈霉菌中性蛋白酶只在pH7~7.5很小范圍內(nèi)穩(wěn)定，當(dāng)有Ca2+存在時(shí)穩(wěn)定pH范圍可以擴(kuò)大到5～7。鈉離子有控制細(xì)胞滲透壓使酶產(chǎn)量增加的作用，酶生產(chǎn)的培養(yǎng)基中有時(shí)以磷酸氫二鈉及硝酸鈉等形式加入，例如米曲霉α－淀粉酶生產(chǎn)，添加適量的硝酸鈉以促進(jìn)酶生產(chǎn)。在天然培養(yǎng)基中，一般微量元素不必另外加入，但也有一些例外。如玉米粉、豆粉為碳源時(shí)，添加100ppmCo2+和Zn2+，放線菌166蛋白酶活力可增加70%～80%。重要（5）生長(zhǎng)因子微生物還需一些微量的像維生素一類的物質(zhì)，才能正常生長(zhǎng)發(fā)育，這類物質(zhì)統(tǒng)稱生長(zhǎng)因子(或生長(zhǎng)素)。其中包括某些氨基酸、維生素、嘌呤或嘧啶等。酶制劑生產(chǎn)中所需的生長(zhǎng)因子，大多是由天然原料提供，如玉米漿、麥芽汁、豆芽汁、酵母膏、麩皮、米糠等。玉米漿中一般含有生長(zhǎng)素32~128mg/mL。重要（6）產(chǎn)酶促進(jìn)劑產(chǎn)酶促進(jìn)劑是指在培養(yǎng)基中添加某種少量物質(zhì)，能顯著提高酶的產(chǎn)率，這類物質(zhì)稱為產(chǎn)酶促進(jìn)劑。產(chǎn)酶促進(jìn)劑大體上分為兩種：一是誘導(dǎo)物，二是表面活性劑。表面活性劑，如吐溫－80的濃度為0.1%時(shí)能增加許多酶的產(chǎn)量。表面活性劑能增加細(xì)胞的通透性，處在氣－液界面改善了氧的傳遞速度，還可以保護(hù)酶的活性。生產(chǎn)上常采用非離子型表面活性劑，如聚乙二醇、聚乙烯醇衍生物、植酸類、焦糖、羧甲基纖維素、苯乙醇等。離子型的表面活性劑對(duì)微生物有害。用于食品、醫(yī)藥的酶的生產(chǎn)中所用的表面活性劑還須對(duì)人、畜無害。此外各種產(chǎn)酶促進(jìn)劑的效果還受到菌種，種齡、培養(yǎng)基組成的影響。重要

液體深層發(fā)酵的工藝控制酶的發(fā)酵生產(chǎn)中發(fā)酵效果除了受到菌種產(chǎn)酶性能的影響外，還受到發(fā)酵溫度、pH、溶氧量等條件的影響。(1)溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響發(fā)酵溫度的變化主要隨著微生物代謝反應(yīng)、發(fā)酵中通風(fēng)、攪拌速度的變化而變化的。微生物在生長(zhǎng)發(fā)育中，不斷地吸收培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分來合成菌體的細(xì)胞物質(zhì)和酶時(shí)的生化反應(yīng)都是吸熱反應(yīng)；培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被大量分解時(shí)的生化反應(yīng)都是放熱反應(yīng)。發(fā)酵初期合成反應(yīng)吸收的熱量大于分解反應(yīng)放出的熱量，發(fā)酵液需要升溫。當(dāng)菌體繁殖旺盛時(shí)，情況則相反，發(fā)酵液溫度就自行上升，加上通風(fēng)攪拌所帶來的熱量，這時(shí)，發(fā)酵液必須降溫，以保持微生物生長(zhǎng)繁殖和產(chǎn)酶所需的適宜溫度。微生物生長(zhǎng)繁殖和產(chǎn)酶的最適溫度隨著菌種和酶的性質(zhì)不同而異，生長(zhǎng)繁殖和產(chǎn)酶的最適溫度往往不一致。一般細(xì)菌為37℃，霉菌和放線菌為28～30℃，一些嗜熱微生物需在40~50℃下生長(zhǎng)繁殖，如紅曲霉生長(zhǎng)溫度35~37℃，而生產(chǎn)糖化酶的最適溫度為37～40℃。在酶生產(chǎn)中，為了有利于菌體生長(zhǎng)和酶的合成，也有進(jìn)行變溫生產(chǎn)的。例如以枯草桿菌ASl.398進(jìn)行中性蛋白酶生產(chǎn)時(shí)，培養(yǎng)溫度必須從31℃逐漸升溫至40℃，然后再降溫到31℃進(jìn)行培養(yǎng)，蛋白酶產(chǎn)量比不升溫者高66%。據(jù)報(bào)道，酶生產(chǎn)的溫度對(duì)酶活力的穩(wěn)定性有影響，例如用嗜熱芽孢桿菌進(jìn)行α－淀粉酶生產(chǎn)時(shí)，在55℃培養(yǎng)所產(chǎn)生的酶的穩(wěn)定性比35℃好。(2)pH對(duì)產(chǎn)酶的影響種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的pH直接影響酶的產(chǎn)量和質(zhì)量。在發(fā)酵過程中，微生物不斷分解和同化營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)排出代謝產(chǎn)物。由于這些產(chǎn)物都與pH有直接關(guān)系，因此發(fā)酵液pH在不斷發(fā)生變化。生產(chǎn)上根據(jù)pH的變化情況常作為生產(chǎn)控制的根據(jù)。一般來說，培養(yǎng)基成分中碳/氮(C/N)比高，發(fā)酵液傾向于酸性，pH低；C/N低，發(fā)酵液傾向于堿性，pH高。pH的這些變化情況，常常引起細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)酶環(huán)境的變化，對(duì)產(chǎn)酶帶來不利的影響。因此生產(chǎn)中常采用一些控制pH的方法，通常有：添加緩沖液維持一定的pH；調(diào)節(jié)通風(fēng)量維持發(fā)酵液的氧化還原電位于一定范圍；調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的初始pH，保持一定的C/N比；當(dāng)發(fā)酵液pH過高時(shí)用糖或淀粉來調(diào)節(jié)，pH過低時(shí)，通過氮調(diào)節(jié)。(3)通風(fēng)量對(duì)產(chǎn)酶的影響其實(shí)通風(fēng)量的多少應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)基中的溶解氧而定。一般來說，在發(fā)酵初期，雖然幼細(xì)胞呼吸強(qiáng)度大，耗氧多，但由于菌體少，相對(duì)通風(fēng)量可以少些；菌體生長(zhǎng)繁殖旺盛期時(shí)，耗氧多，要求通風(fēng)量大些；產(chǎn)酶旺盛時(shí)的通風(fēng)量因菌種和酶種而異，一般需要強(qiáng)烈通風(fēng)；但也有例外，通風(fēng)量過多反而抑制酶的生成。因此，菌種、酶種、培養(yǎng)時(shí)期、培養(yǎng)基和設(shè)備性能都能影響通風(fēng)量，從而影響酶的產(chǎn)量。目前用于酶制劑生產(chǎn)的微生物都為好氣性微生物，生產(chǎn)上普遍采用自動(dòng)測(cè)定和記錄溶解氧的儀表。(4)攪拌的影響對(duì)于好氣性微生物的深層發(fā)酵，除了需要通氣外，還需要攪拌。攪拌有利于熱交換、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與菌體均勻接觸，降低細(xì)胞周圍的代謝產(chǎn)物，從而有利于新陳代謝。同時(shí)可打破空氣氣泡，使發(fā)酵液形成湍流，增加湍流速度，從而提高溶氧量，增加空氣利用。但攪拌速度主要因菌體大小而異，由于攪拌產(chǎn)生剪切力，易使細(xì)胞受損。同時(shí)攪拌也帶來一定機(jī)械熱，易使發(fā)酵液溫度發(fā)生變化。攪拌速度還與發(fā)酵液黏度有關(guān)。(5)泡沫的影響發(fā)酵中往往產(chǎn)生較多的泡沫。泡沫的存在阻礙了CO2的排除，影響溶氧量，同時(shí)泡沫過多影響補(bǔ)料，也易使發(fā)酵液溢出罐外造成跑料。因此，生產(chǎn)上必須采用消泡措施。一般除了機(jī)械消泡外，還可利用消泡劑。消泡劑主要是一些天然的礦物油類、醇類、脂肪酸類、胺類、酰胺類、醚類、硫酸酯類、金屬皂類、聚硅氧烷和聚硅酮，其中以聚甲基硅氧烷最好。我國(guó)常用聚氧丙烯甘油醚或泡敵(聚環(huán)氧丙環(huán)氧乙烷甘油醚)。理想的消泡劑，其表面相互作用力應(yīng)低，而且應(yīng)難溶于水，還不能影響氧的傳遞速率和微生物的正常代謝。(6)濕度用固體培養(yǎng)基生產(chǎn)酶制劑時(shí)，一般前期濕度低些，培養(yǎng)后期濕度大些，有利于產(chǎn)酶。2.3酶的分離純化酶的分離純化工作，是酶學(xué)研究的基礎(chǔ)。酶的純化過程，就目前而言，還是一門實(shí)驗(yàn)科學(xué)。一個(gè)特定酶的提純往往需要通過許多次小實(shí)驗(yàn)進(jìn)行摸索，沒有通用的規(guī)律可循。酶的純化過程與一般的蛋白質(zhì)純化過程相比，又有其本身獨(dú)有的特點(diǎn)：一是特定的一種酶在細(xì)胞中的含量很少，二是酶可以通過測(cè)定活力的方法加以跟蹤，前者給純化帶來了困難，而后者卻能使我們迅速找出純化過程的關(guān)鍵所在。2.3.1酶原料的選擇一般來說，為了使純化過程容易進(jìn)行，總是選擇目的酶含量最多的生物組織為原料來進(jìn)行提取純化的。當(dāng)然，也要考慮原料的來源、取材方便、經(jīng)濟(jì)等因素。在分離純化動(dòng)物Cu，Zn－SOD(超氧化物歧化酶)時(shí)，一般就以含Cu，Zn－SOD很高的動(dòng)物血球?yàn)樵牧?。Mn－SOD主要存在于線粒體中，所以，龍蝦、靈芝草、人體組織適宜于作為提取Mn－SOD的原材料。但龍蝦、靈芝草等非常昂貴，人體組織也很難得到，因而，除非是特殊目的的純化，一般不選用這些材料提取酶。目前，利用動(dòng)、植物細(xì)胞體外大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)，可以大量獲得以前極為珍貴的原材料(例如人參細(xì)胞、某些昆蟲細(xì)胞等)，用于酶的分離純化。利用基因工程重組DNA技術(shù)，能夠使某些在細(xì)胞中含量極微的酶的純化成為可能。例如，大腸桿菌胞內(nèi)芳香族氨基酸的合成需要EPSP合成酶（丙酮酰莽草酸磷酸合成酶）的參與?，F(xiàn)已分離出這種酶的基因并重組入多拷貝質(zhì)粒pAT153，將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，產(chǎn)生一種比野生型大腸桿菌株高100倍EPSP合成酶含量的新菌株。從18g新菌株的菌體中，可純化得4.8mgEPSP合成酶。2.3.2酶的提取

生物組織的破碎各種生物組織的細(xì)胞有著不同的特點(diǎn)，在考慮破碎方法時(shí)，要根據(jù)細(xì)胞性質(zhì)、處理量及酶的性質(zhì)，采用合適的方法。(1)機(jī)械(勻漿)法利用機(jī)械力的攪拌、剪切、研碎細(xì)胞。常用的有高速組織搗碎機(jī)，高壓勻漿泵、玻璃或Teflon加研棒勻漿器高速球磨機(jī)或直接用研缽研磨等。(2)超聲波法超聲波是破碎細(xì)胞或細(xì)胞器的一種有效手段。經(jīng)過足夠時(shí)間的超聲波處理，細(xì)菌和酵母細(xì)胞都能得到很好的破碎。超聲處理的主要問題是超聲空穴局部過熱引起酶活性喪失，所以超聲振蕩處理的時(shí)間應(yīng)盡可能短，容器周圍以冰浴冷卻處理，盡量減小熱效應(yīng)引起的酶的失活。(3)凍融法生物組織經(jīng)冰凍后，細(xì)胞胞液結(jié)成冰晶，使細(xì)胞壁脹破。凍融法所需設(shè)備簡(jiǎn)單，普通家用冰箱的冷凍室即可進(jìn)行凍融。一般需在凍融液中加入蛋白酶抑制劑，如PMSF(苯甲基磺酰氟)、絡(luò)合劑EDTA、還原劑DTT(二硫蘇糖醇)等以防破壞目的酶。(4)滲透壓法滲透破碎是破碎細(xì)胞最溫和的方法之一。細(xì)胞在低滲溶液中由于滲透壓的作用，溶脹破碎。如紅血球在純水中會(huì)發(fā)生破壁溶血現(xiàn)象。但這種方法對(duì)具有堅(jiān)韌的多糖細(xì)胞壁的細(xì)胞，如植物、細(xì)菌和霉菌不太適用，除非用其他方法先除去這些細(xì)胞外層堅(jiān)韌的細(xì)胞壁。(5)酶消化法利用溶菌酶、蛋白水解酶、糖苷酶對(duì)細(xì)胞膜或細(xì)胞壁的酶解作用，使細(xì)胞崩解破碎。將革蘭氏陽(yáng)性菌(如枯草桿菌)與溶菌酶一起溫育，就能得到易破碎的原生質(zhì)體，用EDTA與革蘭氏陰性菌(如大腸桿菌)一起溫育，也可制得相應(yīng)的原生質(zhì)體。幾丁質(zhì)酶和3－葡聚糖酶則常用于水解曲霉、面包霉等的細(xì)胞壁。(6)化學(xué)破碎法化學(xué)破碎法是應(yīng)用各種化學(xué)試劑與細(xì)胞膜作用，使細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)改變或破壞的方法。常用的化學(xué)試劑可分為有機(jī)溶劑和表面活性劑兩大類。①有機(jī)溶劑處理常用的有機(jī)溶劑有甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等。有機(jī)溶劑可使細(xì)胞膜的磷脂結(jié)構(gòu)破壞，從而改變細(xì)胞膜的透過性，再經(jīng)提取可使膜結(jié)合酶或胞內(nèi)酶等釋出胞外。例如，將細(xì)胞懸浮在10倍體積的預(yù)冷至－20℃的丙酮之中，攪拌均勻，待自然沉降后棄上清液，抽濾得細(xì)胞，再用2.5倍體積的－20℃丙酮洗滌，抽干后，把得到的細(xì)胞立即放入真空干燥器中，除去殘余的丙酮，得到細(xì)胞干粉，可長(zhǎng)期保存，使用時(shí)再用水或緩沖液把胞內(nèi)的酶提取出來。②表面活性劑處理表面活性劑可以和細(xì)胞膜中的磷脂及脂蛋白相互作用使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞，增加膜的透過性。

酶的提取酶的提取是指在一定條件下，用適當(dāng)?shù)娜軇┨幚砗冈?，使酶充分溶解到溶劑中的過程，也稱作酶的抽提。酶提取時(shí)首先應(yīng)根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)和溶解性質(zhì)，選擇適當(dāng)?shù)娜軇４蠖鄶?shù)酶能溶解于水，可用水或稀酸、稀堿、稀鹽溶液提??；有些酶與脂質(zhì)結(jié)合或含較多的非極性基團(tuán)，則可用有機(jī)溶劑提取。為了提高酶的提取率并防止酶的變性失活，在提取過程中，要注意控制好溫度、pH值等各種條件。破碎生物組織一般在適當(dāng)?shù)木彌_液中進(jìn)行。典型的抽提液由以下幾部分組成：抽提液＝離子強(qiáng)度調(diào)節(jié)劑十pH緩沖劑＋溫度效應(yīng)劑

(KCl、NaCl、蔗糖)(各種緩沖液)(甘油、二甲基亞砜)

＋蛋白酶抑制劑＋防氧化劑＋重金屬絡(luò)合劑＋增溶劑

(PM3F、DIFP)(DTT巰基乙醇)(EDTA、檸檬酸)(TritonX－100)根據(jù)酶提取時(shí)所采用的溶劑或溶液的不同，酶的提取方法主要有鹽溶液提取、酸溶液提取、堿溶液提取和有機(jī)溶劑提取等。(1)鹽溶液提取大多數(shù)酶溶于水，而且在一定濃度的鹽存在條件下，酶的溶解度增加，這稱之為鹽溶現(xiàn)象，然而酶濃度不能太高，否則溶解度反而降低，出現(xiàn)鹽析現(xiàn)象。所以一般采用稀鹽溶液進(jìn)行酶的提取，鹽濃度一般控制在0.02~0.5mol/L的范圍內(nèi)。例如，用固體發(fā)酵生產(chǎn)的麩曲中的α－淀粉酶、糖化酶、蛋白酶等胞外酶，用0.15mol/L的氯化鈉溶液或0.02~0.05mol/L的磷酸緩沖液提??；酵母醇脫氫酶用0.5~0.6mol/L的磷酸氫二鈉溶液提??；6－磷酸葡萄糖脫氫酶用0.1mol/L的碳酸鈉提?。嚎莶輻U菌堿性磷酸酶用0.1mol/L的氯化鎂提取等。有少數(shù)酶，如霉菌產(chǎn)生的脂肪酶，用清水提取比鹽溶液提取的效果較好。(2)酸溶液提取有些酶在酸性條件下溶解度較大且穩(wěn)定性較好宜用酸溶液提取。例如從胰臟中提取胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，采用0.12mol/L的硫酸溶液進(jìn)行提取。(3)堿溶液提取有些在堿性條件下溶解度較大且穩(wěn)定性較好的酶，應(yīng)采用堿溶液提取。例如，細(xì)菌L－天門冬酰胺酶的提取是將含酶菌體懸浮在pH11~12.5的堿溶液中，振蕩20min，即達(dá)到顯著的提取效果。(4)有機(jī)溶劑提取有些與脂質(zhì)結(jié)合比較牢固或分子中含非極性基團(tuán)較多的酶，不溶或難溶于水、稀酸、稀堿和稀鹽溶液中，需用有機(jī)溶劑提取。常用的有機(jī)溶劑是與水能夠混溶的乙醇、丙酮、丁醇等。其中丁醇對(duì)脂蛋白的解離能力較強(qiáng)，提取效果較好，已成功地用于琥珀酸脫氫酶、細(xì)胞色素氧化酶、膽堿酯酶等的提取。

離心分離離心是借助于離心機(jī)旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，使不同大小和不同密度的物質(zhì)分離的技術(shù)，在酶的提取和分離純化過程中，細(xì)胞的收集、細(xì)胞碎片和沉淀的分離以及酶的純化等往往要使用離心分離。在離心分離時(shí)，要根據(jù)欲分離物質(zhì)以及雜質(zhì)的大小、密度和特性的不同，選擇適當(dāng)?shù)碾x心機(jī)、離心方法和離心條件。離心機(jī)多種多樣，按照離心機(jī)的最大轉(zhuǎn)速的不同可以分為常速(低速)、高速和超速三種。常速離心機(jī)的最大轉(zhuǎn)速在8000r/min以內(nèi)，相對(duì)離心力(RCF)在1×104g以內(nèi)，在酶的分離純化過程中，主要用于細(xì)胞、細(xì)胞碎片和培養(yǎng)基殘?jiān)裙绦挝锏姆蛛x。高速離心機(jī)的最大轉(zhuǎn)速為1×104~2.5×104r/min，相對(duì)離心力達(dá)到1×104g~1×105g，在酶的分離中主要用于沉淀、細(xì)胞碎片和細(xì)胞器等的分離。超速離心機(jī)的最大轉(zhuǎn)速達(dá)2.5×104~8×104r/min，相對(duì)離心力可以高達(dá)5×105g。超速離心可以采用差速離心、密度梯度離心或等密梯度離心等方法。超速離心可用于酶分子的分離純化。在離心過程中，應(yīng)該根據(jù)需要，選擇好離心力(或離心速度)和離心時(shí)間，并且控制好溫度和pH值等條件。2.3.3酶的純化抽提的酶液是否需要進(jìn)一步經(jīng)過純化，要視其應(yīng)用部門的要求。一般工業(yè)的酶，如紡織工業(yè)應(yīng)用α－淀粉酶脫膠處理，往往采用液體粗酶便可；皮革工業(yè)應(yīng)用的細(xì)菌蛋白酶也是如此。食品工業(yè)應(yīng)用的酶如果粗酶液已達(dá)到食品級(jí)標(biāo)準(zhǔn)要求，特別是衛(wèi)生指標(biāo)，也無需進(jìn)一步純化。然而，應(yīng)用于醫(yī)藥、化學(xué)試劑級(jí)的酶液必須進(jìn)一步純化。在濃縮液或發(fā)酵液中，除含有我們需要的酶以外，還不可避免地存在著其他大分子物質(zhì)和小分子物質(zhì)。其中小分子物質(zhì)在以后的純化步驟中會(huì)自然而然的除去。大分子物質(zhì)中包括核酸、粘多糖及其他蛋白質(zhì)等。因此，酶的分離純化工作主要是，將酶從雜蛋白中分離出來或者將雜蛋白從酶溶液中除去?，F(xiàn)有酶的分離純化方法都是依據(jù)酶和雜蛋白在性質(zhì)上的差異而建立的。酶和雜蛋白的性質(zhì)差異大體有以下幾個(gè)方面，它們的分離方法根據(jù)這個(gè)基礎(chǔ)分為：(1)根據(jù)分子大小而設(shè)計(jì)的方法。如離心分離法、篩膜分離法、凝膠過濾法等。(2)根據(jù)溶解度大小分離的方法、如鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法、共沉淀法、選擇性沉淀法、等電點(diǎn)沉淀法等。(3)按分子所帶正負(fù)電荷多少分離的方法，如離子交換分離法、電泳分離法、聚焦層析法等。(4)按穩(wěn)定性差異建立的分離方法，如選擇性熱變性法、選擇性酸堿變性法、選擇性表面變性法等。(5)按親和作用的差異建立的分離方法，如親和層析法、親和電泳法等。酶的純化方法：重要有機(jī)溶劑沉淀法利用和水互溶的有機(jī)溶劑使酶沉淀的方法很早就用來純化酶。在工業(yè)上也很重要，例如血漿蛋白質(zhì)的分離純化，至今仍采用本法。由于本法的機(jī)理和鹽析法不同，可作為鹽析法的補(bǔ)充。加入有機(jī)溶劑于酶溶液中產(chǎn)生多種效應(yīng)，這些效應(yīng)結(jié)合起來，使酶沉淀。其中主要效應(yīng)是水的活度的降低。當(dāng)有機(jī)溶劑濃度增大時(shí)，水對(duì)酶分子表面上荷電基團(tuán)或親水基團(tuán)的水化程度降低，或者說溶劑的介電常數(shù)降低，因而靜電吸力增大。在憎水區(qū)域附近有序排列的水分子可以為有機(jī)溶劑所取代，使這些區(qū)域的溶解性增大。但除了憎水性特別強(qiáng)的酶外，對(duì)多數(shù)酶來說，后者影響較小，所以總的效果是導(dǎo)致酶分子聚集而沉淀。

有機(jī)溶劑沉淀法的優(yōu)點(diǎn)是溶劑容易蒸發(fā)除去，不會(huì)殘留在成品中，因此適用于制備食品級(jí)酶。而且有機(jī)溶劑密度低，與沉淀物密度差大，便于離心分離。有機(jī)溶劑沉淀法的缺點(diǎn)是，容易使酶變性失活，且有機(jī)溶劑易燃、易爆、安全要求較高。凝膠過濾(gelfiltrationchromatography)凝膠過濾有多種名稱，又稱凝膠排阻層析、分子篩層析法、凝膠層析法等。是根據(jù)溶質(zhì)分子的大小進(jìn)行分離的方法。它具有一系列的優(yōu)點(diǎn)：操作方便，不會(huì)使物質(zhì)變性，層析介質(zhì)不需再生，可反復(fù)使用等；因而在酶純化中占有重要位置。由于凝膠層析劑的容量比較低，所以在生物大分子物質(zhì)的分離純化中，一般不作為第一步的分離方法，而往往在最后的處理中被使用。它的應(yīng)用主要包括脫鹽，生物大分子按分子大小分級(jí)分離以及分子量測(cè)定等。(1)基本原理在顯微鏡下，可觀察到凝膠過濾層析介質(zhì)具有海綿狀結(jié)構(gòu)。將凝膠裝于層析柱中，加入混合液，內(nèi)含不同分子量的物質(zhì)，小分子溶質(zhì)能在凝膠海綿狀網(wǎng)格內(nèi)，即凝膠內(nèi)部空間全都能為小分子溶質(zhì)所達(dá)到，凝膠內(nèi)外小分子溶質(zhì)濃度一致。在向下移動(dòng)的過程中，它從一個(gè)凝膠顆粒內(nèi)部擴(kuò)散到膠?？紫逗笤龠M(jìn)入另一凝膠顆粒，如此不斷地進(jìn)人與流出，使流程增長(zhǎng)，移動(dòng)速率慢故最后流出層析柱。而中等大小的分子，它們也能在凝膠顆粒內(nèi)外分布，部分送入凝膠顆粒，從而在大分子與小分子物質(zhì)之間被洗脫。大分子溶質(zhì)不能透人凝膠內(nèi)，而只能沿著凝膠顆粒間隙流運(yùn)動(dòng)，因此流程短，下移速度較小分子溶質(zhì)快而首先流出層析柱。因而樣品通過定距離的層析柱后，不同大小的分子將按先后順序依次流出，彼此分開。圖2－4凝膠過濾層析的原理a.小分子由于擴(kuò)散作用進(jìn)入凝膠內(nèi)部被截留；大分子被排阻在顆粒外，在顆粒間迅速通過。b.1.蛋白質(zhì)混合物上柱，2.洗脫開始，小分子擴(kuò)散進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)大分子被排阻在顆粒外，3.小分子被截留，大分子向下移動(dòng)，大小分子分開，4.大小分子完全分開，5.大分子行程較短，已洗脫出層析柱，小分子尚在行進(jìn)中。(2)凝膠種類①葡聚糖凝膠是分子量幾萬到幾十萬的葡聚糖凝膠通過環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)而成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物質(zhì)，可分離分子量從l000~500000的分子。其商品名是SephadexG，有各種型號(hào)(表2－3)，G后的數(shù)字表示每g干膠吸水量(即吸水值)的10倍。其特性如表2－3所示，另外還有一種為Sephacryl－S，通過N，N－甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)的烯丙基葡聚糖，可適用于水、有機(jī)溶劑及高濃度解離試劑存在的系統(tǒng)。另一類Sephadex－LH，適用于脂類化合物的分離。葡聚糖凝膠在干燥狀態(tài)是堅(jiān)硬的白色粉末，不溶于水和鹽類溶液。因具有大量的羥基，故有很大的親水性，在水中即顯膨脹，吸水后機(jī)械強(qiáng)度大大降低。它對(duì)堿和弱酸(pH2~12)穩(wěn)定。在強(qiáng)酸溶液中，特別是在高溫度下，糖苷鍵會(huì)水解。在中性下，可在120℃加壓消毒保存。和氧化劑接觸會(huì)分解。長(zhǎng)久不用時(shí)，有時(shí)會(huì)長(zhǎng)霉，應(yīng)加防腐劑。②聚丙烯酰胺凝膠是以丙烯酰胺為單體，通過N，N－甲叉雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑共聚而成的凝膠物質(zhì)。商品名是Bio－GelP，有各種型號(hào)，P－后的數(shù)字乘以1000表示其分離的最大分子量(即排阻分子量)。③瓊脂糖凝膠瓊脂糖是瓊脂抽去瓊脂膠等之后所得D－半乳糖和3，6－脫水半乳糖，自動(dòng)締合而成的網(wǎng)眼結(jié)構(gòu)物質(zhì)，孔徑大小由膠的濃度決定。以商品Sepharose為例，有2B、4B和6B等規(guī)格，B前面數(shù)字表示膠百分濃度。這類凝膠孔徑都比較大，適于分離較大的物質(zhì)，如病毒、細(xì)胞顆粒和DNA等。其他純化方法親和層析法利用生物體內(nèi)存在的特異性相互作用分子對(duì)而設(shè)計(jì)的層析方法染料層析法具有親和配基的染料可以吸附酶，由于配基的結(jié)構(gòu)類似某些酶的底物。疏水層析將疏水性基團(tuán)如丁烷、辛烷、苯固定化到介質(zhì)上，這些基團(tuán)會(huì)與蛋白質(zhì)生物大分子上的疏水區(qū)親和。電泳靠溶質(zhì)在電場(chǎng)移動(dòng)中移動(dòng)速度不同而分離的方法。2.4酶分離、純化的評(píng)價(jià)酶經(jīng)分離、純化后要確定該純化步驟是否適宜，必須經(jīng)過對(duì)有關(guān)參數(shù)的測(cè)定及計(jì)算才能確定。酶的產(chǎn)量是以活力單位表示，因此在整個(gè)分離過程中每一步始終貫穿比活力和總活力的檢測(cè)、比較?；靖拍?酶活力(Enzymeactivity)：酶活力是指酶催化反應(yīng)的能力，它表示樣品中酶的含量。1961年國(guó)際酶學(xué)會(huì)規(guī)定，lmin催化lμmol分子底物轉(zhuǎn)化的酶量為該酶的一個(gè)活力單位(國(guó)際單位)，溫度為25℃，其它條件(pH、離子強(qiáng)度)采用最適條件。重要酶的總活力為樣品的全部酶活力?？偦盍?酶活力×總體積(mL)

或=酶活力×總質(zhì)量(g)比活力(Specificactivity)：比活力是指單位蛋白質(zhì)(毫克蛋白質(zhì)或毫克蛋白氮)所含有的酶活力(單位/毫克蛋白)。比活力是酶純度指標(biāo)，比活力愈高表示酶愈純，即表示單位蛋白質(zhì)中酶催化反應(yīng)的能力愈大。但是，比活力仍然是個(gè)相對(duì)酶純度指標(biāo)。要了解酶的實(shí)際純度，尚需采用電泳等測(cè)定方法。

回收率(Yieldpercent)：回收率是指提純前與提純后酶的總活力之比。它表示提純過程中酶的損失程度，回收率愈高，其損失愈少。提純倍數(shù)：提純倍數(shù)是指提純前后兩者比活力之比。它表示提純過程中酶純度提高的程度，提純倍數(shù)愈大，提純效果愈佳。酶純化評(píng)價(jià)實(shí)例2.5酶的劑型與保存酶制劑通常有下列四種劑型：液體酶制劑固體粗酶制劑純酶制劑固定化酶制劑（見書中第五章）2.5.1液體酶制劑包括稀酶液和濃縮酶液。一般除去固體雜質(zhì)后，不再純化而直接制成，或加以濃縮而成，一般需要加穩(wěn)定劑。這種酶制劑不穩(wěn)定，且成分復(fù)雜，只用于某些工業(yè)生產(chǎn)。2.5.2固體粗酶制劑發(fā)酵液經(jīng)殺菌后直接濃縮或噴霧干燥制成。有的加入淀粉等填充料，用于工業(yè)生產(chǎn)。有的經(jīng)初步純化后制成，如用于洗滌劑、藥物生產(chǎn)。用于加工或生產(chǎn)某種產(chǎn)品時(shí)，務(wù)須除去起干擾作用的雜酶，才不會(huì)影響質(zhì)量。固體酶制劑適于運(yùn)輸和短期保存，成本也不高。2.5.3純酶制劑包括結(jié)晶酶，通常用作分析試劑和醫(yī)療藥物。要求較高的純度和一定的活力單位數(shù)。用作分析工具酶時(shí)，除了要求沒有干擾作用的雜酶存在外，還要求單位質(zhì)量的酶制劑中酶活力達(dá)到一定的單位數(shù)。用作基因工程的工具酶要求不含非專一性的核酸酶，或完全不含核酸酶，酶的保存方法(1)溫度。(2)pH與緩沖液。(5)為提高酶穩(wěn)定性，常加入下列穩(wěn)定劑：①底物、抑制劑和輔酶，它們的作用可能是通過降低局部的能級(jí)水平，使酶蛋白處于不穩(wěn)定狀態(tài)的扭曲部分轉(zhuǎn)入穩(wěn)定狀態(tài)。②對(duì)巰基酶，可加入－SH保護(hù)劑。如二巰基乙醇、GSH(谷胱甘肽)、DTT(二硫蘇糖醇)等。③其他如Ca2+能保護(hù)α－淀粉酶，Mn2+能穩(wěn)定溶菌酶，Cl－能穩(wěn)定透明質(zhì)酸酶。(3)酶蛋白濃度。(4)氧?；靖拍?酶分子修飾：通過各種方法使酶分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的某些特性和功能的技術(shù)過程。如金屬離子交換法、大分子修飾法例如，Bender和Kosland成功地利用化學(xué)修飾法將枯草桿菌蛋白酶活性中心的絲氨酸轉(zhuǎn)換為半胱氨酸，修飾后，該酶失去對(duì)蛋白質(zhì)和多肽的水解能力，卻出現(xiàn)了催化硝基苯酯等底物水解的活性。重要酶分子的修飾方法化學(xué)法又可分為：金屬離子置換法、大分子修飾法、肽鏈有限水解法、蛋白側(cè)鏈基團(tuán)的小分子修飾法等。生物法是通過基因工程的手段改變蛋白質(zhì)，即基于核酸水平對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行改造，利用基因操作技術(shù)對(duì)DNA或mRNA進(jìn)行改造和修飾以期獲得化學(xué)結(jié)構(gòu)更為合理的蛋白質(zhì)。物理修飾法的特點(diǎn)是不改變酶的組成和基團(tuán)，酶分子的共價(jià)鍵不發(fā)生變化。重要酶原：酶是在活細(xì)胞中合成的，但不是所有新合成的酶都具有催化活力，這種新合成酶的前體(無催化活力)稱為酶原(Proenzyme)。就生命現(xiàn)象而言，酶原是酶結(jié)構(gòu)一種潛在的存在形式，如果沒有這種形式，生命就會(huì)停止。例如，哺乳動(dòng)物的胰臟分泌到消化系繞中的胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原，每種酶原都是由二硫鍵交聯(lián)的單一多肽鏈組成，它們?cè)诘竭_(dá)十二指腸以前，一直是十分穩(wěn)定的，而到達(dá)十二指腸后則被另一種蛋白質(zhì)水解酶所活化，這種活化過程是從無活力酶原轉(zhuǎn)變成有活力酶的過程。該種酶原往往由該種酶所激活，稱為酶原的自我激活。重要酶的多形性與同工酶1975年H.Harris提出酶的多形性概念，認(rèn)為很多酶可催化相同的反應(yīng)，但其結(jié)構(gòu)和物理化學(xué)性質(zhì)有所不同，這種現(xiàn)象稱為酶的多形性。根據(jù)其來源可分為異源同工酶和同工酶(Isoenzyme)，前者是不同來源的同工酶.重要例如，酵母菌中醇脫氫酶和動(dòng)物肝臟中的醇脫氫酶，而后者是指來自同一生物體同一生活細(xì)胞的酶，能催化同一反應(yīng)，但由于結(jié)構(gòu)基因不同，因而酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)、物理化學(xué)性質(zhì)以及其它性質(zhì)有所差別，稱為同工酶。測(cè)定同工酶最常用的方法是電泳法，此法對(duì)樣品純度要求不嚴(yán)格，分辨力強(qiáng)，而且簡(jiǎn)便快速。例如乳酸脫氫酶有5種同工酶：LDH1、LDH2、LDH3、LDH4和LDH5，天冬氨酸激酶(AK)有三種同工酶：AK1、AK2、AK3，磷酸葡萄糖變位酶有50種以上的同工酶。

酶催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

酶催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)也稱酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)（kineticsofenzyme-catalyzedreactions），是研究酶促反應(yīng)速度以及影響此速度的各種因素的科學(xué)。在研究酶的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系以及酶的作用機(jī)制時(shí)，需要酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)提供相關(guān)的實(shí)驗(yàn)證據(jù)；為了找到最有利的反應(yīng)條件從而提高酶催化反應(yīng)的效率以及了解酶在代謝過程中的作用和某些藥物的作用機(jī)制等，也需要我們掌握酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的相關(guān)規(guī)律。因此，對(duì)于酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的研究既有重要的理論意義又具有相當(dāng)?shù)膶?shí)踐價(jià)值。酶的動(dòng)力學(xué)研究包括哪些內(nèi)容?酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)以化學(xué)動(dòng)力學(xué)為基礎(chǔ)，通過對(duì)酶促反應(yīng)速度的測(cè)定來討論諸如底物濃度、抑制劑、溫度、pH和激活劑等因素對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響。重要溫度、pH及激活劑都會(huì)對(duì)酶促反應(yīng)速度產(chǎn)生十分重要的影響，酶促反應(yīng)不但需要最適溫度和最適pH，還要選擇合適的激活劑。而且在研究酶促反應(yīng)速度以及測(cè)定酶的活力時(shí)，都應(yīng)選擇相關(guān)酶的最適反應(yīng)條件。3.1酶催化反應(yīng)速度如果我們以產(chǎn)物生成量(或底物減少量)來對(duì)反應(yīng)時(shí)間作圖，便可以得到如圖3-1所示的曲線圖。圖3-1酶促反應(yīng)的速度曲線該曲線的斜率表示單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物生成量的變化，因此曲線上任何一點(diǎn)的斜率就是相應(yīng)橫坐標(biāo)上時(shí)間點(diǎn)的反應(yīng)速度。從圖中的曲線可以看出在反應(yīng)開始的一段時(shí)間內(nèi)斜率幾乎不變，然而隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，曲線逐漸變平坦，相應(yīng)的斜率也漸漸減小，反應(yīng)速度逐漸降低，顯然這時(shí)測(cè)得的反應(yīng)速度不能代表真實(shí)的酶活力。引起酶促反應(yīng)速度隨反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)而降低的原因很多，如底物濃度的降低、產(chǎn)物濃度增加從而加速了逆反應(yīng)的進(jìn)行、產(chǎn)物對(duì)酶的抑制或激活作用以及隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)引起酶本身部分分子失活等等。因此在測(cè)定酶活力時(shí)，應(yīng)測(cè)定酶促反應(yīng)的初速度，從而避免上述各種復(fù)雜因素對(duì)反應(yīng)速度的影響。由于反應(yīng)初速度與酶量呈線性關(guān)系，因此可以用測(cè)定反應(yīng)初速度的方法來測(cè)定相關(guān)制劑中酶的含量。酶活力測(cè)定時(shí)需注意：1選擇反應(yīng)的最適溫度，根據(jù)不同的底物和緩沖液選擇反應(yīng)的最適pH。2速度要快，取反應(yīng)的初速度3底物濃度要足夠大（一般在10Km以上）使酶被底物飽和，以充分反應(yīng)待測(cè)酶的活力測(cè)定酶活力的基本原理酶蛋白的含量很低，很難直接測(cè)定其蛋白質(zhì)的含量，且常與其他各種蛋白質(zhì)混合存在，將其提純耗時(shí)費(fèi)力。故不能直接用重量或體積等指標(biāo)來衡量。測(cè)定產(chǎn)物增加量測(cè)定底物減少量測(cè)定酶活力常用的方法：分光光度法（spectrophotometry）熒光法（fluorometry）同位素法（isotopemethod）電化學(xué)方法（electrochemicalmethod）其他方法：如旋光法、量氣法、量熱法和層析法等3.2底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響中間絡(luò)合物學(xué)說中間絡(luò)合物學(xué)說也稱酶底物中間絡(luò)合物學(xué)說，最早是由Henri和Wurtz兩位科學(xué)家提出的。在1903年，Henri在用蔗糖酶水解蔗糖實(shí)驗(yàn)研究化學(xué)反應(yīng)中底物濃度與反應(yīng)速度的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)酶濃度不變時(shí)，可以測(cè)出一系列不同底物濃度下的化學(xué)反應(yīng)速度，以該反應(yīng)速度對(duì)底物濃度作圖，可得到如圖3-2所示的曲線。

圖3-2底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響從該曲線圖可以看出，當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時(shí)，反應(yīng)速度與底物濃度的關(guān)系呈正比關(guān)系，反應(yīng)表現(xiàn)為一級(jí)反應(yīng)。然而隨著底物濃度的不斷增加，反應(yīng)速度不再按正比升高，此時(shí)反應(yīng)表現(xiàn)為混合級(jí)反應(yīng)。當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到相當(dāng)高時(shí)，底物濃度對(duì)反應(yīng)速度影響逐漸變小，最后反應(yīng)速度幾乎與底物濃度無關(guān)，這時(shí)反應(yīng)達(dá)到最大反應(yīng)速度（Vmax），反應(yīng)表現(xiàn)為零級(jí)反應(yīng)。根據(jù)這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果，Henri和Wurtz提出了酶促化學(xué)反應(yīng)的酶底物中間絡(luò)合物學(xué)說。該學(xué)說認(rèn)為：當(dāng)酶催化某一化學(xué)反應(yīng)時(shí)，酶(E)首先需要和底物(S)結(jié)合生成酶底物中間絡(luò)合物即中間復(fù)合物(ES)，然后再生成產(chǎn)物(P)，同時(shí)釋放出酶。該學(xué)說可以用下面的化學(xué)反應(yīng)方程式來表示：

S+EES→P+E我們根據(jù)中間絡(luò)合物學(xué)說很容易解釋圖3-2所示的實(shí)驗(yàn)曲線，在酶濃度恒定這一前提條件下，當(dāng)?shù)孜餄舛群苄r(shí)酶還未被底物所飽和，這時(shí)反應(yīng)速度取決于底物濃度并與之成正比。隨著底物濃度不斷增大，根據(jù)質(zhì)量作用定律，中間復(fù)合物ES生成也不斷增多，而反應(yīng)速度取決于ES的濃度，故反應(yīng)速度也隨之增高但此時(shí)二者不再成正比關(guān)系。當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到相當(dāng)高的程度時(shí)，溶液中的酶已經(jīng)全部被底物所飽和，此時(shí)溶液中再也沒有多余的酶，雖增加底物濃度也不會(huì)有更多的中間復(fù)合物ES生成，因此酶促反應(yīng)速度變得與底物濃度無關(guān)，而且反應(yīng)達(dá)到最大反應(yīng)速度（Vmax）。當(dāng)我們以底物濃度[S]對(duì)反應(yīng)速度v作圖時(shí)，就形成一條雙曲線。在此需要特別指出的是，只有酶促催化反應(yīng)才會(huì)有這種飽和現(xiàn)象，而與此相反，非催化反應(yīng)則不會(huì)出現(xiàn)這種飽和現(xiàn)象。酶促反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)方程式（米氏方程）1913年Michaelis和Menten兩位科學(xué)家在前人工作的基礎(chǔ)上，根據(jù)酶促反應(yīng)的中間絡(luò)合物學(xué)說，推導(dǎo)出一個(gè)數(shù)學(xué)方程式，用來表示底物濃度與酶反應(yīng)速度之間的量化關(guān)系，通常把這個(gè)數(shù)學(xué)方程式稱為米氏方程：其中Km稱為米氏常數(shù)米氏常數(shù)的含義Km值就代表著反應(yīng)速度達(dá)到最大反應(yīng)速度一半時(shí)的底物濃度。米氏常數(shù)的應(yīng)用價(jià)值Km是酶的一個(gè)特征性常數(shù)：也就是說Km的大小只與酶本身的性質(zhì)有關(guān)，而與酶濃度無關(guān)。Km值還可以用于判斷酶的專一性和天然底物，Km值最小的底物往往被稱為該酶的最適底物或天然底物。Km可以作為酶和底物結(jié)合緊密程度的—個(gè)度量指標(biāo)，用來表示酶與底物結(jié)合的親和力大小。已知某個(gè)酶的Km值，就可以計(jì)算出在某一底物濃度條件下，其反應(yīng)速度相當(dāng)于Vmax的百分比。

Km值還可以幫助我們推斷具體條件下某一代謝反應(yīng)的方向和途徑，只有Km值小的酶促反應(yīng)才會(huì)在競(jìng)爭(zhēng)中占優(yōu)勢(shì)。3.3抑制劑對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響由于酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，凡可使酶蛋白變性而引起酶活力喪失的作用都稱為失活作用(inactivation)。如果由于酶必需基團(tuán)的化學(xué)性質(zhì)發(fā)生改變，但酶并未發(fā)生變性，而引起酶活力降低或喪失的作用則稱為抑制作用(inhibition)。導(dǎo)致酶發(fā)生抑制作用的物質(zhì)稱為抑制劑(inhibitor)。由于抑制作用與變性作用從本質(zhì)而言是不同的，因此與變性劑對(duì)酶的變性作用無選擇性不同的是，抑制劑對(duì)酶的抑制作用是有選擇性的，即一種抑制劑只能使某一種酶或?qū)δ骋活惷府a(chǎn)生抑制作用。對(duì)酶抑制作用的探討是研究酶的結(jié)構(gòu)與功能、酶的催化機(jī)制以及闡明機(jī)體代謝途徑的基本手段，也可以為醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)中設(shè)計(jì)新藥物和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中設(shè)計(jì)新農(nóng)藥提供重要的理論依據(jù)，從這個(gè)角度而言，對(duì)酶抑制作用的研究不僅具有重要的理論意義，而且具有突出的實(shí)踐價(jià)值。3.3.1抑制作用的類型根據(jù)抑制劑與酶的作用方式的區(qū)別以及抑制作用是否可逆，我們可以將抑制作用分為兩大類，即：不可逆的抑制作用可逆的抑制作用。

不可逆的抑制作用由于抑制劑與酶的必需基團(tuán)以共價(jià)鍵的形式結(jié)合而引起酶活力降低或喪失，因此不能用透析、超濾等物理方法去除抑制劑而使酶復(fù)活，這種抑制作用是不可逆的，我們稱之為不可逆抑制。此時(shí)被抑制的酶分子受到抑制劑對(duì)其不同程度的化學(xué)修飾，因此不可逆抑制從本質(zhì)上來說就是酶的修飾抑制。不