第章免疫學(xué)檢驗

11三月2024第章免疫學(xué)檢驗第二節(jié)酶免疫檢測技術(shù)1掌握酶免疫技術(shù)的基本原理32熟悉均相酶免疫測定的類型及原理掌握ELISA的原理及常用方法的類型與原理熟悉酶免疫技術(shù)檢測的判定4第二節(jié)酶免疫檢測技術(shù)5了解酶免疫技術(shù)常用酶及底物6了解酶免疫測定的應(yīng)用酶免疫檢測技術(shù)以酶標記的抗體（抗原）作為主要試劑，將抗原抗體反應(yīng)的特異性和酶的高效催化反應(yīng)的專一性相結(jié)合的一種免疫檢測技術(shù)

一酶免疫檢測技術(shù)（EIA）定義能定性、定位、定量酶標記抗體或抗原，和待檢的抗原或抗體的免疫學(xué)進行特異性反應(yīng),形成酶標物的復(fù)合物，使底物基質(zhì)水解而呈色，根據(jù)呈色反應(yīng)對待檢的抗原抗體作出定性定量。很少量的酶即可導(dǎo)致大量的催化過程，所以極為敏感。二酶免疫技術(shù)的基本原理Ag

-Ab-E(Ag-E-Ab)

S顯色反應(yīng)Ag(Ab)定性、定量、定位分析酶免疫基本原理Ab-E(Ag-E)

+

Ag(Ab)靈敏度高、特異性強、準確性好酶標記試劑能夠較長時間保持穩(wěn)定操作簡便、對環(huán)境沒有污染。易與其它技術(shù)偶聯(lián)衍生出適用范圍更廣的新方法。三酶免疫技術(shù)的特點

（一）酶的要求1、酶活性要非常高；2、易標記具有抗原、抗體共價結(jié)合的基團；3、標記后不影響酶活性及抗原抗體反應(yīng)性；4、酶活性不受樣品中其他成分的影響（用于均相測定的酶標抗原與抗體結(jié)合后酶活性出現(xiàn)抑制或激活）；

四常用的酶及其底物5、產(chǎn)物易判定或測定6、不能對環(huán)境和人污染7、穩(wěn)定，價廉、易得。（二）常用的酶

1、辣根過氧化物酶（HRP）活力高、穩(wěn)定

HRP在蔬菜作物辣根中含量很高，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結(jié)合而成。HRP的純度用RZ表示，是403nm的吸光度與280nm吸光度之比，高純度的HRP的RZ≥3.0。酶活力以單位表示：1min將1μmol的底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的酶量為1個單位。2、堿性磷酸酶AP敏感性強穩(wěn)定性差價格高3、β-Gal4、脲酶5、葡萄糖氧化酶（三）常用的底物

1、HRP的底物：四甲基聯(lián)苯胺TMB藍色鄰苯二胺OPD黃色ABTS藍綠色

2、AP的底物對硝基苯磷酸鹽p-NPP黃色3、β-Gal底物甲基傘酮基-β-D-半乳糖苷（4-MUG）均相酶免疫測定定義通過化學(xué)反應(yīng)或免疫學(xué)反應(yīng)，讓酶與抗體或抗原形成的結(jié)合物

作用：一是便于觀察反應(yīng)結(jié)果，二是提高測定的敏感性。五酶標記抗體或抗原1、酶標記物（酶結(jié)合物）酶標記物要求：

既保有酶的催化活性；也保持了抗體（或抗原）的免疫活性；結(jié)合物尚要有良好的穩(wěn)定性。

抗原要求純度高；完全抗原抗體需要特異性好；效價高；親合力強以及比活性較高；能批量生產(chǎn)；易純化。

2、抗原和抗體以及制備方法要求單克隆抗體純化的Ig抗體Fab技術(shù)方法簡單；產(chǎn)率高；重復(fù)性好；標記反應(yīng)不影響酶和抗原或抗體的活性；酶標記物穩(wěn)定；不形成聚合物；

過碘酸鈉法--直接法常只用于HRP標記抗體或抗原原理：酶上的醛基和抗體上的氨基形SCHIFF堿鍵。3、制備方法戊二醛（GA）交聯(lián)法（間接法）原理：戊二醛交聯(lián)法戊二醛是一種雙功能團試劑。戊二醛的兩個醛基分別和酶和抗體分子中的游離的氨基和酚基以共價鍵形式結(jié)合，形成SCHIFF鍵，將酶間接連在抗體分子上進行標記。

優(yōu)點：標記率高；標記簡單酶利用率高；標記抗體分子質(zhì)量小染色效應(yīng)好穿透能力強產(chǎn)率高抗體活性丟失少酶活丟失少

重復(fù)性好

缺點：標記方法復(fù)雜酶利用率低穿透細胞能力一般產(chǎn)率低抗體活性丟失較多酶活力丟失較多直接法間接法原因：酶標記溶液中含有游離的酶和酶-酶聚合物。方法：50%飽和硫酸銨沉淀，再透析凝膠過濾。4、酶標抗體結(jié)合物的純化酶標抗體的活性酶的活性酶標物中的酶量和抗體量5、酶標抗體的鑒定加甘油低溫保存5、酶標抗體結(jié)合物的保存固相抗體或抗原是非均相酶免技術(shù)中將游離和結(jié)合的酶標記物迅速分離的最常用方法固相抗體或抗原就是把抗體或抗原結(jié)合到固相載體的表面六固相載體結(jié)合抗體或抗原的容量大結(jié)合物相當(dāng)廣泛（親和素生物素抗原抗體）抗體或抗原牢固地固定在其表面，相當(dāng)穩(wěn)定不影響免疫反應(yīng)性利于反應(yīng)充分進行固相方法簡便易行，快速經(jīng)濟1、固相載體要求2、固相載體種類塑料制品聚苯乙烯微顆粒磁珠膜載體硝酸纖維膜NC包被：將抗原或抗體結(jié)合于固相載體條件PH9.6t=37度T=4小時；t=4度過夜抗原和抗體的濃度

3、包被與封閉封閉：用1%～5%的牛血清白蛋白或5%～20%小牛血清將未被抗原抗體完全覆蓋的固相載體表面徹底包被，避免載體表面對其后加入的酶標抗體或抗原產(chǎn)生非特異性吸附，而產(chǎn)生假陽性顯色。原因：有些沒有包被，露出的聚苯乙烯，非特異性反應(yīng)，本底增高。七酶免疫技術(shù)類別（1）酶免疫組化(IEH)定義：酶標記已知的抗體或者抗原，然后用酶標志的抗原或抗體與組織切片中的抗體或抗原發(fā)生反應(yīng)，最后與酶底物作用發(fā)生顯色反應(yīng)，觀察出標本中的抗原或者抗體的位置和性質(zhì)，并可通過圖像來分析進行定量。1、根據(jù)應(yīng)用目的優(yōu)勢：能克服熒光抗體染色標本不能長期保存，對組織細胞的細微結(jié)構(gòu)分辨不清缺陷，且敏感性更高，對石蠟切片標本尤為適用，酶顯色產(chǎn)物具有較高的電子密度，可用電鏡觀察。步驟：（1）標本的固定與保存：固定使細胞內(nèi)蛋白凝固，終止胞內(nèi)酶活化，防止細胞自溶，保存抗原性。固定劑：乙醇、丙酮、戊二醛等（2）酶消化：打開固定過程中由于醛鍵形成而被封閉的抗原決定簇（胃蛋白酶等）3免疫染色標記抗體與標本中抗原反應(yīng)形成復(fù)合物，洗去未結(jié)合成分，直接鏡檢。4、對照試驗（control）：Positive：已知抗原陽性的切片Negative：不含已知抗原的切片空白對照：排除組織自發(fā)熒光、內(nèi)源性酶、生物素等

5結(jié)果觀察染色特異性染色非特異性染色顯色部位特定細胞或間質(zhì)細胞或間質(zhì)均勻染色或更強顯色定位特定，有結(jié)構(gòu)性無特定部位，無結(jié)構(gòu)性顯色程度同一部位呈不同無分布規(guī)律，某一程度顯色片均勻著色（2）酶免疫測定(EIA)用酶標記抗原或抗體做標記物，檢測液體樣品中可溶性抗原或抗體含量的微量分析技術(shù)。（1）均相酶免疫測定(HEI)定義：抗原和抗體反應(yīng)后不分離游離的酶標物體和酶標物的復(fù)合物，直接進行測定計算的方法。應(yīng)用：測定小分子激素和半抗原（如藥物）2、根據(jù)抗原抗體反應(yīng)后是否需將酶標物的結(jié)合物和游離的酶標記物分離基本原理（競爭性）酶標記物抗原（抗體）和待檢的抗原（抗體）與競爭性地相應(yīng)的抗原（抗體）結(jié)合后，形成了抗原抗體復(fù)合物、酶標物的結(jié)合物、游離的酶標物三種物質(zhì)。由于形成酶標物的結(jié)合物，酶的活性受到影響，標記酶的活性會發(fā)生改變，不用分離結(jié)合和游離酶標記物，通過測定標記酶的活性的改變，而確定抗原或抗體的含量。酶活性減弱或增強+Ag-EAg-E-Ab+Ag-AbAg-E

+

Ag

+

Ab（限量）競爭酶活性↓或↑，測定總酶活性換算可得的含量AgHEI基本原理：核心競爭性結(jié)合影響酶的活性（A）酶放大免疫測定技術(shù)EMIT定義：半抗原與酶結(jié)合成酶標半抗元，保留半抗原和酶的活力。當(dāng)酶標抗原和抗體結(jié)合后，所標記的酶和抗體密切接觸，由于空間阻止酶的活力中心受到影響，而活性被抑制。模式1

EMIT1.Ag－E—Ab:酶活性↓（∵Ab的空間位阻，影響酶活性中心）2.游離酶(Ag-E)有酶活性基本原理是半抗原與酶結(jié)合成酶標半抗原，保留半抗原和酶的活性。當(dāng)酶標半抗原與抗體結(jié)合后，所標的酶與抗體密切接觸，使酶的活性中心受影響而活性被抑制。ES?E半抗原EMIT原理示意圖：ESSEMIT

基本原理:＋

Ag競爭

Ab（限量）Ag-E正當(dāng)Ag多時Ag-Ab

(多)Ag-E

–Ab＋Ag-E

(少)（多）酶活性↑S當(dāng)Ag少時Ag-Ab(少)Ag-E

–Ab＋Ag-E

(多)（少）酶活性↓結(jié)論酶活性與Ag含量呈

相關(guān)（B）克隆酶供體免疫分析

CEDIA定義：標記了的供體酶的抗原（ED-Ag）和抗體結(jié)合后，空間位阻了供酶體和酶受體的結(jié)合，從而不能形成有活力的全酶。原理：EA1、酶ED

2、形成Ag-ED-Ab時阻止ED和EA結(jié)合，酶活降低

模式23、Ag和Ab的結(jié)合能力大于ED和EA結(jié)合CEDIA示意圖總結(jié)Ag-EDEAAbAg

Ag多Ag-Ab如何變化Ag-ED-Ab如何變化Ag-ED-EA如何變化酶活如何變化結(jié)論酶的活性和樣本中抗原的量正相關(guān)（C）生物素-親和素均相酶免疫測定親和素是一種糖蛋白，可由蛋清中提取生物素又稱維生素H，存在于蛋黃中生物素和親和素具有獨特的結(jié)合特性二者可偶聯(lián)抗原、抗體等大分子生物活性物質(zhì)結(jié)合迅速、專一、穩(wěn)定，

優(yōu)勢：可極大提高檢測方法的靈敏度特異性強穩(wěn)定性高適用范圍廣實驗成本低BA-HEI原理要點1、Ag-A-Ab不能與B-E結(jié)合，B-E處于游離狀態(tài)，保留酶的活性。2、Ag-A-B-E后酶活性喪失。模式3AgBA-HEI原理示意圖：EEBSAAgAgAAgAgAEBS總結(jié)

Ag-AB-EAgAg競爭Ag-A-AbAg-AbAg多時B-E量Ag-A-B-E如何變化如何變化如何變化如何變化如何變化酶活結(jié)論酶的活性和樣本中的Ag含量呈？關(guān)系應(yīng)用小分子激素半抗原的測定評價優(yōu)點：1.不需分離Ag-E-Ab和Ag-E；2.簡便、快速、易于自動化;3.靈敏度高（10_9mol/L）,但不及異相酶免疫測定。缺點：易受內(nèi)源性酶、酶抑制劑、交叉反應(yīng)物影響而出現(xiàn)非特異性。小結(jié)酶底物標記方法EIA類型HEI模式不需要分離酶標物的結(jié)合物和游離態(tài)的酶標物共同點競爭反應(yīng)中的抗體限量酶活性與待測酶標記物標記抗原抗原量抗體復(fù)合物的作用EMITCEDIABA-HEI（2）非均相酶聯(lián)免疫根據(jù)是否采用固相材料以吸附抗原或抗體分：固相酶免疫測定：固相預(yù)先吸附抗原或抗體，在其表面反應(yīng)。

液相酶免疫測定酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)1、酶聯(lián)免疫分析技術(shù)（ELISA）

抗原（抗體）制成固相制劑，在與標本中抗原（抗體）反應(yīng)后，只需經(jīng)過固相的洗滌，抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)的分離，再將酶標抗體（抗原）和復(fù)合物中的抗原反應(yīng)，根據(jù)底物和復(fù)合物中酶的反應(yīng)的顏色測定標本中的抗原的量的方法。（1）定義：

①使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，保持其免疫活性②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性

2、基本原理②把受檢標本（測定其中的抗體或抗原）和固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，最后。再加入酶標記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。結(jié)合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。

③

加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進行定性或定量分析

ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體

底物顯色定性或定量的分析原理包被反應(yīng)加入待測抗體或抗原和酶標抗原或抗體洗滌使結(jié)合在固相上的抗原抗體復(fù)合物與未結(jié)合的分離1234基本原理優(yōu)點：簡便、快速、敏感、特異、實驗設(shè)備簡單、應(yīng)用范圍廣、無同位素污染固相的抗原或抗體

酶標記物（酶結(jié)合物）

酶反應(yīng)的底物

三個必要試劑

3、方法類型方法：（1）將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體，洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。（2）加受檢標本，使之與固相抗體接觸反應(yīng)一段時間，讓標本中的抗原與固相載體上的抗體結(jié)合，形成固相抗原復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)。雙抗體夾心法（3）加酶標抗體：使固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標抗體結(jié)合。徹底洗滌未結(jié)合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量正相關(guān)。（4）加底物：夾心式復(fù)合物中的酶催化底物為有色產(chǎn)物。根據(jù)顏色反應(yīng)進行該抗原的定性或定量。雙抗體夾心法示意圖（4)原理：利用連接于固相載體上的抗體和酶標抗體分別與樣品中被檢測抗原分子上兩個抗原決定簇結(jié)合，形成固相抗體-抗原-酶標抗體免疫復(fù)合物。復(fù)合物的形成量與待測抗原的含量成正比。測定復(fù)合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物質(zhì)量(OD值)，即可確定待測抗原含量。

根據(jù)同樣原理，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標抗原結(jié)合物，即可用雙抗原夾心法測定標本中的抗體。（6）試劑在這種測定方法中有3種必要的試劑：①固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）②酶標記的抗原或抗體（標記物）③酶作用的底物（顯色劑）(5)應(yīng)用：

二價或二價以上的較大分子抗原測定乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等方法：

（1）將特異抗原與固相載體連接，形成固相抗原。洗滌。

（2）待測管中加受檢標本和一定量酶標抗體的混合溶液，使之與固相抗原反應(yīng)。如受檢標本中無抗體，則酶標抗體能順利地與固相抗原結(jié)合。競爭法如受檢標本中含有抗體，則與酶標抗體以同樣的機會與固相抗原結(jié)合，競爭性地占去了酶標抗原與固相載體結(jié)合的機會，使酶標抗體與固相載體的結(jié)合量減少。參考管中只加酶標抗體，保溫后，酶標抗體與固相抗原的結(jié)合可達最充分的量。洗滌。

（3）加底物顯色：參考管中由于結(jié)合的酶標抗原最多，故顏色最深。參考管顏色深度與待測管顏色深度之差，代表受檢標本抗原的量。待測管顏色越淡，表示標本中抗原含量越多。范圍：此法可用于抗體的定量測定，也可用于測定抗原和半抗原。1.將抗原包被