SN1869-2007食品中多種致病菌快速檢測方法PCR法

中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標準食品中多種致病菌快速檢測方法PCR法Rapiddetectionmethodsforpathogensinfoods—PCRmethod2007-04-06發(fā)布2007-10-16實施I本標準的附錄A是規(guī)范性附錄，附錄B、附錄C和附錄D是資料性附錄。本標準由國家認證認可監(jiān)督管理委員會提出并歸口。本標準起草單位：中華人民共和國遼寧出入境檢驗檢疫局、中華人民共和國汕頭出入境檢驗檢疫局、中華人民共和國深圳出入境檢驗檢疫局、中華人民共和國黑龍江出入境檢驗檢疫局、中國合格評定國家認可委員會、大連產(chǎn)品質(zhì)量檢驗所、中華人民共和國青島出入境檢驗檢疫局、中華人民共和國內(nèi)蒙古出入境檢驗檢疫局、中華人民共和國浙江出入境檢驗檢疫局、深圳太太基因工程有限公司。本標準系首次發(fā)布的檢驗檢疫行業(yè)標準。1食品中多種致病菌快速檢測方法PCR法1范圍本標準規(guī)定了用普通PCR技術(shù)快速檢測食品中沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌、空腸彎曲菌、腸出血性大腸埃希氏菌O157:H7、副溶血性弧菌、霍亂弧菌和創(chuàng)傷弧菌的方法；用BAX@全自動致病菌PCR檢測系統(tǒng)'檢測食品中沙門氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌、空腸彎曲菌、腸出血性大腸埃希氏菌O157:H7和阪崎腸桿菌的方法。本標準適用于食品中沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌、空腸彎曲菌、腸出血性大腸埃希氏菌O157:H7、副溶血性弧菌、霍亂弧菌和創(chuàng)傷弧菌的檢驗。2規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過本標準的引用而成為本標準的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單(不包括勘誤的內(nèi)容)或修訂版均不適用于本標準，然而，鼓勵根據(jù)本標準達成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標準。GB/T4789.4食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗GB/T4789.5食品微生物學檢驗志賀氏菌檢驗CB/T4789.6食品微生物學檢驗致瀉大腸埃希氏菌檢驗GB/T4789.7食品微生物學檢驗副溶血性弧菌檢驗GB/T4789.8食品微生物學檢驗小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢驗GB/T4789.9食品微生物學檢驗空腸彎曲菌檢驗GB/T4789.10食品微生物學檢驗金黃色葡萄球菌檢驗GB/T4789.30食品微生物學檢驗單核細胞增生李斯特氏菌檢驗GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB19489實驗室生物安全通用要求SN0170出口食品中沙門氏菌檢驗方法SN0172出口食品中金黃色葡萄球菌檢驗方法SN0173出口食品副溶血性弧菌檢驗方法SN0174出口食品中小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢驗方法SN0175出口食品中空腸彎曲菌檢驗方法SN0184出口食品中單核細胞增生李斯特氏菌檢驗方法SN/T0973進出口肉及肉制品中腸出血性大腸桿菌O157:H7檢驗方法SN/T1022出口食品中霍亂弧菌檢驗方法WS/T230臨床診斷中聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)的應(yīng)用ISO6579微生物學——沙門氏菌檢驗方法指南ISO11290-1食品和動物飼料微生物學——單核細胞增生李斯特氏菌定性和定量檢測方法第11)為美國杜邦公司(DuPontQualicon)的產(chǎn)品。2ISO16654食品和動物飼料微生物學—大腸桿菌O157檢測方法NMKLNo.156北歐食品協(xié)會食品中致病性弧菌定性和定量檢測方法FDA/BAMChapter5美國食品藥品管理局微生物學分析手冊第2章沙門氏菌FDA/BAMChapter9美國食品藥品管理局微生物學分析手冊第9章弧菌FDA/BAMChapter10美國食品藥品管理局微生物學分析手冊食品中單核細胞增生李斯特氏菌定性和定量檢測方法USDA/FSISMLG4C.01美國農(nóng)業(yè)部食品安全檢驗局生肉、畜胴體擦拭樣品、整雞淋洗液、即食食品、禽肉制品和巴氏蛋制品中沙門氏菌BAX-PCR篩選方法USDA/PSISMLG8A.01美國農(nóng)業(yè)部食品安全檢驗局單核細胞增生李斯特氏菌BAX篩選方法下列縮略語適合于本標準。PCRpolymerasechainreactiondNTPdeoxyribonucleosidetriphosphate脫氧核苷三磷酸。dATPdeoxyadenosinetriphosphate脫氧腺苷三磷酸。dGTPdeoxyguanosinetriphosphate脫氧鳥苷三磷酸。dCTPdeoxycytidinetriphosphate脫氧胞苷三磷酸。dTTPdeoxythymidinetriphosphate脫氧胸苷三磷酸。dUTPdeoxyuridinetriphosphate脫氧尿苷三磷酸。十二烷基硫酸鈉。Tristris(hydroxymethyl)aminomethane三(羥甲基)氨基甲烷。DEPC焦碳酸乙二酯。3TaqDNA聚合酶。uracilDNAglycosylase尿嘧啶DNA-糖基酶。4生物安全措施為了保護實驗室人員的安全，應(yīng)由具備資格的工作人員檢測沙門氏菌，所有培養(yǎng)物和廢棄物應(yīng)小心處置。并按GB19489中的有關(guān)規(guī)定執(zhí)行。5防污染措施參照標準《臨床診斷中聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)的應(yīng)用》(WS/T230)中第6章污染的預防和控制。6試劑和材料除另有規(guī)定外，所有試劑均采用分析純。6.310×PCR緩沖液[其中氯化鉀(KCI):500mmol/L;Tris-HCl(pH8.3):100mmol/L;明膠：0.1%]。6.5瓊脂糖。6.610×上樣緩沖液：含0.25%溴酚藍，0.25%二甲苯青FF,30%甘油水溶液。6.750×TAE緩沖液：稱取484gTris,量取114.2mL冰醋酸，200mL0.5mol/LEDTA(pH:8.0),溶于水中，定容至2L。分裝后高壓滅菌備用。6.8DNA分子量標記物(100bp～1000bp)。6.9Eppendorf管和PCR反應(yīng)管。6.12常見致病菌(沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌、空腸彎曲菌、腸出血性大腸埃希氏菌O157:H7、副溶血性弧菌、霍亂弧菌和創(chuàng)傷弧菌)普通PCR檢測試劑盒2(試劑盒組成、功能及使用注意事項參見附錄B)。6.13BAX@沙門氏菌的PCR檢測試劑盒(Qualicon#17710608,試劑盒組成參見附錄C),5℃±3℃放置。6.14BAX@單核細胞增生李斯特氏菌PCR檢測試劑盒(Qualicon#17710609),5℃±3℃放置。6.15BAX@彎曲菌的PCR檢測試劑盒(Qualicon#17720680),5℃±3℃放置。6.16BAX@系統(tǒng)腸出血性大腸桿菌O157:H7多重(MP)PCR篩選試劑盒(Qualicon#17720673)。6.17BAX@系統(tǒng)腸出血性大腸桿菌O157:H7(MP)PCR快速檢測增菌培養(yǎng)基(Qualicon#2)由指定單位提供，給出這一信息是為了方便本標準的使用者，并不表示對該產(chǎn)品的認可。如果其他等效產(chǎn)品具46.18BAX@阪崎腸桿菌的PCR檢測試劑盒(Qualicon#17720657),5℃±3℃放置。7儀器和設(shè)備7.2電泳裝置。7.3凝膠分析成像系統(tǒng)。7.4PCR超凈工作臺。7.5高速臺式離心機(離心轉(zhuǎn)速12000r/min以上),臺式離心機(離心轉(zhuǎn)速2000r/min)。7.7BAX@全自動致病菌檢測系統(tǒng)(啟動包)。第一法普通PCR法8檢測程序普通PCR方法檢測程序見圖1。樣品制備選擇性增菌肉湯或待鑒定的菌株細菌DNA的提取PCR擴增電泳和結(jié)果觀察陰性結(jié)果陽性結(jié)果傳統(tǒng)的方法確認圖1PCR檢測致病菌程序圖9操作步驟9.1樣品制備、增菌培養(yǎng)和分離9.1.1沙門氏菌按照GB/T4789.4或SN0170或ISO6579或FDA/BAMChapter5或USDA/FSISMLG4C.01方法進行。9.1.2志賀氏菌按照GB/T4789.5方法進行。9.1.3金黃色葡萄球菌可按照GB/T4789.10或SN0172方法進行。9.1.4小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌可按照GB/T4789.8或SN0174方法。59.1.5單核細胞增生李斯特氏菌可按照GB/T4789.30或SN0184或ISO11290或FDA/BAMChapter10或USDA/FSISMLG8A.01方法進行。9.1.6空腸彎曲菌按照GB/T4789.9或SN0175方法進行。9.1.7腸出血性大腸埃希氏菌O157:H7按照GB/T4789.6或SN/T0973或ISO16654方法進行。9.1.8副溶血性弧菌按照GB/T4789.7或SNO173或FDA/BAMChapter9或NMKLNo.156方法進行。9.1.9霍亂弧菌按照SN/T1022或FDA/BAMChapter9或NMKLNo.156方法進行。9.1.10創(chuàng)傷弧菌按照FDA/BAMChapter9或NMKLNo.156方法進行。9.2細菌模板DNA的提取9.2.1直接提取法對于上述方法培養(yǎng)的增菌液，可直接取該增菌液1mL加到1.5mL無菌離心管中，8000r/min離心5min,盡量吸棄上清；加入50μLDNA提取液(參見附錄B),混勻后沸水浴5min,12000r/min離心5min,取上清保存于一20℃?zhèn)溆靡源龣z測。—70℃可長期保存。對于9.1方法分離到的可疑菌落，可直接挑取可疑菌落，加入50μLDNA提取液，再按照上述步驟制備模板DNA以待檢測。9.2.2有機溶劑提純法取待測樣本(增菌培養(yǎng)液或分離菌落菌懸液)1mL,加到1.5mL離心管中，8000r/min離心4min,盡量吸棄上清；加入750μLDNA提取液，沸水浴5mi加酚：三氯甲烷(1:1,體積比)700μL,振蕩混勻，13000r/min離心5min,去上清液，70%乙醇沖洗一次，13000r/min離心5min,沉淀溶于20μL核酸溶解液中。保存在—20℃?zhèn)溆谩?70℃可長期保存。也可使用等效的商業(yè)化的DNA提取試劑盒并按其說明提取制備模板DNA。9.3PCR擴增9.3.1引物的序列引物的序列見附錄A。9.3.2空白對照、陰性對照和陽性對照設(shè)置空白對照設(shè)為以水代替DNA模板；陰性對照采用非目標菌的DNA作為PCR反應(yīng)的模板；陽性對照采用含有檢測序列的DNA(或質(zhì)粒)作為PCR反應(yīng)的模板。9.3.3PCR反應(yīng)體系普通PCR反應(yīng)體系見表1。試劑貯備液濃度25μL反應(yīng)體系中加樣體積/μL10×PCR緩沖液氯化鎂(MgCl?)25mmol/LdNTP.(含dUTP)各2.5mmol/LUNG酶0.06上游引物20pmol/μl.下游引物Taq酶5U/μL雙蒸水—補至25注1:反應(yīng)體系中各試劑的量可根據(jù)具體情況或不同的反應(yīng)總體積進行適當調(diào)整。注2:每個反應(yīng)體系應(yīng)設(shè)置兩個平行反應(yīng)。6PCR反應(yīng)參數(shù)見附錄A。9.3.5PCR擴增產(chǎn)物的電泳檢測用電泳緩沖液(1×TAE)制備1.8%～2%瓊脂糖凝膠(55℃~60℃時加入溴化乙錠至終濃度為0.5pg/mL,也可在電泳后進行染色)。取8μL～15μLPCR擴增產(chǎn)物，分別和2μL上樣緩沖液混合，進行點樣，用DNA分子量標記物做參照。3V/cm～5V/cm恒壓電泳，電泳20min～40min,電泳檢測結(jié)果用凝膠成像分析系統(tǒng)記錄并保存。10結(jié)果判定和報告在陰性對照未出現(xiàn)條帶，陽性對照出現(xiàn)預期大小的擴增條帶條件下，如待測樣品未出現(xiàn)相應(yīng)大小的擴增條帶，則可報告該樣品檢驗結(jié)果為陰性；如待測樣品出現(xiàn)相應(yīng)大小擴增條帶則可判定該樣品結(jié)果為假定陽性，則回到傳統(tǒng)的檢測步驟，進一步應(yīng)按9.1中該致病菌對應(yīng)的標準檢測方法進行確認，最終結(jié)果以后者的檢測結(jié)果為準。如果陰性對照出現(xiàn)條帶和/(或)陽性對照未出現(xiàn)預期大小的擴增條帶，本次待測樣品的結(jié)果無效，第二法BAX@全自動致病菌PCR檢測方法11適用范圍BAX@全自動致病菌PCR檢測方法，包括食品中沙門氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌、空腸彎曲菌、腸出血性大腸埃希氏菌O157:H7和阪崎腸桿菌的檢測方法。BAX全自動致病菌檢測系統(tǒng)是應(yīng)用PCR技術(shù)檢測食品中的致病菌的自動方法。擴增反應(yīng)開始，BAX@系統(tǒng)PCR片劑中的熒光染料就會與雙鏈DNA結(jié)合，光照時發(fā)出熒光信號。陽性或陰性結(jié)果。13.1沙門氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌、空腸彎曲菌、腸出血性大腸埃希氏菌O157:H7檢測程序參見圖1(沒有電泳步驟)。13.2BAX阪崎腸桿菌PCR方法檢測程序見圖2。14操作步驟14.1樣品增菌14.1.1沙門氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌、空腸彎曲菌的樣品制備、增菌培養(yǎng)和分離見9.1。14.1.2腸出血性大腸埃希氏菌O157:H7增菌方法按照BAX@系統(tǒng)O157:H7增菌培養(yǎng)基用戶指14.1.3阪崎腸桿菌增菌：以無菌操作稱取25g樣品，放入裝有225mLmLST-Vm肉湯中，混勻，在45℃±0.5℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)20h～22h;取10μL上述增菌液加入500μL的BHI肉湯中，36℃±1℃培養(yǎng)3h。714.2細菌模板DNA的制備沙門氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌、空腸彎曲菌、腸出血性大腸桿菌O157:H7和阪崎腸桿菌增菌肉湯或菌落的細菌模板DNA的制備按各自BAX⑩系統(tǒng)篩選的PCR分析試劑盒說明書進行。14.3BAX系統(tǒng)致病菌的檢測按照BAX@用戶指導書來準備試劑，進行檢測和讀取結(jié)果。25g樣品+225mLmLST-VmBAX系統(tǒng)檢測陽性結(jié)果ml.ST-Vm增菌液取黃色菌落做確認試驗15結(jié)果說明15.1BAX@檢測結(jié)果為陰性的樣品可以出具陰性報告。15.2檢測結(jié)果顯示為陽性的樣品需要繼續(xù)按照傳統(tǒng)的方法進行確認。15.3檢測結(jié)果顯示為不確定或錯誤時，用BAX@系統(tǒng)重新進行檢測。CC(規(guī)范性附錄)PCR檢測的靶基因、引物序列和反應(yīng)參數(shù)表A.1PCR檢測的靶基因、引物序列和反應(yīng)參數(shù)表致病菌靶基因名稱引物序列擴增片段長度預變性擴增循環(huán)數(shù)后延伸沙門氏菌5’-gtgaaattatcgccacgttcgggcaa-3’志賀氏菌5'-gccggtcagccaccctetgagagtac-3’金黃色葡萄球菌5’-aaaaaagcacataacaagcg-3’5’-gataaagaagaaaccagcag-3’小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌5'-aataccgcataacgtcttcg-3’單增李斯特氏菌5’-gatacagaaacateggttggc-3’空腸彎曲桿菌5’-gaatgaaattttagaatgggg-3’致病菌靶基因名稱引物序列擴增片段長度預變性擴增后延伸腸出血性大腸埃希氏菌5’-cgagtacattggcatcgtg-3’副溶血性弧菌5'-aaageggattatgcagaagcactg-3’霍亂弧菌創(chuàng)傷弧菌5'-ccgcggtacaggttggcgca-3’5'-cgccacccactttegggec-3’注：PCR反應(yīng)參數(shù)可根據(jù)基因的擴增儀型號的不同進行適當?shù)恼{(diào)整。o(資料性附錄)致病菌普通PCR檢測試劑盒B.1試劑盒組成每個試劑盒(每個反應(yīng)體系體積為25μL)成分見表B.1。表B.1試劑盒成分組成成分PCR反應(yīng)液Taq酶UNG酶陽性對照1ml1管陰性對照1mL1管B.2說明B.2.1PCR反應(yīng)液中含有特異性引物及各種離子。B.2.2核酸溶解液是去離子水，用于溶解核酸。B.3使用注意事項B.3.1嚴格執(zhí)行行業(yè)行政主管部門頒布的有關(guān)基因擴增檢驗實驗室的管理規(guī)范。B.3.2本試劑盒僅用于體外檢測，操作人員應(yīng)經(jīng)過專業(yè)培訓，開始檢測前要仔細閱讀本說明書全文。B.3.3試劑盒內(nèi)各試劑使用前，充分融化后要稍事離心。反應(yīng)液分裝時應(yīng)盡量避免產(chǎn)生氣泡，上機前注意檢查各反應(yīng)管是否蓋緊，以免泄露污染儀器。(資料性附錄)BAX