SN1933.2-2007食品和水中腸球菌檢驗方法

中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標準食品和水中腸球菌檢驗方法DetectionofEnterococciinfoodandwater—2007-05-23發(fā)布SN/T1933《食品和水中腸球菌檢驗方法》分為兩個部分：——第1部分：平板計數(shù)法和最近似值測定法；——第2部分：濾膜法。本部分為SN/T1933的第2部分。本部分的附錄A是資料性附錄。本部分由國家認證認可監(jiān)督管理委員會提出并歸口。本部分由中華人民共和國遼寧出入境檢驗檢疫局負責起草。本部分系首次發(fā)布的出入境檢驗檢疫行業(yè)標準。T1食品和水中腸球菌檢驗方法第2部分：濾膜法SN/T1933的本部分規(guī)定了水和液體飲料中腸球菌檢驗濾膜法。本部分適用于生活用水、生產(chǎn)加工用水、廢水及茶飲料、碳酸飲料等液體飲料中腸球菌的檢驗。2規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過SN/T1933的本部分的引用而成為本部分的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單(不包括勘誤的內(nèi)容)或修訂版均不適用于本部分，然而，鼓勵根據(jù)本部分達成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和實驗方法SN/T0330出口食品中微生物學檢驗通則3方法提要一定數(shù)量液體樣品或樣品稀釋液通過濾膜時，細菌被截留在濾膜上。將濾膜置于選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，腸球菌菌落呈現(xiàn)特定顏色。經(jīng)過腸球菌菌落確證實驗后，計數(shù)并計算濾膜上陽性腸球菌菌落數(shù)，即可檢驗出樣品中腸球菌數(shù)目。SN/T1933.1確立的術(shù)語、定義和縮略語適用于SN/T1933的本部分。5設(shè)備和材料5.1電子天平：感量為0.001g。5.2恒溫培養(yǎng)箱：41℃±0.5℃,35℃±0.5℃,45℃±0.5℃。5.3振蕩器。5.4移液管：容量1mL,10mL。5.5培養(yǎng)皿：9×50mm,直徑90mm。5.6玻璃、耐高溫塑料、陶瓷或不銹鋼過濾5.7抽濾瓶。5.8真空泵。5.9濾膜：直徑47mm,微孔徑0.45μm±0.02μm。6培養(yǎng)基和試劑實驗用水符合GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和實驗方法的要求。除另有規(guī)定外，試劑為分析純。6.1mEI瓊脂(見第A.1章)。6.2膽汁七葉苷瓊脂(BEA瓊脂)(見第A.2章)。26.3腦心浸液肉湯(見第A.3章)。6.4含6.5%NaCl腦心浸液肉湯(見第A.4章)。6.5腦心浸液瓊脂(見第A.5章)。6.6緩沖蛋白胨水(見第A.6章)。7樣品制備7.1抽樣數(shù)量及抽樣方法抽樣數(shù)量及抽樣方法按SN/T0330進行。7.2樣品的貯存和運送采樣后應(yīng)盡快進行檢驗，冷凍樣品如不能立即進行檢驗，應(yīng)置于一18℃保存。應(yīng)冷藏保存的待檢樣品在運送實驗室過程中應(yīng)于1℃~4℃保存。樣品采集后8h之內(nèi)要完成檢驗。7.3制樣7.3.1污染程度低的水及液體飲料可以直接進行檢驗。7.3.2污染嚴重的水及液體飲料可吸取25mL樣品，加入225mL緩沖蛋白胨水中，充分混勻，制成1:10樣品勻液。7.3.3以上樣品制備可根據(jù)樣品污染程度及檢驗需要，進一步制成10倍遞增的樣品稀釋液。8檢驗程序水和液體飲料中腸球菌濾膜法檢驗程序見圖1。樣品原液或適當倍數(shù)稀釋液樣品過濾mEI瓊脂41℃±0.5℃24h±1h取帶藍色暈輪的菌落進行確證實驗革蘭氏陽性球菌水解七葉苷在BHIB中45℃生長6.5%NaCl的BHIB中35℃生長腸球菌陽性菌落計數(shù)及計算報告結(jié)果圖1食品和水中腸球菌濾膜法的檢驗程序示意圖39檢驗步驟與計數(shù)9.1培養(yǎng)基平板制備制備mEI瓊脂培養(yǎng)基(見第A.1章)。9.2樣品量的選擇根據(jù)樣品污染情況，選擇適宜稀釋度的樣液。樣品加樣量在1mL～100mL之間按半對數(shù)間距選以能在濾膜上生長出20個～60個菌落為宜。每個樣品至少選擇三個加樣量進行過濾。9.3樣品過濾將滅過菌的過濾裝置連接到抽濾瓶上，用無菌鑷子夾取濾膜，將濾膜放至濾器底部。無菌吸取樣液至濾器內(nèi)，打開真空泵進行抽濾。當全部樣液通過濾膜后，用20mL～30mL滅菌生理鹽水輕洗濾器邊緣至少兩次。關(guān)閉真空泵，打開濾器，用無菌鑷子移取濾膜。9.4接種與培養(yǎng)將已濾過樣液的濾膜緊貼在mEI瓊脂表面上，防止濾膜與瓊脂間產(chǎn)生氣泡，如有氣泡產(chǎn)生，重新放置濾膜。倒置平板于41℃±0.5℃培養(yǎng)24h±1h。9.5菌落形態(tài)觀察腸球菌在mEI瓊脂平板的濾膜上形成帶有藍色暈輪的菌落。9.6確證試驗9.6.1用滅菌接種針從濾膜上至少挑取10個帶有藍色暈輪的菌落(不必考慮菌落本身顏色，只要是帶有藍色暈輪的菌落即可)進行確證試驗。菌落分別接種到BHIB肉湯和BHIA斜面，BHIB肉湯置35℃±0.5℃培養(yǎng)24h±1h,BHIA斜面置35℃±0.5℃培養(yǎng)48h±1h。9.6.2BHIB肉湯培養(yǎng)24h±1h后，每管肉湯培養(yǎng)物分別接種到相應(yīng)BEA平板、BHIB肉湯及含6.5%氯化鈉的BHIB肉湯中。BEA平板及含6.5%氯化鈉的BHIB肉湯置35℃±0.5℃培養(yǎng)48h±1h;BHIB肉湯置45℃±0.5℃培養(yǎng)48h±1h,觀察細菌生長情況。9.6.3BHIA斜面培養(yǎng)48h±1h后，從斜面上挑取菌落作革蘭氏染色。9.6.4革蘭氏染色鏡檢為革蘭氏陽性球菌；在BEA平板上生長并水解七葉苷(形成黑色或棕色沉淀);BHIB肉湯中45℃±0.5℃生長；并且在含6.5%氯化鈉的BHIB肉湯中35℃±0.5℃生長良好；具有以上特性的典型菌落可確證為腸球菌。9.7腸球菌的計數(shù)對確證為腸球菌菌落的濾膜進行計數(shù)，生長有20個～60個腸球菌的濾膜為計數(shù)合適范圍。9.8腸球菌菌數(shù)的計算根據(jù)所使用的樣品量，按照式(1),計算每100mL樣品中腸球菌菌落數(shù)。 (1)10結(jié)果報告4(資料性附錄)A.1mEI瓊脂A.1.1成分蛋白胨氯化鈉七葉苷放線菌酮疊氮化鈉酵母浸膏蒸餾水將以上各成分加熱溶解，121℃高壓滅菌15min,在50℃水浴中冷卻。在5ml.蒸餾水中加0.24g萘啶酮酸，滴加幾滴0.1mol/L的氫氧化鈉，配制萘啶酮酸溶液，將此溶液加入mEI瓊脂中。再加入0.02g無菌氯化三苯四氮唑(TTC),充分混勻。調(diào)節(jié)pH值至7.1±0.2。傾注約4mL～6mL的mEl瓊脂至9×50mm的平板，瓊脂厚度約4mm~5mm。平板冷藏備用。A.2膽汁七葉苷瓊脂膽汁鹽20.0g瓊脂15.0gA.2.2制法將各成分加熱溶解，121℃高壓滅菌15min,調(diào)節(jié)pH值至7.1±0.2。冷至45℃~50℃傾注平板。A.3腦心浸液肉湯(BHIB)A.3.1成分牛腦浸出粉10.0g胰蛋白胨10.0g蒸餾水1000.0mL5A.3.2制法將各成分加入蒸餾水中，加熱溶解，調(diào)節(jié)pH至7.4±0.2,分裝，121℃高壓滅菌15min。A.4含6.5%氯化鈉(NaCl)腦心浸液肉湯A.4.1成分除加入氯化鈉(NaCl),其余成分與BHIB肉湯相同。A.4.2制法每升BHIB肉湯中加60.0g氯化鈉(NaCl),其余制法與BHIB肉湯相同。A.5腦心浸液瓊脂A.5.1成分除每升BHIB肉湯加15.0g瓊脂，其余成分與BHIB肉湯相同。A.5.2制法稱取52gBHIA溶于1000mL蒸餾水中，加熱溶解，每管分裝10mL,121℃高壓滅