基因工程和蛋白質(zhì)工程

第十六章基因工程與蛋白質(zhì)工程第一節(jié)生物工程概述第二節(jié)基因工程第三節(jié)蛋白質(zhì)工程第一節(jié)生物工程概述一、生物工程概念及研究技術(shù)二、在現(xiàn)代工、農(nóng)、醫(yī)領(lǐng)域中的應(yīng)用一、生物工程的概念及研究技術(shù)1.基因工程——在分子水平的遺傳操作技術(shù)2.細(xì)胞工程——遺傳物質(zhì)在細(xì)胞間的轉(zhuǎn)移4.生化工程——生物工程產(chǎn)品的最終取得手段3.酶工程——酶的改造和設(shè)計(jì)基因工程是指在微觀領(lǐng)域（分子水平）中，根據(jù)分子生物學(xué)和遺傳學(xué)原理，設(shè)計(jì)并實(shí)施一項(xiàng)把一個(gè)生物體中有用的目的DNA(遺傳信息)轉(zhuǎn)入另一個(gè)生物體中，使后者獲得新的需要的遺傳性狀或表達(dá)所需要的產(chǎn)物，最終實(shí)現(xiàn)該技術(shù)的商業(yè)價(jià)值?；蚬こ袒蚬こ膛c建筑工程基因工程操作水平：DNA分子水平目的：定向改變遺傳物質(zhì)或獲得基因產(chǎn)物。2、基因工程的理論基礎(chǔ)1）物質(zhì)基礎(chǔ)——脫氧核苷酸2）結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)——規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)3）中心法則，共用一套遺傳密碼細(xì)胞工程1、細(xì)胞工程的概念

利用細(xì)胞融合技術(shù)把含有不同遺傳物質(zhì)的細(xì)胞合成雜種細(xì)胞。并使之分裂生長(zhǎng)成為雜種生物。 它包括體細(xì)胞融合、核移植、細(xì)胞器攝取和染色體片段的重組等。細(xì)胞工程操作水平：細(xì)胞整體水平或細(xì)胞器水平目的：定向改變遺傳物質(zhì)或獲得細(xì)胞產(chǎn)品。2、細(xì)胞工程的理論基礎(chǔ)——細(xì)胞全能性依據(jù)——生物體的每一個(gè)干細(xì)胞都包含有該物種所特有的全套遺傳物質(zhì)。異種植物細(xì)胞雜種細(xì)胞轉(zhuǎn)基因植物異種動(dòng)物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞群重組細(xì)胞體細(xì)胞細(xì)胞核早期胚胎受精卵去核卵細(xì)胞克隆動(dòng)物試管嬰兒動(dòng)物細(xì)胞融合植物體細(xì)胞雜交植物組織培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)核移植胚胎移植體外受精3、主要技術(shù)植物組織培養(yǎng)植物體細(xì)胞雜交動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞融合單克隆抗體技術(shù)胚胎移植核移植植物細(xì)胞工程技術(shù)動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)酶工程 酶工程是利用酶的特異催化功能，在常溫長(zhǎng)壓下將一種物質(zhì)轉(zhuǎn)化為另一種物質(zhì)，以獲得高純度的適用之物。 該技術(shù)包括各種酶的開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)。酶的分離和純化技術(shù)等。酶工程用于食品工業(yè)很有效。啤酒、醬油、葡萄糖等都可用酶工程生產(chǎn)。二、生物工工程在現(xiàn)代代工、農(nóng)、、醫(yī)領(lǐng)域中中的應(yīng)用1.化工及冶金金工業(yè)2.輕工和食品品工業(yè)4.農(nóng)業(yè)和畜牧牧業(yè)3.醫(yī)藥工業(yè)5.環(huán)保和能源源工業(yè)稀少珍貴的的蛋白質(zhì)藥藥物1982年，美國(guó)食食品與藥物物管理局批批準(zhǔn)了首例例基因工程程產(chǎn)品—人胰島素投投放市場(chǎng)——它標(biāo)志了基基因工程產(chǎn)產(chǎn)品正式進(jìn)進(jìn)入到商業(yè)業(yè)化階段。。人生長(zhǎng)激素素、表皮生生長(zhǎng)因子、、腫瘤壞死死因子、a-干擾素、纖纖維素酶、、抗血友病病因子、紅紅細(xì)胞生成成素、尿激激酶原、白白細(xì)胞介素素-2、集落刺激激因子、乙乙肝疫苗等等等畜牧業(yè)中的的應(yīng)用動(dòng)物疫苗、、生長(zhǎng)激素素等例：從轉(zhuǎn)基因羊羊的羊奶中中提取出治治療心臟病病的藥物tPA（組織溶解酶酶原激活劑劑）。種植業(yè)中的的應(yīng)用用攜帶外源源基因的農(nóng)農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化植植物原生質(zhì)質(zhì)體，使外外源DNA與植物染色色體DNA整合，通過(guò)過(guò)原生質(zhì)體體的培養(yǎng)分分化成愈傷傷組織，最最后發(fā)育成成具有新性性狀的完整整植株—轉(zhuǎn)基因植物物基因工程包包括DNA重組技術(shù)和和其他使基基因結(jié)構(gòu)得得以定向改改造的技術(shù)術(shù)。本節(jié)主主要介紹DNA重組技術(shù)，，大體上包包括下列5個(gè)步驟?；蚬こ淌?973年由美國(guó)斯斯坦福大學(xué)學(xué)科恩和舊舊金山大學(xué)學(xué)醫(yī)學(xué)院的的博耶創(chuàng)立立的概念第二節(jié)基基因工程程DNA重組的技術(shù)路路線ForeignDNAtobeinsertedPlansmidvectorJoiningRecombinantDNAmolecule

Introductionintohostcellsbytransformation

HostchromatemeSlectionforcellscoteiningarecombinantDNAmoleculeCloning+1、目的基因因的制備2、載體的構(gòu)建3、目的基因因與載體的的重組4、重組體體導(dǎo)入宿主細(xì)胞進(jìn)進(jìn)行擴(kuò)增5、克隆基因的的鑒定一、目的基基因的獲得得二、基因載載體三、重組DNA的篩選及表表達(dá)一、目的基基因的獲得得1.限制酶——特異性切割割DNA的手術(shù)刀2.取得目的基基因的方法法——分離法及合合成法1.限制性內(nèi)切切酶DNA重組即是將兩種種DNA分子經(jīng)過(guò)切切割，選擇擇適合的片片段連接起起來(lái)的過(guò)程程實(shí)現(xiàn)這一步步，是在限限制性內(nèi)切切酶發(fā)現(xiàn)以以后才實(shí)現(xiàn)現(xiàn)的限制性內(nèi)切切酶：一類類核酸內(nèi)切切酶，可以以將外源DNA在特定位點(diǎn)點(diǎn)切割降解解。以以后從細(xì)菌菌中分別分分離出了I型和Ⅱ型兩兩類限制性性內(nèi)切酶。。限制性內(nèi)切切酶的命名名用細(xì)菌同名名的第一個(gè)個(gè)字母（大大寫）和種種名的前兩兩個(gè)字母（（小寫）構(gòu)構(gòu)成酶的基基本名稱。。若酶是從從其中一種種特殊菌株株來(lái)，還在在基本名稱稱后加上菌菌株名稱符符號(hào)。名稱稱后的羅馬馬數(shù)字，表表示在該特特殊菌株中中發(fā)現(xiàn)此酶酶的先后次次序。如HaeII是從（Haemophilusaegypticus）中提取的，，并且是從從中發(fā)現(xiàn)的的第二個(gè)酶酶。限制性內(nèi)切切酶切割DNA的方式a.從識(shí)別序列列的中間切切開(kāi)b.在識(shí)別序列列對(duì)稱軸的的左右兩方方進(jìn)行切割割c.在識(shí)識(shí)別別序序列列對(duì)對(duì)稱稱軸軸的的右右邊邊（（5’-3’鏈））和和對(duì)對(duì)稱稱軸軸左左邊邊（（3’-5’鏈））切切開(kāi)開(kāi)a.從識(shí)識(shí)別別序序列列的的中中間間切切開(kāi)開(kāi)從識(shí)識(shí)別別序序列列的的中中間間切切開(kāi)開(kāi)產(chǎn)產(chǎn)生生平平齊齊末末端端（（bluntends）），，如HaeⅢⅢb.在識(shí)識(shí)別別序序列列對(duì)對(duì)稱稱軸軸的的左左右右兩兩方方進(jìn)進(jìn)行行切切割割即分分別別在在5’-3’鏈和和3’-5’鏈對(duì)對(duì)稱稱軸軸的的左左右右方方切切開(kāi)開(kāi)，，形形成成帶帶有有凸凸出出的的5’磷酸酸基基團(tuán)團(tuán)的的粘粘性性末末端端（（Cohesiveends）），，如EcoRⅠⅠc.在識(shí)識(shí)別別序序列列對(duì)對(duì)稱稱軸軸的的右右邊邊（（5’-3’鏈））和和對(duì)對(duì)稱稱軸軸左左邊邊（（3’-5’鏈））切切開(kāi)開(kāi)形成成帶帶有有凸凸出出的的3’羥基基的的粘粘性性末末端端，，如如pstI2.取得得目目的的基基因因的的方方法法———分離離法法及及合合成成法法（1）DNA片段段的的直直接接提提取?。?）用用噬噬菌菌體體或或質(zhì)質(zhì)粒粒直直接接從從宿宿主主細(xì)細(xì)胞胞中中將將目目的基基因因攜攜出出（3）使使用用相相應(yīng)應(yīng)的的mRNA分離離基基因因二、、基基因因載載體體1.質(zhì)粒?！旧w體以以外外的的遺遺傳傳單單元元2.噬菌菌體體———感染染細(xì)細(xì)菌菌的的病病毒毒質(zhì)粒粒是是一一種種環(huán)環(huán)狀狀雙雙鏈鏈的的DNA分子子。。自自身身在在細(xì)細(xì)菌菌細(xì)細(xì)胞胞中中能能不不斷斷復(fù)復(fù)制制繁繁殖殖。研究究比比較較深深入入的的質(zhì)質(zhì)粒粒有有大大腸腸桿桿菌菌的的性性因因子子（（F因子子））、、大大腸腸桿桿菌菌素素因因子子和和抗抗藥藥因因子子等等抗藥藥因因子子（（質(zhì)質(zhì)粒粒））在在其其DNA上編編碼碼有有某某些些酶酶的的基基因因，，表表達(dá)達(dá)產(chǎn)產(chǎn)生生的的酶酶對(duì)對(duì)鏈鏈霉霉素素、、氯氯霉霉素素、、磺磺胺胺、、青青霉霉素素、、四四環(huán)環(huán)素素、、卡卡那那霉霉素素等等藥藥物物能能產(chǎn)產(chǎn)生生生生物物化化學(xué)學(xué)修修飾飾，，使使之之鈍鈍化化而而失失效效1.質(zhì)粒粒———染色色體體以以外外的的遺遺傳傳單單元元質(zhì)粒粒的的作作用用質(zhì)粒粒DNA能從從細(xì)細(xì)菌菌中中提提出出來(lái)來(lái)，，又又能能再再轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入入細(xì)細(xì)菌菌。。這這個(gè)個(gè)過(guò)過(guò)程程稱稱轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化化。。轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入入的的質(zhì)質(zhì)粒粒DNA仍能進(jìn)行復(fù)制制，這種性能能為DNA重組技術(shù)提供供了重要的條條件，即將一一種外源基因因與質(zhì)粒重組組后，再轉(zhuǎn)入入細(xì)菌中去復(fù)復(fù)制繁殖，使使外源基因得得以增殖。質(zhì)粒自身的某某些抗藥基因因成為從轉(zhuǎn)化化的細(xì)菌中篩篩選它們的一一種標(biāo)記。除除質(zhì)粒外，噬噬菌體、病毒毒也能通過(guò)“感染”將外源基因帶帶入細(xì)菌并進(jìn)進(jìn)行復(fù)制。目前所使用的的質(zhì)粒目前實(shí)驗(yàn)中所所使用的質(zhì)粒粒、噬菌體和和病毒載體種種類很多。但但都是經(jīng)過(guò)了了人工改造，，更適宜運(yùn)用用于DNA重組技術(shù)。它它們既保留了了轉(zhuǎn)化和感染染活細(xì)胞的能能力，又具有有多處攜帶外外源DNA的酶切位點(diǎn)，，并含有特殊殊的篩選標(biāo)記記這些載體中有有些只能復(fù)制制擴(kuò)增帶入的的外源基因；；有些可以使使外源基因復(fù)復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和和翻譯出基因因的蛋白質(zhì)產(chǎn)產(chǎn)物，這種載載體稱為表達(dá)達(dá)載體pBR322質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)以噬菌體或病病毒為載體，，將所需基因因或含有此基基因的DNA片段轉(zhuǎn)移給受受體細(xì)胞的過(guò)過(guò)程，稱為轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)。我們常常采用用噬菌體作為基基因工程的載載體，其一它它的遺傳結(jié)構(gòu)構(gòu)與功能知道道得比較清楚楚；其二是易易于使細(xì)胞感感染，易于使使外源DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞胞。2.噬菌體——感染細(xì)菌的病病毒以噬菌體為載體體進(jìn)行DNA克隆DNA用限制性內(nèi)切切酶除去中間間一段與外源DNA連接重組載體的體體外包裝帶有外源DNA的噬菌體太小不能被包包裝頭部前體多聯(lián)體DNAA蛋白COSCOSCOS成熟的顆粒在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行DNA的裝配過(guò)程三、重組DNA的篩選及表達(dá)達(dá)1.轉(zhuǎn)化——帶有目的基因因的載體進(jìn)入入受體細(xì)胞2.篩選——從大量受體細(xì)細(xì)胞選出帶有有重組體的細(xì)細(xì)胞3.表達(dá)——外源DNA在受體細(xì)胞的的轉(zhuǎn)錄和翻譯譯1.轉(zhuǎn)化——帶有目的基因因的載體進(jìn)入入受體細(xì)胞由質(zhì)粒作載體體形成的克隆隆，轉(zhuǎn)入細(xì)菌菌時(shí)細(xì)菌預(yù)先先要在低溫條條件下用氯化化鈣處理，形形成“感受態(tài)”細(xì)胞。即增加加細(xì)胞膜的通通透性才能實(shí)實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。由噬菌體作載載體的克隆，，轉(zhuǎn)入細(xì)胞的的過(guò)程稱為“侵染”。因噬菌體具具有自動(dòng)侵入入的功能。細(xì)細(xì)菌不用預(yù)先先處理。噬菌體感染大大腸桿菌的途途徑2.篩選——從大量受體細(xì)細(xì)胞選出帶有有重組體的細(xì)胞（1）插入失活法法（2）放射性探針針檢測(cè)法（3）R-環(huán)檢測(cè)法（4）免疫測(cè)定法法（1）插入失活法法在現(xiàn)在的基因因工程操作中中，所使用的的載體通常是是經(jīng)過(guò)加工改改造的衍生物物，它們要么么帶有一個(gè)或或幾個(gè)可供選選擇的遺傳標(biāo)標(biāo)記，要么具具有被選擇的的遺傳功能，，這就使帶有有目的基因與與不帶目的基基因的細(xì)菌有有明顯區(qū)別，，便于篩選。。pBR322質(zhì)粒結(jié)構(gòu)如果外源DNA插入，氨卞青青霉素抗性基基因失活如果外源DNA插入，四環(huán)素素抗性基因失失活（2）放射性探針針檢測(cè)法利用mRNA可與相應(yīng)的DNA段落雜交，來(lái)來(lái)檢測(cè)有外源源DNA插入的重組體體，是一種快快速而靈敏的的方法。（3）R-環(huán)檢測(cè)法在有利于形成成R-環(huán)的條件下，，使待檢測(cè)的的純化的質(zhì)粒粒DNA，在含有mRNA的緩沖液中局局部變性。如如若質(zhì)粒DNA存在著與mRNA探針互補(bǔ)的序序列，mRNA就會(huì)取代DNA中一條鏈，與與另一條鏈形形成雙鏈雜交交分子，從而而形成R-環(huán)結(jié)構(gòu)，在電電子顯微鏡下下觀察，可直直接觀察到R-環(huán)。這樣可檢檢出重組體質(zhì)質(zhì)粒DNA。（4）免疫測(cè)定法法免疫法測(cè)定只只能是所轉(zhuǎn)移移外源DNA必須表達(dá)后才才能進(jìn)行，而而且必須具備備有效的特異異性抗體。Southern和Western印跡法DNAfrangmentElectrophoresisTransferofDNAbyblotting32P-labledDNAprobeAutoradiographyAgarrosegelAutoradiogramNitrocellulosesheetAutoradiogramPolymersheetSDS-PolyacrylamidegelTransferproteinAddradiolabledspesficantibody,WashtoremoveunboudantibodyProteinbanddetectedbyspecificantibodyAutoradiography3.表達(dá)——外源DNA在受體細(xì)胞中中的轉(zhuǎn)錄和翻翻譯帶有目的基因因的載體轉(zhuǎn)移移到受體細(xì)胞胞成功并篩選選出來(lái)后，最最終目的是要要目的基因在在受體細(xì)胞中中得以表達(dá)，，產(chǎn)生具有功功能性的蛋白白質(zhì)或肽。第三節(jié)蛋蛋白質(zhì)工程一、蛋白質(zhì)工程的的概念二、蛋白質(zhì)工程的的一般技術(shù)三、蛋白質(zhì)工程的的應(yīng)用一、蛋白質(zhì)工工程的概念蛋白質(zhì)工程(proteinengineering)：：通過(guò)改造與蛋蛋白質(zhì)相應(yīng)的的基因中的堿堿基順序，或或設(shè)計(jì)合成新新的基因，將將它克隆至受受體細(xì)胞中，，通過(guò)基因表表達(dá)而獲得具具有新的特性性的蛋白質(zhì)技技術(shù)1、基因定點(diǎn)點(diǎn)突變——定定做新蛋白質(zhì)質(zhì)2、蛋白質(zhì)設(shè)設(shè)計(jì)——對(duì)天天然蛋白質(zhì)的的修飾蛋白質(zhì)工程舉舉例：定點(diǎn)突變技術(shù)術(shù)：已知絲絲氨酸酸是由由TCT編碼，，只要要把C改為G，就變成成半胱胱氨酸酸的密密碼TGT。于是用用人工工合成成一段段寡聚聚核苷苷酸引引物，，引物物里含含有TGT外，其其余均均與基基因部部分互互補(bǔ)。。打開(kāi)開(kāi)含有有被突突變蛋蛋白質(zhì)質(zhì)基因因的質(zhì)質(zhì)粒的的雙條條鏈成成單鏈鏈模板板，用用引物物與之之互補(bǔ)補(bǔ)鏈退退火（（假如如退火火在適適宜溫溫度下下進(jìn)行行，約約15個(gè)堿堿基中中，有有一個(gè)個(gè)堿基基錯(cuò)配配是可可以容容忍的的）。。然后后由DNA聚合酶酶延伸伸引物物，由由DNA連接