T-SPPHN 002-2023 葫蘆科蔬菜小西葫蘆花葉病毒檢測(cè)技術(shù)規(guī)程

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B15/19T/SPPHN湖南省植物保護(hù)學(xué)會(huì)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)T/SPPHN

002-2023葫蘆科蔬菜小西葫蘆花葉病毒檢測(cè)技術(shù)規(guī)程

Detection

of

ZYMV

in

Cucurbitaceae

Vegetables2023-

11-

20

發(fā)布 實(shí)施湖南省植物保護(hù)學(xué)會(huì) 發(fā)

布學(xué)兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標(biāo)準(zhǔn)下載T/SPPHN

002-2023學(xué)兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標(biāo)準(zhǔn)下載本文件是根據(jù)GB/T

《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則

第一部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的要求編制本文件由湖南省植物保護(hù)學(xué)會(huì)歸口。學(xué)兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標(biāo)準(zhǔn)下載T/SPPHN

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本文件規(guī)定了葫蘆科小西葫蘆花葉病毒的病原物小西葫蘆花葉病毒（Zucchini

）的反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（）和實(shí)時(shí)熒光定量）檢測(cè)法檢測(cè)鑒定的基本

3.1

Zucchini

Zucchini

3.2

先利用反轉(zhuǎn)錄酶將病毒的反轉(zhuǎn)錄成，再以為模板，在耐熱聚合酶（酶）條帶的出現(xiàn)與否判定是否存在相關(guān)病毒的一種分子生物學(xué)檢測(cè)方法。3.3

兔ｗｗｗ．ｂｚｆ學(xué)兔ｘｗ．ｃｏｍ標(biāo)準(zhǔn)下載T/SPPHN

002-2023兔ｗｗｗ．ｂｚｆ學(xué)兔ｘｗ．ｃｏｍ標(biāo)準(zhǔn)下載先利用反轉(zhuǎn)錄酶將病毒的反轉(zhuǎn)錄成，再以為模板，然后在反應(yīng)體系中加入熒

4.1

4.2

在以下的兩種方法中，均需設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。

根據(jù)附錄、附錄判定檢測(cè)結(jié)果。檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，即判定該樣品含有，該樣品感染了小學(xué)兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標(biāo)準(zhǔn)下載T/SPPHN

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除非另有說(shuō)明，在本標(biāo)準(zhǔn)中僅使用確認(rèn)的分析純?cè)噭┖碗p蒸水或去離子水或相當(dāng)純度的水。A.1.1

75%A.1.2

聚合酶，10

），2.5

），或

A.1.3

242

800

57.1

621

bp

片病葉或其他蔬菜組織疊加在一起，稱(chēng)取

0.1

左右至放有

粒鋼珠的

滅菌離心管

60

60

1.5

10，取上清，加入

0.2

氯仿，劇烈振蕩混勻后室溫放置

℃下

離心

10

，將

℃下

75

丟棄，室溫下自然干燥

。用

20

8.0）或

ddH

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可采用一步法

試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，或者采用兩步法分別進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和

擴(kuò)增。不同商家的試劑盒擴(kuò)增反應(yīng)體系和條件略有差異，操作步驟應(yīng)參照相應(yīng)商家的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。A.4.1

10

μL

0.4

10

0.4

μL

10

下游引物

0.4

反轉(zhuǎn)錄酶和

聚合酶混合液，

μL

2.8

ddH

50℃反轉(zhuǎn)錄

30

94

94

30

56

30

72

35

個(gè)循環(huán)；72

10

℃冰箱保存?zhèn)溆?。A.4.2

A.4.2.1

10

μL

μL

0.5μL

10

μM

0.5μL

10mM

dNTP

mix2μL

ddH。充65

10

min

min離心數(shù)秒后

2μL

第一鏈合成緩沖液，

0.5μL

的反轉(zhuǎn)錄酶，

ddH

45℃反

70℃反

15

min

應(yīng)。A.4.2.2

10μL

μL

cDNA

μL

液，0.8μL

2.5mM

dNTP

mix0.2

10

上游引物

0.2

10

μM

下游引物

0.1

6.7μL

ddH。充，進(jìn)

PCR

，反94

min94℃變性

30

56℃退火

30

72℃延伸

35

個(gè)循環(huán)；72℃延伸

10

℃終止反應(yīng)。

℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

A.1.3

100

10μL

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35

621

bp

A.1

西葫蘆上

ZYMV

RT-PCR

擴(kuò)增產(chǎn)物大小應(yīng)該為

621

bp

左右。陽(yáng)性對(duì)照有目標(biāo)條帶而陰性對(duì)照無(wú)目標(biāo)條帶時(shí)，檢測(cè)

621

bp

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反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量

檢測(cè)法（B.1

A.1.1

2.5

），TransStart

qPCR

B.2

194

bpB.3

B.4

A.4.2.1

20μL

0.8μL

cDNA

10μL

qPCR

0.4

μL

10

0.4

10

8.4μL

ddH