SN2552.13-2010乳及乳制品衛(wèi)生微生物學檢驗方法第13部分：假單孢菌屬的分離與計數(shù)

中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標準乳及乳制品衛(wèi)生微生物學檢驗方法第13部分：假單孢菌屬的分離與計數(shù)Microbiologicalexaminationformilkandmilkproductshygiene2010-05-27發(fā)布2010-12-01實施國家質(zhì)最監(jiān)督檢驗檢疫總局I--第4部分：嗜冷菌微生物菌落計數(shù)； ---第8部分：普通變形桿菌和奇異變形桿菌檢驗；第10部分：阪崎腸桿菌檢驗免疫熒光法；第12部分：單核細胞增生李斯特氏菌檢測與計數(shù)；本部分是SN/T2552的第13部分。本部分按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草本部分參照了ISO13720:1995《肉及肉制品假單胞菌屬計數(shù)方法》(Meatandmeatproducts-EnumerationofPseudomonasspp.)。本部分由國家認證認可監(jiān)督管理委員會提出并歸口。1乳及乳制品衛(wèi)生微生物學檢驗方法第13部分：假單孢菌屬的分離與計數(shù)SN/T2552的本部分規(guī)定了乳及乳制品中假單孢菌屬的分離與計數(shù)方法。本部分適用于乳及乳制品中假單孢菌屬的分離與計數(shù)。下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文SN/T2552.1乳及乳制品衛(wèi)生微生物學檢驗方法第1部分：取樣指南SN/T2552.2乳及乳制品衛(wèi)生微生物學檢驗方法第2部分：檢驗樣品的制備與稀釋下列術(shù)語和定義適用于本文件。假單孢菌屬Pseudomonasspp.4.1樣品處理如果樣品為液體，平行接種一定數(shù)量試驗樣品于固體選擇性平板；如果樣品為固制成懸液，接種樣品后于25℃下需氧培養(yǎng)48h。從平板上挑取菌落經(jīng)氧化酶試驗和克氏雙糖鐵試驗確證后，計算獲得每毫升、每克樣品中假單孢菌5.1水浴箱：水溫45.5℃±0.2℃。5.2溫度計：量程1℃~55℃,分刻度0.1℃5.3培養(yǎng)箱：35℃~37℃和24℃~26℃5.4吸管：1mL、5mL和10mL,分刻度0.1mì,。5.5“L”型玻璃涂布棒：直徑3mm～4mm,可涂布45mm～55mm的區(qū)域。5.7天平：量程2kg,靈敏度0.1g。2克氏雙糖鐵試驗氧化酶試驗克氏雙糖鐵試驗氧化酶試驗5.9樣品稀釋瓶：100mL、125mL、160m1.、25cm1.和2I.樣品稀釋瓶。6培養(yǎng)基和試劑6.2營養(yǎng)瓊脂(NA):見附錄A第A.2章6.5API20NE生化鑒定試劑盒或類似產(chǎn)品注：API20NE是由法國生物梅里埃公司提供的產(chǎn)品的商品名，給出這一信息是為了方便本部分的使用者，并不表示對該產(chǎn)品的認可。如果其他等效產(chǎn)品具有相同的效果，則可使用這些等效產(chǎn)品。7假單孢菌屬檢驗方法乳及乳制品中假單孢菌是通過選擇性分離、生化鑒定等方法對乳及乳制品中可能存在的假單孢菌進行定性和定量的檢驗。假單孢菌屬檢驗程序見圖1。樣品25g(25ml)90mL火菌生理鹽水(DW)25℃土1℃48h挑選可疑菌落.接種紫養(yǎng)瓊脂平板25(±」℃24h假單孢菌屬認定試驗菌體形態(tài)為桿狀.動力陽性，在空氣中生長而厭氧條件下不生長，接觸酶、氧化酶陽性分解葡萄糖.O-F試驗為氧化型API20NE或其他生化鑒定系統(tǒng)1報告結(jié)果圖1假單孢菌屬檢驗程序38檢驗步驟8.1制備樣品取樣按照SN/T2552.1執(zhí)行。無菌稱取樣品25g(或mL)加入500mL樣品稀釋瓶中，加入225mL滅菌鹽水(1:10稀釋),或者將樣品直接稱最到裝有225mL.滅菌生理鹽水的樣品稀釋瓶中，振搖使樣品充分混勻，混合均勻后，取10ml,懸浮液干90mL.滅菌鹽水(1:100稀釋)進行稀釋，必要時采用相同方法進一步10倍稀釋。其他乳制品在制樣時按SN/T2552.2進行。8.2接種樣品取兩個CFC瓊脂平板，分別移取初始懸液0.1ml.用滅菌玻璃涂布棒涂布于該平板上，待表面干燥后翻轉(zhuǎn)平板于25℃±1℃培養(yǎng)48h。對系列10倍稀釋液用同樣方法操作。8.3假單孢菌屬的計數(shù)和菌落選擇培養(yǎng)48h后，對平板進行菌落計數(shù)，保留菌落在15個～300個范圍的平板，從每塊平板上隨機選擇5個可疑菌落。從平板上挑取5個菌落劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平板，25℃培養(yǎng)24h,選擇菌落進行生化反應(yīng)確認試驗。按附錄A配方將試劑溶于蒸餾水中(用前配制),待溶解后，用該試劑將濾紙潤濕，用塑料材質(zhì)或鉑絲制成的接種針挑取菌落涂于濾紙條上在5s…10s內(nèi)觀察顏色反應(yīng)，如果出現(xiàn)紫色即為陽性，反之為陰性。商品化試劑按使用說明操作。挑取進行氧化酶試驗的相同菌落在斜面劃線，并穿刺于克氏雙糖鐵底部，25℃培養(yǎng)24h。假單孢菌屬細菌為氧化酶陽性，且僅在克氏雙糖鐵試管斜面生長。8.4.3其他鑒別試驗可進行符合假單孢菌屬生物學特性的七項認定試驗：菌體形態(tài)為桿狀，動力陽性，在空氣中生長而也可應(yīng)用API20NE生化鑒定試劑或其他相當生化鑒定系統(tǒng)進行鑒定。 (1)A挑選的可疑菌落數(shù)(5個);4b--可疑菌落中與標準一致的菌落數(shù)C--平板上總菌數(shù)。用式(2)計算樣品中所含假單孢菌數(shù)： N——樣品中所含假單孢菌數(shù)Za-~-所有保留平板上經(jīng)過鑒定的假單孢菌屬數(shù)量之和；V---每塊平板接種液體積n?-—第1個稀釋度保留平板的數(shù)量：n?-第2個稀釋度保留平板的數(shù)量；經(jīng)生化鑒定確認后，進行計算，報告每克(或毫升)樣品中的假單孢菌屬菌落數(shù)值，以CFU/g或5(規(guī)黃性附錄)培養(yǎng)幕和試劑A.1.1基礎(chǔ)成分酸水解酪蛋白10.0g硫酸鉀10.0g瓊脂12.0g~18.0g(取決于膠的強度)A.1.2制法將各成分加入蒸餾水中，加熱并不斷攪拌，煮沸1min,使瓊脂溶解，分裝適當?shù)娜萜鳎?21℃高壓滅十六烷三甲基溴化氨、梭鏈孢酸鈉、頭孢菌素Ⅱ瓊脂各0.1g,分別溶解于100mL蒸餾水中，過濾除菌。使用時按每100mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基(47℃下)加十六烷三甲基溴化氨1mL,梭鏈孢酸鈉1mL,頭孢菌素Ⅱ瓊脂5mL,混勻，傾注平板，用前在安全柜中半開蓋子放置30min使表面干燥，制好的平板可在0℃~5℃保存1個月。A.2.1成分蛋白胨氯化鈉瓊脂蒸餾水將各成分加入蒸餾水中，加熱煮沸，使各成分宗全溶解，于25℃下調(diào)節(jié)pH至7.0±0.2。121℃滅菌20min備用。A.3.1成分6酵母浸粉胰酪胨氯化鈉乳糖葡萄糖硫酸亞鐵銨[FeSO?(NH?)?SO·6H:Oj硫代硫酸鈉[Na?S?O?·5H?O]酚紅瓊脂蒸餾水A.3.2