90天重復(fù)劑量吸入毒性試驗(yàn)方法

附件1090天重復(fù)劑量吸入毒性試驗(yàn)方法90-DayInhalationToxicityStudy1范圍本規(guī)范規(guī)定了嚙齒類動(dòng)物90天重復(fù)劑量吸入毒性試驗(yàn)的基本原則、要求和方法。本規(guī)范適用于單一物質(zhì)化妝品原料的90天重復(fù)劑量吸入毒性的評(píng)價(jià)。2試驗(yàn)?zāi)康膶?duì)于有長期反復(fù)吸入暴露可能的化妝品原料，需進(jìn)行90天重復(fù)劑量吸入毒性試驗(yàn)。通過該試驗(yàn)不僅可獲得一定時(shí)期內(nèi)反復(fù)吸入受試物后引起的健康效應(yīng)、受試物作用靶器官和受試物體內(nèi)蓄積能力資料，并可估計(jì)吸入的無有害作用水平，后者可用于人群吸入的定量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。3定義3.190天重復(fù)劑量吸入毒性90-dayinhalationtoxicity是指在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部分生存期（90d）內(nèi)，每日或反復(fù)多次通過吸入途徑接觸受試物后所引起的不良反應(yīng)。3.2氣溶膠aerosol懸浮在空氣中具有可以忽略下降速度/沉降速度的固態(tài)、液態(tài)或固液態(tài)混合顆粒狀物質(zhì)。3.3空氣動(dòng)力學(xué)直徑aerodynamicequivalentdiameter(AD)用以描述氣溶膠顆粒的大小。當(dāng)氣溶膠顆粒與不同直徑標(biāo)準(zhǔn)單位密度（1.0g/cm3）球形顆粒中某一顆粒的終端沉降速度相同時(shí)，該標(biāo)準(zhǔn)球形顆粒的直徑即為空氣動(dòng)力學(xué)直徑。其計(jì)量單位為μm。3.4空氣動(dòng)力學(xué)質(zhì)量中位數(shù)直徑massmedianaerodynamicdiameter(MMAD)氣溶膠中小于和等于某一空氣動(dòng)力學(xué)直徑的顆?？傎|(zhì)量，占全部顆粒物質(zhì)量50%時(shí)，該直徑即為空氣動(dòng)力學(xué)質(zhì)量中位數(shù)直徑。3.5幾何標(biāo)準(zhǔn)差geometricstandarddeviation(GSD)用以描述氣溶膠顆粒大小的分布狀態(tài)。以撞擊器各級(jí)累積百分比為Y軸、粒徑為X軸擬合對(duì)數(shù)概率曲線，以累積百分比84.1%對(duì)應(yīng)的粒徑除以累積百分比50%的粒徑，即為幾何標(biāo)準(zhǔn)差。3.6理論濃度nominalconcentration制備氣溶膠消耗受試物的量除以通過暴露系統(tǒng)的空氣總體積。3.7實(shí)際濃度analyticalconcentration暴露系統(tǒng)中動(dòng)物呼吸區(qū)經(jīng)采樣分析獲得的氣溶膠濃度。3.8口鼻暴露nose-only即僅頭部、鼻部、鼻口部暴露的暴露模式，試驗(yàn)過程中將動(dòng)物置于相應(yīng)固定器內(nèi)進(jìn)行吸入暴露。3.9全身暴露whole-body將動(dòng)物置于封閉的染毒柜或腔體內(nèi)進(jìn)行吸入暴露的暴露模式。3.10未觀察到有害作用的濃度水平noobservedadverseeffectsconcentration(NOAEC)在規(guī)定的吸入試驗(yàn)條件下，用現(xiàn)有的技術(shù)手段或檢測(cè)指標(biāo)未觀察到任何與受試物有關(guān)的毒性作用的最大濃度。3.11觀察到有害作用的最低濃度水平lowestobservedadverseeffectsconcentration(LOAEC)在規(guī)定的吸入試驗(yàn)條件下，受試物引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物組織形態(tài)、功能、生長發(fā)育等有害效應(yīng)的最低濃度。4試驗(yàn)的基本原則在90d的染毒期內(nèi)，受試物以不同暴露濃度吸入給予各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，每周染毒5d或7d，每組采用一個(gè)吸入濃度染毒。染毒期間每日觀察動(dòng)物的毒性反應(yīng)。在染毒期間死亡的動(dòng)物要進(jìn)行稱重和尸檢。染毒結(jié)束后，處死存活動(dòng)物，進(jìn)行尸檢、臨床檢查、支氣管肺泡灌洗檢查以及適當(dāng)?shù)牟±斫M織學(xué)檢查，以評(píng)估受試物產(chǎn)生的吸入毒性作用。5試驗(yàn)方法5.1受試物受試物可分為氣態(tài)受試物、沸點(diǎn)較低易揮發(fā)的液態(tài)受試物、高沸點(diǎn)不易揮發(fā)液態(tài)受試物、粉狀或固體受試物。試驗(yàn)時(shí)將受試物制備成何種物態(tài)（氣體、蒸氣、氣溶膠）取決于受試物的理化性質(zhì)、設(shè)定的濃度和/或按照實(shí)際加工使用期間的物理狀態(tài)等。吸濕性的及會(huì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的受試物，在試驗(yàn)中需保證所用空氣干燥，某些受試物經(jīng)超聲霧化時(shí)會(huì)產(chǎn)熱，應(yīng)注意選擇適合的發(fā)生裝置。5.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和飼養(yǎng)環(huán)境5.2.1動(dòng)物種系的選擇常規(guī)選擇嚙齒類動(dòng)物，首選大鼠。一般選用7周~9周齡的成年大鼠。試驗(yàn)開始時(shí)動(dòng)物體重的差異應(yīng)不超過平均體重的±20%。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)符合國家相應(yīng)規(guī)定。5.2.2動(dòng)物的性別和數(shù)量每一濃度組及陰性（溶媒）對(duì)照組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物至少應(yīng)有30只（雌雄各半）。其中主試驗(yàn)組20只，追蹤觀察組10只?？紤]到重復(fù)劑量吸入毒性試驗(yàn)的重要性，應(yīng)適當(dāng)增加每組動(dòng)物數(shù)。若計(jì)劃在試驗(yàn)過程中處死動(dòng)物觀察毒性反應(yīng)，應(yīng)增加計(jì)劃處死的動(dòng)物數(shù)。若考慮在試驗(yàn)期間增加影響動(dòng)物健康的試驗(yàn)操作（如毒代動(dòng)力學(xué)研究等），則應(yīng)另設(shè)衛(wèi)星組，增加相應(yīng)動(dòng)物數(shù)僅用于滿足這部分的研究需要，并不進(jìn)行毒理學(xué)評(píng)價(jià)。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)的動(dòng)物數(shù)需達(dá)到能夠有效評(píng)價(jià)受試物毒性作用的數(shù)量。追蹤觀察組動(dòng)物在全程染毒結(jié)束后繼續(xù)觀察一段時(shí)間（一般不少于28d），以了解毒性作用的持續(xù)性、可逆性或遲發(fā)毒作用。5.2.3試驗(yàn)前動(dòng)物準(zhǔn)備染毒開始前至少要有5d時(shí)間使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)環(huán)境。如動(dòng)物擬采用口鼻暴露方式染毒，動(dòng)物還需提前適應(yīng)口鼻暴露時(shí)所用的固定器。5.2.4飼養(yǎng)環(huán)境實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房應(yīng)符合國家相應(yīng)規(guī)定。選用標(biāo)準(zhǔn)配合飼料，飲水不限制。當(dāng)動(dòng)物吸入染毒時(shí)間超過6h，則需在染毒期間以適合方式給動(dòng)物喂食，并提供飲水。當(dāng)動(dòng)物采用全身暴露方式染毒時(shí)，每只動(dòng)物在暴露期間應(yīng)處在獨(dú)立的空間，以防止動(dòng)物聚集趴臥，其被毛吸附受試物氣溶膠，影響動(dòng)物吸入受試物的量。5.3分組試驗(yàn)通常包括三個(gè)暴露水平的受試物和一個(gè)陰性/溶媒對(duì)照。陰性/溶媒對(duì)照組動(dòng)物暴露于潔凈空氣或溶媒，溶媒應(yīng)盡可能采用水，采用其他溶媒進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道或預(yù)試驗(yàn)確認(rèn)所采用溶媒無吸入毒性，否則應(yīng)同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組和溶媒對(duì)照組，對(duì)照組的其他條件均與受試物組相同。最大吸入暴露水平的設(shè)計(jì)應(yīng)在引起中毒效應(yīng)的前提下又不致造成動(dòng)物過多死亡，低暴露水平組應(yīng)不低于人群的實(shí)際吸入暴露水平，且不出現(xiàn)任何毒性作用，中間暴露水平組應(yīng)引起較輕的可觀察到的毒性作用。吸入試驗(yàn)中動(dòng)物暴露水平通常以吸入暴露量表述，當(dāng)受試物發(fā)生后為氣溶膠時(shí)，動(dòng)物吸入的氣溶膠的量可根據(jù)試驗(yàn)周期中測(cè)得氣溶膠濃度、每分鐘通氣量、暴露時(shí)間計(jì)算求得。計(jì)算公式如下：DD=C×RMV×D/BWRMV=0.608×BW0.852式中：DD為吸入暴露量（mg/Kg）；C為吸入氣溶膠濃度（mg/L）；RMV為動(dòng)物每分鐘通氣量（L/min），D為暴露時(shí)間（min），BW為平均體重（kg）。每分鐘通氣量可采用實(shí)際檢測(cè)動(dòng)物的每分鐘通氣量計(jì)算。也可以動(dòng)物平均體重代入經(jīng)驗(yàn)公式得出動(dòng)物理論每分鐘通氣量。5.4吸入暴露條件5.4.1吸入暴露方式首選的暴露方式為口鼻暴露，為滿足特定的研究目的（如便于染毒中觀察動(dòng)物反應(yīng)），也可采用全身暴露方式染毒，但應(yīng)在試驗(yàn)報(bào)告中予以闡釋說明。采用口鼻暴露方式染毒時(shí)，所選用的固定器應(yīng)不對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生額外的應(yīng)激，應(yīng)注意與動(dòng)物體重大小匹配，并確保動(dòng)物在暴露過程中無法避開吸入染毒氣流。吸入裝置應(yīng)配備動(dòng)態(tài)氣流，其通風(fēng)量至少應(yīng)超過裝置里動(dòng)物總換氣量的兩倍，氧含量應(yīng)不低于19%，二氧化碳含量低于1%，并保證每只動(dòng)物暴露條件穩(wěn)定均一。如果進(jìn)入暴露系統(tǒng)的空氣體積小于流出體積時(shí)，應(yīng)防止空氣經(jīng)其他途徑進(jìn)入暴露系統(tǒng)使受試物氣溶膠稀釋。染毒過程中應(yīng)使裝置內(nèi)保持輕度負(fù)壓，防止受試物泄露到外部環(huán)境中。采用全身暴露方式染毒時(shí)，吸入裝置需配備動(dòng)態(tài)氣流，每小時(shí)換氣約12次~15次，應(yīng)保證染毒柜內(nèi)氧含量不低于19%，二氧化碳含量低于1%，染毒柜內(nèi)應(yīng)密閉，以防止受試物泄露到外部環(huán)境中。為保證受試物氣溶膠均勻分散，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物所占的總體積應(yīng)不超過染毒柜體積的5%。5.4.2吸入暴露濃度受試物通常設(shè)定三個(gè)吸入暴露濃度進(jìn)行試驗(yàn)。若沒有足夠的信息指導(dǎo)受試物暴露濃度設(shè)定，應(yīng)采用預(yù)試驗(yàn)得到盡可能多的受試物毒性信息，為正式試驗(yàn)的受試物吸入濃度設(shè)定提供依據(jù)。在缺乏限值數(shù)據(jù)支持的情況下，可參考全球化學(xué)品統(tǒng)一分類和標(biāo)簽制度（GHS）第4類的上限值，將氣溶膠最大濃度設(shè)為5mg/L，蒸氣的最大濃度設(shè)為20mg/L，氣體最大濃度設(shè)為20000ppm。5.4.3吸入染毒頻率染毒期間，動(dòng)物每日吸入染毒1次，每周吸入染毒5d或7d。5.4.4吸入染毒時(shí)間原則上，各組動(dòng)物吸入染毒時(shí)間應(yīng)一致，當(dāng)采用調(diào)整吸入染毒時(shí)間來區(qū)分各組暴露水平時(shí)，各組吸入染毒時(shí)間相差不應(yīng)太長，否則需要考察染毒時(shí)間不一致對(duì)動(dòng)物的影響。采用口鼻暴露方式時(shí)，大鼠的吸入染毒時(shí)間應(yīng)不超過6h，小鼠的吸入染毒時(shí)間應(yīng)不超過4h。采用全身暴露方式時(shí)，動(dòng)物的染毒時(shí)間應(yīng)不少于6h，最長不超過22h。如確需超過上述時(shí)間限制，應(yīng)在試驗(yàn)報(bào)告中予以闡釋說明。5.5暴露條件的監(jiān)測(cè)5.5.1濃度監(jiān)測(cè)試驗(yàn)期間為保證實(shí)際濃度的穩(wěn)定性，可以使用實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)設(shè)備（如氣溶膠光度計(jì)），或定期通過特異性的方法（如采用撞擊器吸附或化學(xué)反應(yīng)的原理直接采樣，然后進(jìn)行化學(xué)分析），或非特異性的方法如濾膜采樣法來測(cè)定呼吸區(qū)或染毒柜內(nèi)氣溶膠濃度，以證明暴露條件的穩(wěn)定性。濃度波動(dòng)范圍規(guī)定：氣體或揮發(fā)性受試物不得超過平均濃度±10%；液體或固體氣溶膠不得超過平均值的±20%。5.5.2粒徑監(jiān)測(cè)氣溶膠顆粒的空氣動(dòng)力學(xué)粒徑?jīng)Q定了在重力作用下顆粒在呼吸道中的沉降情況；氣溶膠顆?？諝鈩?dòng)力學(xué)直徑的幾何標(biāo)準(zhǔn)差（GSD）代表氣溶膠粒度分布范圍，其值越大代表粒子分布較廣。為了使動(dòng)物整個(gè)呼吸道充分暴露于受試物中，推薦的氣溶膠顆?？諝鈩?dòng)力學(xué)中值直徑（MMAD）數(shù)值應(yīng)不大于2μm，GSD通常應(yīng)介于1~3之間?？刹捎没谫|(zhì)量檢測(cè)的碰撞法，基于激光飛行法的光學(xué)方法或其它替代方法定期對(duì)呼吸區(qū)或染毒柜中的氣溶膠粒徑進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算GSD值。如在整個(gè)試驗(yàn)周期中采用替代方法進(jìn)行粒徑分析時(shí)，需驗(yàn)證替代方法所得結(jié)果與碰撞法一致。5.5.3暴露裝置內(nèi)氣流通過染毒柜或口鼻暴露系統(tǒng)的氣流速率需嚴(yán)格控制，應(yīng)在每次暴露期間盡可能連續(xù)監(jiān)測(cè)并每小時(shí)記錄1次。5.5.4暴露系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境監(jiān)測(cè) 暴露系統(tǒng)內(nèi)溫度維持在22℃±3℃，口鼻暴露和全身暴露系統(tǒng)都需監(jiān)測(cè)記錄動(dòng)物呼吸區(qū)的相對(duì)濕度，應(yīng)在每次暴露期間盡可能連續(xù)監(jiān)測(cè)并每小時(shí)記錄1次。理想的相對(duì)濕度一般在30%~70%，但在某些情況下，可能無法達(dá)到（例如在測(cè)試水溶液型受試物時(shí)），應(yīng)在試驗(yàn)報(bào)告中予以闡釋說明。氧氣的濃度不低于19%，二氧化碳的濃度不超過1%。5.6臨床觀察染毒期間應(yīng)每天觀察，染毒結(jié)束后，追蹤觀察組還應(yīng)繼續(xù)觀察至追蹤觀察期結(jié)束。對(duì)動(dòng)物的任何毒性表現(xiàn)均應(yīng)記錄，記錄內(nèi)容包括發(fā)生時(shí)間、程度和持續(xù)時(shí)間。觀察應(yīng)至少包括如下內(nèi)容：皮膚和被毛的改變、眼和粘膜變化、呼吸、循環(huán)、植物神經(jīng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肢體運(yùn)動(dòng)和行為模式等改變。可通過測(cè)量直腸溫度為反射性呼吸遲緩、C-纖維刺激反射、受試物暴露或密閉引起的動(dòng)物體溫變化（低溫/高熱）提供依據(jù)。應(yīng)在首次染毒前（第0天）記錄動(dòng)物體重，此后每周2次測(cè)定動(dòng)物體重，如前4周發(fā)現(xiàn)染毒對(duì)動(dòng)物體重沒有影響，則可在剩余的研究中每周1次測(cè)定動(dòng)物體重。應(yīng)測(cè)定每周飼料消耗量。還可根據(jù)研究需要，增加其他觀察指標(biāo)，如生物監(jiān)測(cè)(尿液/糞便收集)、肺功能評(píng)估和行為學(xué)分析等。5.7臨床檢查5.7.1眼科檢查在染毒前，應(yīng)對(duì)所有動(dòng)物的眼底、屈光介質(zhì)、虹膜和結(jié)膜進(jìn)行眼科檢查。并在末次染毒后及追蹤觀察期結(jié)束時(shí)對(duì)所有高濃度組和對(duì)照組進(jìn)行檢查，如果發(fā)現(xiàn)眼睛有變化，則應(yīng)擴(kuò)展至其他濃度組及衛(wèi)星組的所有動(dòng)物。5.7.2血液檢查在染毒結(jié)束及追蹤觀察期結(jié)束時(shí)應(yīng)測(cè)定各濃度組和對(duì)照組動(dòng)物的紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白、紅細(xì)胞容積、平均紅細(xì)胞容積、平均紅細(xì)胞血紅蛋白、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度、網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)及其分類、血小板計(jì)數(shù)、凝血潛力（如凝血酶原時(shí)間、凝血時(shí)間、活化部分凝血活酶時(shí)間，至少測(cè)定一項(xiàng)）等指標(biāo)。5.7.3臨床血液生化檢查在染毒結(jié)束及追蹤觀察期結(jié)束時(shí)對(duì)各濃度組和對(duì)照組動(dòng)物進(jìn)行，檢查指標(biāo)包括電解質(zhì)平衡、碳水化合物代謝、肝、腎功能?？筛鶕?jù)受試物作用形式選擇其他特殊檢查。檢測(cè)指標(biāo)包括：氯、鈉、鉀、鈣、磷、禁食血糖（不同動(dòng)物品系采用不同的禁食期）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、堿性磷酸酶、尿素氮、白蛋白、肌酐、總膽紅素、總蛋白、球蛋白、總膽固醇及甘油三酯。必要時(shí)可根據(jù)所觀察到的毒性作用進(jìn)行其他更大范圍的臨床生化檢查，以便進(jìn)行全面的毒性評(píng)價(jià)，檢測(cè)指標(biāo)可包括膽堿酯酶、脂質(zhì)、激素、酸堿平衡、甲基苯丙胺或亨氏體、肌酸激酶、骨髓細(xì)胞學(xué)、肌鈣蛋白、乳酸脫氫酶、谷氨酸脫氫酶或γ谷氨酰轉(zhuǎn)肽等。5.7.4尿液檢查一般不需要進(jìn)行，只有當(dāng)懷疑存在或觀察到相關(guān)毒性作用時(shí)方需進(jìn)行尿液檢查。常規(guī)指標(biāo)包括：外觀（顏色和濁度）、尿液量、比重或滲透壓、酸堿度、尿糖、尿蛋白、潛血。5.7.5支氣管肺泡灌洗（bronchoalveolarlavage,BAL）檢查在染毒結(jié)束及追蹤觀察期結(jié)束時(shí)進(jìn)行，解剖各濃度組和對(duì)照組動(dòng)物取肺臟，整肺稱重后結(jié)扎左肺用于組織病理學(xué)檢查，右肺進(jìn)行BAL檢查，BAL液推薦檢查指標(biāo)包括：乳酸脫氫酶、總蛋白或白蛋白及肺泡巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的計(jì)數(shù)和分類。必要時(shí)分析堿性磷酸酶、炎癥相關(guān)細(xì)胞因子/趨化因子等參數(shù)。對(duì)于難溶性固體氣溶膠受試物，追蹤觀察期結(jié)束雄性動(dòng)物右肺如需用于肺負(fù)荷的測(cè)定，可僅對(duì)雌性動(dòng)物右肺進(jìn)行BAL檢查。BAL液分析通常作為組織病理學(xué)檢查的結(jié)果的補(bǔ)充，但不能替代組織病理學(xué)檢查。5.7.6其他檢查指標(biāo)如果認(rèn)為有助于了解受試物的吸入毒性（包括恢復(fù)），可根據(jù)研究需要，增加額外的檢測(cè)指標(biāo)，如肺負(fù)荷，血氧參數(shù)等。肺負(fù)荷：對(duì)于難溶性固體受試物，通常采用衛(wèi)星組的形式，在吸入染毒結(jié)束24h內(nèi)及染毒結(jié)束后數(shù)周的另外2個(gè)時(shí)間點(diǎn)，取右肺測(cè)定肺組織中的受試物含量，通常選用雄性動(dòng)物。血氧分析：一般在吸入染毒結(jié)束后即刻采樣，檢測(cè)指標(biāo)有高鐵血紅蛋白、一氧化碳結(jié)合血紅蛋白等。5.8病理檢查5.8.1大體尸檢主試驗(yàn)組和追蹤觀察組動(dòng)物及試驗(yàn)期間非計(jì)劃死亡或?yàn)l死動(dòng)物均應(yīng)盡可能取血后，進(jìn)行全面的大體尸檢，記錄每只動(dòng)物外觀、所有孔道，胸腔、腹腔及其內(nèi)容物的大體病理變化，特別注意呼吸道的任何變化。肺、肝、腎、腎上腺、睪丸、子宮、卵巢、胸腺、脾、腦和心臟應(yīng)在分離后盡快稱重以防水分丟失。應(yīng)將下列組織和器官保存在固定液中，以備日后進(jìn)行病理組織學(xué)檢查：所有大體解剖呈現(xiàn)異常的器官、腦（包括延髓/腦橋、小腦和大腦皮層）、嗅球、眼（視網(wǎng)膜、視神經(jīng)）及眼瞼、脊髓（包括頸椎、胸椎、腰椎）、鼻咽組織（至少4層，1層包括鼻咽管和鼻腔相關(guān)淋巴組織）、喉（包括會(huì)厭基底層在內(nèi)的3層）、氣管（至少2層，包括1個(gè)通過肺外支氣管分叉處隆凸的縱切面和1個(gè)橫切面）、甲狀腺、胸腺、左肺（包括主支氣管和胸膜）a、心臟、肝、脾、腎、腎上腺、睪丸、精囊、卵巢、子宮、食管、胃、膀胱、骨髓（和/或新鮮抽取物）、肺門淋巴結(jié)b（特別是對(duì)于難溶性固體受試物）和淋巴結(jié)（給藥部位遠(yuǎn)端）。a也可使用右肺。b如需進(jìn)行更深入的檢查和/或以免疫學(xué)為重點(diǎn)的研究，可考