食品微生物檢驗(yàn)方法

關(guān)于食品微生物檢驗(yàn)方法內(nèi)容提要菌落總數(shù)檢測(cè)大腸菌群及大腸桿菌檢測(cè)金黃色葡萄球菌檢測(cè)沙門(mén)氏菌檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢測(cè)第2頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天菌落總數(shù)測(cè)定——菌落總數(shù)的概念菌落總數(shù)是指在被檢樣品的單位重量（g）、容積（ml）或表面積（cm2）內(nèi)，所含能于某種固體培養(yǎng)基上，在一定條件下培養(yǎng)后所生成的菌落的總數(shù)。第3頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天菌落總數(shù)測(cè)定——衛(wèi)生學(xué)意義判定食品被細(xì)菌污染的程度及衛(wèi)生質(zhì)量。及時(shí)反映食品加工過(guò)程是否符合衛(wèi)生要求，為被檢食品衛(wèi)生學(xué)評(píng)價(jià)提供依據(jù)。通常認(rèn)為，食品中細(xì)菌數(shù)量越多，則可考慮致病菌污染的可能性越大，菌落總數(shù)的多少在一定程度上標(biāo)志著食品衛(wèi)生質(zhì)量的優(yōu)劣。

第4頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天FDABAM菌落總數(shù)測(cè)定流程

檢樣xg/mL+9xml稀釋液（磷酸鹽緩沖液）適當(dāng)十倍稀釋樣品選擇2~3個(gè)連續(xù)適宜稀釋度各取1mL分別加入滅菌平皿內(nèi)（每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平行）每皿內(nèi)加入適量平板計(jì)數(shù)瓊脂（PCA）

35℃，48±2h菌落計(jì)數(shù)第5頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天FDABAM菌落計(jì)數(shù)方法選擇25~250CFU之間的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算公式如下：

N=∑C/（1*n1+0.1*n2）*d所有平板的菌落數(shù)都不足25CFU，報(bào)告EAPC/ml（g）為＜25*1/d。

EAPC：estimatedaerobicplatecount所有平板的菌落數(shù)都超過(guò)250CFU，但不足100/cm2

，報(bào)告EAPC/ml（g）為最接近250CFU的平板菌落數(shù)的估計(jì)值，乘以相應(yīng)的稀釋度。所有平板的菌落數(shù)都超過(guò)100/cm2

，計(jì)算平板的面積（直徑為90mm的平板面積為65cm2），估計(jì)最高稀釋度每cm2的菌落數(shù)，乘以相應(yīng)平板面積作為該稀釋度的菌落計(jì)數(shù)結(jié)果，報(bào)告EAPC/ml（g）為＞65*100*1/d。無(wú)法計(jì)數(shù)的平板報(bào)告LA（LaboratoryAccident）。最終結(jié)果保留前兩位有效數(shù)字。按照4舍6入，5是奇進(jìn)偶不進(jìn)。第6頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天

ISO4833-2003菌落總數(shù)測(cè)定流程

檢樣xg/mL+9xml稀釋液（磷酸鹽緩沖液）適當(dāng)十倍稀釋樣品選擇2~3個(gè)連續(xù)適宜稀釋度各取1mL分別加入滅菌平皿內(nèi)（每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平行）每皿內(nèi)加入適量（12~15mL）平板計(jì)數(shù)瓊脂（PCA），

30±1℃，72±3h菌落計(jì)數(shù)如果懷疑樣品中含有在培養(yǎng)基表面蔓延生長(zhǎng)的菌落，待瓊脂凝固后，在其上覆蓋一層（4mL）水瓊脂。平板疊放不超過(guò)6個(gè)第7頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天ISO4833-2003菌落計(jì)數(shù)方法選擇連續(xù)2個(gè)稀釋度不超過(guò)300CFU的平板，且一個(gè)平板至少含15CFU進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算公式如下：

N=∑C/（n1+0.1*n2）*d所有平板的菌落數(shù)都不足15CFU，計(jì)算2平板菌落的算術(shù)平均值m，液體樣品：NE=m

固體樣品：NE=m×d-1無(wú)菌生長(zhǎng)：液體樣品：lessthan1;固體樣品：lessthan1×d-1最終結(jié)果保留前兩位有效數(shù)字。第8頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天菌落總數(shù)測(cè)定幾點(diǎn)說(shuō)明由于檢樣中采用30/35℃有氧條件下培養(yǎng)，因而并不是樣品中實(shí)際的總活菌數(shù)，一些特殊營(yíng)養(yǎng)要求的細(xì)菌、厭氧菌、微需氧菌、以及非嗜中溫細(xì)菌，均難以反映出來(lái)。鑒于食品檢樣中的細(xì)菌細(xì)胞是以單個(gè)、成雙、鏈狀、葡萄狀或成堆的形式存在，因而在平板上出現(xiàn)的菌落可以來(lái)源于細(xì)胞塊，也可以來(lái)源于單個(gè)細(xì)胞，因而平板上所得菌落的數(shù)字不應(yīng)報(bào)告活菌數(shù)，而應(yīng)以單位重量、容積或表面積內(nèi)的菌落數(shù)或菌落形成單位（colonyformingunits，CFU）報(bào)告。第9頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天菌落總數(shù)測(cè)定幾點(diǎn)要求每個(gè)樣品從開(kāi)始稀釋到傾注最后一個(gè)平皿所用的時(shí)間不得超過(guò)15min，主要為防止細(xì)菌增殖和產(chǎn)生片狀菌落。樣液與瓊脂應(yīng)充分混合，避免將混合物濺到平皿壁和皿蓋上。皿內(nèi)瓊脂凝固后，不要長(zhǎng)時(shí)間放置，然后倒置培養(yǎng)，可避免菌落蔓延生長(zhǎng)。檢樣過(guò)程中應(yīng)用稀釋劑做空白對(duì)照，用以判定稀釋液、培養(yǎng)基、平皿或吸管可能存在的污染。同時(shí)，檢樣過(guò)程中應(yīng)在工作臺(tái)上打開(kāi)一塊空白平板計(jì)數(shù)瓊脂，其暴露時(shí)間應(yīng)與檢樣時(shí)間相當(dāng)，以了解檢樣在檢驗(yàn)操作過(guò)程中有無(wú)受到來(lái)自空氣的污染。檢樣稀釋液有時(shí)帶有食品顆粒，為避免與細(xì)菌菌落發(fā)生混淆，可作一檢樣稀釋液與平板計(jì)數(shù)瓊脂混合的平皿，不經(jīng)培養(yǎng)，于4℃放置，以便在計(jì)數(shù)檢樣時(shí)用作對(duì)照。第10頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天大腸菌群的定義大腸菌群系指一群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌。大腸菌群不是細(xì)菌學(xué)上的分類(lèi)命名，而是根據(jù)衛(wèi)生學(xué)方面的要求，提出的與糞便污染有關(guān)的細(xì)菌，即作為食品、水體等是否受過(guò)人畜糞便污染的指示菌，這些細(xì)菌在生化及血清學(xué)方面并非完全一致。根據(jù)進(jìn)一步的生化試驗(yàn)，可將這群細(xì)菌再分為大腸艾希氏菌（俗稱(chēng)大腸桿菌）、弗氏檸檬酸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和陰溝腸桿菌等。

第11頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天大腸桿菌的定義大腸桿菌（也稱(chēng)大腸埃希氏菌），分類(lèi)于腸桿菌科，歸屬于埃希氏菌屬。大腸桿菌指革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌、乳糖發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣、IMViC試驗(yàn)（靛基質(zhì)、MR、V-P、檸檬酸鹽試驗(yàn)）為++--或-+--的細(xì)菌。與人類(lèi)有關(guān)的大腸桿菌統(tǒng)稱(chēng)為致瀉性大腸桿菌，包括五種：腸毒素性大腸桿菌（ETEC）、致病性大腸桿菌（EPEC）、出血性大腸桿菌（EHEC）、侵襲性大腸桿菌（EIEC）、黏附性大腸桿菌（EAEC）。第12頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天大腸菌群和大腸桿菌的關(guān)系耐熱大腸菌群的定義：能在液體乳糖培養(yǎng)基中35/37℃培養(yǎng)48h產(chǎn)酸產(chǎn)氣，并在44.5℃培養(yǎng)24h產(chǎn)酸產(chǎn)氣的細(xì)菌（依據(jù)ISO標(biāo)準(zhǔn)）第13頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天衛(wèi)生學(xué)意義大腸菌群和大腸桿菌是評(píng)價(jià)衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標(biāo)，作為食品中的糞便污染指標(biāo)。食品中檢出大腸菌群，表明該食品有糞便污染，既可能有腸道致病菌存在，因而也就有可能通過(guò)污染的食品引起腸道傳染病的流行。大腸菌群數(shù)的高低，表明了糞便污染的程度，也反映了對(duì)人體健康危害性的大小。大腸桿菌在外界存活時(shí)間與一些主要腸道致病菌接近，它的出現(xiàn)預(yù)示著某些腸道病原菌的存在，因此該菌是國(guó)際上公認(rèn)的衛(wèi)生監(jiān)測(cè)指示菌。近年來(lái)，有些國(guó)家在執(zhí)行HACCP管理中，將大腸桿菌檢測(cè)作為微生物污染狀況的監(jiān)測(cè)指標(biāo)和HACCP實(shí)施效果的評(píng)估指標(biāo)。第14頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天大腸桿菌的生物學(xué)特性基本形態(tài)：

此菌為兩端鈍圓的短小桿菌，一般約0.5-0.8μm*1.0-3.0μm，多單獨(dú)存在或成雙，但不呈長(zhǎng)鏈排列。約50%的菌株有周生鞭毛，但多數(shù)只有1-4根，一般不超過(guò)10根，故菌體動(dòng)力弱。多數(shù)菌株有菌毛，有的有莢膜或微莢膜，不形成芽孢，對(duì)普通堿性染料著色良好，革蘭氏染色陰性。第15頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天大腸桿菌的生物學(xué)特性培養(yǎng)特性：大腸桿菌合成代謝能力強(qiáng)，在含無(wú)機(jī)鹽、銨鹽、葡萄糖的普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好。最適生長(zhǎng)溫度為37℃，在42-44℃條件下仍能生長(zhǎng)，生長(zhǎng)溫度范圍15-46℃。

在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂上有3中菌落形態(tài)：

1）光滑型：菌落邊緣整齊，表面有光澤、濕潤(rùn)、光滑、呈灰色，在生理鹽水中易分散；

2）粗糙型：菌落扁平、干澀、邊緣不整齊，易在生理鹽水中自凝；

3）黏液型：常為含有莢膜的菌株。第16頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天大腸菌群及大腸桿菌測(cè)定

——MPN法檢驗(yàn)流程（FDABAM）

檢樣50g+450ml稀釋液適當(dāng)十倍稀釋樣品選擇3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度的樣品稀釋液，每個(gè)稀釋度接種三管LST肉湯（每管9mlLST肉湯并加有導(dǎo)管），每管接種1mL35℃，24±2h~48±2h

沒(méi)有產(chǎn)氣管有產(chǎn)氣管報(bào)告陰性接種BGLB肉湯管接種EC肉湯

35±℃，48±2h44.5±0.5℃（水浴培養(yǎng)）

24±2h~48±2h

查MPN表報(bào)告結(jié)果產(chǎn)氣管接種EMB平板（35℃、18~24h）

（大腸菌群）從EMB平板上挑取5個(gè)可疑菌轉(zhuǎn)接到PCA斜面，進(jìn)行革蘭氏染色、IMVC生化鑒定、接種LST復(fù)檢產(chǎn)氣查MPN表報(bào)告結(jié)果（大腸桿菌）

第17頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天大腸菌群測(cè)定——MPN法檢驗(yàn)幾點(diǎn)說(shuō)明MPN檢索表：

MPN為最大可能數(shù)(MostProbableNumber)的簡(jiǎn)稱(chēng)。這種方法，對(duì)樣品進(jìn)行連續(xù)系列稀釋?zhuān)尤肱囵B(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，從規(guī)定的反應(yīng)呈陽(yáng)性管數(shù)的出現(xiàn)率，用概率論來(lái)推算樣品中菌數(shù)最近似的數(shù)值。MPN檢索表只給了三個(gè)稀釋度，如改用不同的稀釋度，則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低或增加10倍。初發(fā)酵和證實(shí)試驗(yàn)：

1）兩步法進(jìn)行了兩次乳糖發(fā)酵試驗(yàn)。初發(fā)酵和證實(shí)實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基不同，但都是為了證實(shí)培養(yǎng)物是否符合大腸菌群的定義，即“在37℃分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣”。LST中提供了磷酸鹽緩沖體系，氯化鈉可維持滲透壓，月桂基硫酸鈉可抑制非大腸菌群的生長(zhǎng)，這個(gè)緩沖蛋白胨乳糖肉湯允許“緩慢乳糖發(fā)酵（Slowlactosefermentations）”來(lái)促進(jìn)菌體產(chǎn)氣。BGLB中膽鹽和煌綠可以抑制革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和除了大腸菌群的很多革蘭氏陰性細(xì)菌。

2）初發(fā)酵陽(yáng)性管，不能肯定就是大腸菌群細(xì)菌，經(jīng)過(guò)證實(shí)試驗(yàn)后，有時(shí)可能成為陰性。有數(shù)據(jù)表明，食品中大腸菌群檢驗(yàn)步驟的符合率，初發(fā)酵與證實(shí)試驗(yàn)相差較大。因此，在實(shí)際檢測(cè)工作中，證實(shí)試驗(yàn)是必需的。產(chǎn)氣量與倒管：在乳糖發(fā)酵試驗(yàn)工作中，經(jīng)常可以看到在發(fā)酵倒管內(nèi)極微少的氣泡（有時(shí)比小米粒還?。?，有時(shí)可以遇到在初發(fā)酵時(shí)產(chǎn)酸或沿管壁有緩緩上浮的小氣泡。實(shí)驗(yàn)表明，大腸菌群的產(chǎn)氣量，多者可以使發(fā)酵倒管全部充滿(mǎn)氣體，少者可以產(chǎn)生比小米粒還小的氣泡。如果對(duì)產(chǎn)酸但未產(chǎn)氣的乳糖發(fā)酵如有疑問(wèn)時(shí)，可以用手輕輕打動(dòng)試管，如有氣泡沿管壁上浮，即應(yīng)考慮可能有氣體產(chǎn)生，而應(yīng)作進(jìn)一步試驗(yàn)。

第18頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天大腸桿菌測(cè)定——EMB選擇性分離鑒別EMB平板典型大腸桿菌菌落特征：中心黑色或紫紅色，有或無(wú)綠色金屬光澤第19頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天大腸桿菌測(cè)定——EMB選擇性分離鑒別EMB是一種弱選擇性培養(yǎng)基，一些球菌也可在該培養(yǎng)基上生長(zhǎng)；高壓滅菌可使得美藍(lán)還原從而使培養(yǎng)基的顏色呈不均一橘黃色，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)基可以恢復(fù)原有的正常紫色，傾注平板前應(yīng)先搖勻；大腸桿菌在該培養(yǎng)基上并不一定總是呈現(xiàn)綠色的金屬光澤；該培養(yǎng)基受可見(jiàn)光易使其中的成分氧化，儲(chǔ)存及培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)都應(yīng)在避光條件。菌名菌落形態(tài)大腸埃希氏菌紫黑色，有綠色金屬光澤肺炎克雷伯氏菌粉色，中心色深陰溝腸桿菌粉色，中心色深弗氏志賀氏菌無(wú)色鼠傷寒沙門(mén)氏菌無(wú)色糞鏈球菌無(wú)色第20頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天大腸桿菌測(cè)定——革蘭氏染色基本原理：革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中廣泛使用的一種重要的鑒別染色法。1884年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立。此法可將細(xì)菌分為革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌兩大類(lèi)。革蘭氏染色的機(jī)理主要是利用兩類(lèi)細(xì)菌的細(xì)胞壁成分和結(jié)構(gòu)的不同。革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁中含有較多的類(lèi)脂質(zhì)，而肽聚糖的含量較少。當(dāng)用酒精或丙酮酸脫色時(shí)，類(lèi)脂質(zhì)被溶解，增加了細(xì)胞壁的通透性，使初染后的結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物易于滲出，結(jié)果細(xì)胞被脫色，經(jīng)復(fù)染后，又染上復(fù)染液的顏色。而革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁中肽聚糖的含量多而且交聯(lián)度大，類(lèi)脂質(zhì)含量少，經(jīng)乙醇或丙酮洗脫后，肽聚糖層的孔徑變小，通透性降低，因此細(xì)胞仍保留初染時(shí)的顏色。第21頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天大腸桿菌測(cè)定——革蘭氏染色GramnegativeGrampositiveGramstraining第22頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天大腸桿菌測(cè)定——革蘭氏染色基本步驟：將涂片在火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染液，染1min，水洗；滴加革蘭氏碘液，作用1min，水洗；滴加95%乙醇脫色約15～30s,直至染色液被洗掉，不要過(guò)分脫色，水洗；滴加番紅復(fù)染液，復(fù)染1min，水洗、待干、鏡檢。結(jié)果：革蘭氏陽(yáng)性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。第23頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天大腸桿菌測(cè)定——生化鑒定Testpositivenegativebiotype1biotype2reagentIndole紅色環(huán)不變色+-Kovacs’MR紅色不變色++甲基紅V-P玫瑰紅色環(huán)不變色--V-P甲、乙液Citrate生長(zhǎng)不生長(zhǎng)---第24頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天IMViC生化試驗(yàn)第25頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天金黃色葡萄球菌——概述根據(jù)《伯杰氏鑒定細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》，按葡萄球菌的生理化學(xué)組成，將葡萄球菌分為金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)和腐生葡萄球菌(S.saprophyticus)，其中金葡多為致病性菌，表葡偶爾致病。金黃色葡萄球菌是人類(lèi)化膿性感染中最常見(jiàn)的病原菌?？梢鹁植炕撔愿腥荆绨X、癰、皮下膿腫、外科切口及燒傷創(chuàng)面的感染；也可引起肺炎、偽膜性腸炎、腎盂腎炎、心包炎等多系統(tǒng)的化膿性感染；還可引起敗血癥、膿毒癥等全身性感染。葡萄球菌的致病力強(qiáng)弱主要取決于其產(chǎn)生的毒素和侵襲性酶。

第26頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天金黃色葡萄球菌——生物學(xué)特性金黃色葡萄球菌呈球形，直徑0.8μm左右，排列成葡萄串狀，無(wú)芽孢，無(wú)莢膜。革蘭氏染色陽(yáng)性，但衰老、死亡或被白細(xì)胞吞噬的菌體，常呈革蘭氏陰性。第27頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天金黃色葡萄球菌——生長(zhǎng)特性金黃色葡萄球菌在肉湯中呈渾濁生長(zhǎng)，在胰酪胨大豆肉湯內(nèi)有時(shí)液體澄清，菌量多時(shí)呈渾濁生長(zhǎng)。血平板上金黃色葡萄球菌呈金黃色，有時(shí)也為白色，大而突起、圓形、不透明、表面光滑，周?chē)腥苎?。Baird-Parker平板上金黃色葡萄球菌圓形突起、光滑、濕潤(rùn)，顏色呈灰色到黑色，邊緣淡色，周?chē)鸀橐粶啙釒В谄渫鈱佑幸煌该魅?。用接種針接觸菌落似有奶油樹(shù)膠的硬度。第28頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)——方法適用性MPN法：適用于檢測(cè)帶有大量競(jìng)爭(zhēng)菌的食品及其原料和未經(jīng)處理的含少量金黃色葡萄球菌的食品。直接平板計(jì)數(shù)法：適用于檢查金黃色葡萄球菌數(shù)不小于10/g（ml）的食品。增菌培養(yǎng)法：適用于檢查含有受損傷的金黃色葡萄球菌的加工食品。定量方法定性方法第29頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)——直接平板計(jì)數(shù)法

檢樣（50g+450mL稀釋液）適當(dāng)十倍稀釋樣品選擇2~3個(gè)連續(xù)適宜稀釋度

吸取1ml菌液按照0.3mL、0.3mL、0.4mL分別涂布于

3塊90mmBaird-Parker平板上（做平行試驗(yàn)）

35℃，45~48h

確證試驗(yàn)報(bào)告或涂布于1塊140mm平板上第30頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天FDABAM金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)——MPN法

檢樣（50g+450mL稀釋液）適當(dāng)十倍稀釋樣品選擇3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度的樣品稀釋液，每個(gè)稀釋度接種三管10%NaClTSB肉湯，每管接種1mL35℃，48±2h

從生長(zhǎng)的管中接種1環(huán)劃線于Baird-Parker平板上

35℃，48h

確證試驗(yàn)報(bào)告含1%丙酮酸鈉第31頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天FDABAM金黃色葡萄球菌確證試驗(yàn)1.凝固酶試驗(yàn)方法：從平板上至少挑取1個(gè)可疑金黃色葡萄球菌菌落，移種到TSB/BHI肉湯中，置35℃培養(yǎng)18-24h。取肉湯培養(yǎng)物0.3mL同0.5mL凝固酶試驗(yàn)兔血漿充分混合，置35℃培養(yǎng)，定時(shí)觀察是否有凝塊形成，至少觀察6h。

試驗(yàn)中需同時(shí)做已知陽(yáng)性和陰性對(duì)照。結(jié)果判定：以?xún)?nèi)容物完全凝固，使試管倒置或傾斜時(shí)不流動(dòng)為陽(yáng)性。部分凝固（2+和3+）的必須進(jìn)行生化鑒定加以證實(shí)。第32頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天FDABAM金黃色葡萄球菌確證試驗(yàn)2.革蘭氏染色對(duì)所有的可疑培養(yǎng)物都要進(jìn)行革蘭氏染色。3.生化鑒定過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)葡萄糖厭氧利用試驗(yàn)甘露醇厭氧利用試驗(yàn)金葡溶菌酶敏感性試驗(yàn)?zāi)蜔岷怂崦冈囼?yàn)（輔助）Staphylococcus

aureusonDNaseAgar第33頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天FDABAM

2種葡萄球菌和微球菌的典型特性特性S.aureusS.epidermidisMicrococci過(guò)氧化氫酶+++凝固酶+--耐熱核酸酶+--溶菌酶++-厭氧利用葡萄糖++-甘露醇+--第34頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天ISO金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)——MPN法

檢樣（xg+9xmL稀釋液）適當(dāng)十倍稀釋樣品選擇3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度的樣品稀釋液，每個(gè)稀釋度接種三管modifiedGiolittiandCantonibroth，

37℃，24~48h

從變黑或出現(xiàn)黑色沉淀的管中接種1環(huán)培養(yǎng)物于Baird-Parker平板上

37℃，48h

確證試驗(yàn)報(bào)告接種10mL于10mL雙料肉湯，接種1mL于9mL單料肉湯。小心的于接種管中培養(yǎng)基頂部?jī)A注一定量的水瓊脂，使其凝固形成密封塞。第35頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天ISO金黃色葡萄球菌確證試驗(yàn)?zāi)堂冈囼?yàn)結(jié)果判定：

-1+2+3+4+negativepositive第36頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天沙門(mén)氏菌屬簡(jiǎn)介1880年E.Berth首先發(fā)現(xiàn)傷寒沙門(mén)氏菌，1885年Salmon與Smith又分離出豬霍亂沙門(mén)氏菌，以后取Salmon氏之名為本菌屬之名。沙門(mén)氏菌屬是一群符合腸桿菌科定義并與其血清學(xué)相關(guān)的革蘭氏陰性、需氧性、無(wú)芽孢桿菌。本菌屬種類(lèi)繁多，抗原結(jié)構(gòu)復(fù)雜，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)2000多個(gè)血清型，我國(guó)已發(fā)現(xiàn)血清型近200個(gè)。

第37頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天沙門(mén)氏菌屬——生物學(xué)特性形態(tài)特征：

革蘭氏陰性，大小為1~3×0.4~0.9μm的兩端鈍圓的短桿菌，無(wú)芽孢，一般無(wú)莢膜，除雞沙門(mén)氏菌和雛沙門(mén)氏菌以外，都有周身鞭毛，運(yùn)動(dòng)力強(qiáng)。第38頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)特性：沙門(mén)氏菌需氧或兼性厭氧，10-42℃都可生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)溫度為37℃，最適pH為6.8~7.8。營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上：35~37℃培養(yǎng)18~24h，其菌落大小一般為2~3mm，光滑、濕潤(rùn)、無(wú)色、半透明、邊緣整齊。血平板上：中等大小的灰白色菌落。生化特性：絕大多數(shù)沙門(mén)氏菌有規(guī)律的發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，但也有不產(chǎn)氣者，不發(fā)酵蔗糖和側(cè)金盞花醇、不產(chǎn)生吲哚、不分解尿素。沙門(mén)氏菌屬——生物學(xué)特性第39頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天沙門(mén)氏菌屬的抗原菌體抗原（O抗原）表面抗原（K抗原）：Vi抗原和M抗原鞭毛抗原（H抗原）纖毛抗原第40頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天FDABAM沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)流程前增菌

25g樣+225mL乳糖肉湯（肉制品、肉副產(chǎn)品、動(dòng)物產(chǎn)品）勻質(zhì)2min，室溫放置60±5min

混合均勻，測(cè)定調(diào)節(jié)PH6.8±0.235℃、24±2h選擇性增菌

0.1ml+10mlMM（RV）

1ml+10mlTTB42℃、24h

（水浴培養(yǎng)）

35℃、24h43℃、24h（水浴培養(yǎng)）

含菌量高含菌量低分離培養(yǎng)劃線接種選擇性培養(yǎng)基（BS、XLD、HE）

35℃、24~48h（BS）生化鑒定每個(gè)平板挑取至少2個(gè)可疑菌（包括典型和非典型各2個(gè)）接種TSI三糖鐵、LIA賴(lài)氨酸鐵高層斜面（LIA高層深4cm）

（松蓋以保持有氧條件防止產(chǎn)生過(guò)多H2S）

35℃、24±2h

棄去尿素酶試驗(yàn)衛(wèi)矛醇、氰化鉀、丙二酸鈉、吲哚試驗(yàn)

陽(yáng)性

陰性血清學(xué)血清學(xué)試驗(yàn)——沙門(mén)氏菌的分類(lèi)報(bào)告結(jié)果生鮮食物、嚴(yán)重污染的食品和動(dòng)物飼料第41頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天ISO6579沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)流程前增菌

25g樣+225mLBPW

勻質(zhì)

37±1℃、18±2h選擇性增菌

0.1ml+10mlRVS1ml+10mlMKTTn41.5±1℃、24±3h37±1℃、24±3h

（水浴培養(yǎng)）分離培養(yǎng)劃線接種選擇性培養(yǎng)基（XLD和第二種選擇性培養(yǎng)基，如BS）

37℃、24~48h（BS）每個(gè)平板挑取至少5個(gè)可疑菌進(jìn)行純培養(yǎng)和確認(rèn)試驗(yàn)

37℃、24±3h

生化鑒定

TSI、尿素酶、賴(lài)氨酸脫羧酶、β-牛乳糖、V-P、吲哚試驗(yàn)血清學(xué)血清學(xué)試驗(yàn)——沙門(mén)氏菌的分類(lèi)報(bào)告結(jié)果第42頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天ISO6579沙門(mén)氏菌生化試驗(yàn)表試驗(yàn)沙門(mén)氏菌屬傷寒A型副傷寒B型副傷寒C型副傷寒其他菌屬反應(yīng)%b反應(yīng)%b反應(yīng)%c反應(yīng)%c反應(yīng)%bTSI葡萄糖產(chǎn)酸+100+100+++100TSI葡萄糖產(chǎn)氣-d0+100+++92TSI乳糖產(chǎn)酸-2-100---1TSI蔗糖產(chǎn)酸-0-0---1TSI硫化氫產(chǎn)生+97-10+++92尿素水解-0-0---1賴(lài)氨酸脫羧酶+98-0+++95β-牛乳糖反應(yīng)-0-0---2eV-P反應(yīng)-0-0---0吲哚反應(yīng)-0-0---1b：百分率表明并不是所有分離到的沙門(mén)氏菌血清型都會(huì)顯示+或-的結(jié)果。c：這些百分率不能從現(xiàn)有的文獻(xiàn)中獲得。d：傷寒沙門(mén)氏菌不產(chǎn)氣e：亞利桑那亞型腸炎沙門(mén)氏菌為乳糖陽(yáng)性或陰性反應(yīng)，但通常β-牛乳糖反應(yīng)陽(yáng)性。第43頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)選擇性分離培養(yǎng)XLD瓊脂：FDABAM——典型菌落：粉色菌落，帶或不帶黑色中心。許多沙門(mén)氏菌培養(yǎng)物可呈現(xiàn)大的具光澤的黑色中心或幾乎為全部黑色的菌落。

——非典型菌落：黃色帶或不帶黑色中心。ISO——中心黑色、周?chē)捎谥甘緞╊伾母淖兌霈F(xiàn)紅色的輕微透明帶。菌名菌落形態(tài)鼠傷寒沙門(mén)氏菌紅色，有黑心傷寒沙門(mén)氏菌紅色，有黑心弗氏志賀氏菌紅色大腸埃希氏菌黃色，有膽鹽沉淀環(huán)糞鏈球菌-第44頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)選擇性分離培養(yǎng)BS瓊脂：FDABAM——典型菌落：產(chǎn)硫化氫菌落黑色有金屬光澤、棕褐色或灰色，菌落周?chē)呐囵B(yǎng)基通常開(kāi)始呈褐色，但伴隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而變?yōu)楹谏⒂袝灜h(huán)效應(yīng)；

——非典型菌落：有些菌株不產(chǎn)生硫化氫，形成灰綠色菌落，周?chē)囵B(yǎng)基不變色。菌名菌落形態(tài)傷寒沙門(mén)氏菌黑色，有金屬光澤鼠傷寒沙門(mén)氏菌黑色，有金屬光澤奇異變形桿菌褐色或呈黑色，無(wú)金屬光澤弗氏志賀氏菌棕色至綠色大腸埃希氏菌棕色至綠色糞鏈球菌-5007144104Blank50115第45頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)選擇性分離培養(yǎng)HE瓊脂：FDABAM——典型菌落：蘭綠色至蘭色，多數(shù)菌株產(chǎn)硫化氫，菌落帶或不帶黑色中心或幾乎全黑色。

——非典型菌落：乳糖陽(yáng)性的菌株為黃色中心黑色或全黑色。菌名菌落形態(tài)傷寒沙門(mén)氏菌藍(lán)綠色，部分有黑心鼠傷寒沙門(mén)氏菌藍(lán)綠色，部分有黑心奇異變形桿菌藍(lán)綠色，有或無(wú)黑心弗氏志賀氏菌藍(lán)綠色大腸埃希氏菌橙紅色，有膽酸鹽沉淀糞鏈球菌-第46頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)生化鑒定TSI：典型反應(yīng)：斜面產(chǎn)堿（K）：紅色；底部產(chǎn)酸（A）：黃色；產(chǎn)H2S：黑色（少數(shù)不產(chǎn)）菌名生化反應(yīng)腸炎沙門(mén)氏菌K/A，產(chǎn)氣，產(chǎn)H2S大腸埃希氏菌A/A，產(chǎn)氣銅綠假單胞菌K/K奇異變形桿菌K/A，產(chǎn)H2S弗氏檸檬酸桿菌A/A，產(chǎn)H2S弗氏志賀氏菌K/A第47頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)——幾點(diǎn)注意冷凍樣品解凍需在45℃以下，有自動(dòng)調(diào)溫器自控的水浴鍋內(nèi)不斷攪拌進(jìn)行15min或在2-8℃，18小時(shí)內(nèi)軟化。為保證檢驗(yàn)的準(zhǔn)確性，必須在選擇性培養(yǎng)基上挑取足夠數(shù)量的菌落進(jìn)行生化和血清學(xué)鑒定。進(jìn)行生化反應(yīng)時(shí)，應(yīng)以純培養(yǎng)物進(jìn)行試驗(yàn)，如出現(xiàn)血清學(xué)陽(yáng)性，而生化反應(yīng)特征不符合時(shí)，應(yīng)對(duì)接種物進(jìn)行純化，用純化后的培養(yǎng)物重新進(jìn)行生化試驗(yàn)。測(cè)試中應(yīng)同時(shí)接種陽(yáng)性對(duì)照菌株。第48頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天李斯特菌屬簡(jiǎn)介《伯杰氏鑒定細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》第9版中，李斯特菌屬有7個(gè)種：?jiǎn)魏思?xì)胞增生李斯特氏菌（L.monocytogenes）、英諾克李斯特氏菌（L.innocua）、西爾李斯特氏菌（L.seeligeri）、威爾斯李斯特氏菌（L.welshimeri）、綿羊李斯特氏菌（L.ivanovvi）、格氏李斯特氏菌（L.grayi）、默氏李斯特氏菌（L.murrayi）。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌是李斯特氏菌病的致病菌，可引起動(dòng)物的感染，也可引起人的感染。第49頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天單核細(xì)胞增生李斯特氏菌——生物學(xué)特性形態(tài)特征：

革蘭氏陽(yáng)性短桿菌，大小為0.4~0.5×0.5~2μm，兩端鈍圓，常兩兩相串成彎曲及V形，偶爾有球狀、雙球狀、短鏈狀，但很少有長(zhǎng)鏈狀，兼性厭氧、無(wú)芽孢，一般不形成莢膜。該菌有4根周毛和1根端毛，周毛易脫落。20℃培養(yǎng)后可見(jiàn)到很多鞭毛。第50頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)特性：生長(zhǎng)溫度為2~42℃（冷藏不能阻止該菌的生長(zhǎng)），最適生長(zhǎng)溫度為35~37℃。20~25℃培養(yǎng)有動(dòng)力，37℃培養(yǎng)動(dòng)力消失；在顯微鏡下觀察該菌新鮮的室溫肉湯培養(yǎng)物可見(jiàn)翻筋斗運(yùn)動(dòng)。在pH3.8~4.4仍能生長(zhǎng)，在pH中性至弱堿性（9.6）、氧分壓略低、二氧化碳張力略高的條件下該菌生長(zhǎng)良好，在6.5%NaCl肉湯中也能良好生長(zhǎng)。血平板上：菌落通常不大呈灰白色，刺種血平板可產(chǎn)生窄小的β溶血環(huán)。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌——生物學(xué)特性第51頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天FDABAM單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)流程

檢樣25g增菌

EB增菌液基礎(chǔ)225mL30℃4h

加入抑菌劑

30℃20h30℃44h選擇性分離培養(yǎng)接種OXA和PALCAM接種OXA和PALCAM35℃24-48h35℃24-48h

生化鑒定

TSA-YE純培養(yǎng)

30℃24-48h

典型運(yùn)動(dòng)TSB-YE

過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)革蘭氏染色溶血試驗(yàn)

麥芽糖葡萄糖硝酸鹽還原試驗(yàn)甘露醇七葉苷鼠李糖木糖SIM動(dòng)力培養(yǎng)24h培養(yǎng)48h第52頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天ISO單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)流程測(cè)試樣品（xg或xmL）+9xmL一次增菌培養(yǎng)基（HalfFraser肉湯）

30℃培養(yǎng)24±2h1mL培養(yǎng)液加入劃線接種Oxford瓊脂

10mL二次增菌培養(yǎng)基中和PALCAM瓊脂（Fraser肉湯）

35℃或37℃培養(yǎng)48±2h30℃、35℃或劃線接種Oxford瓊脂37℃培養(yǎng)24-48h

和PALCAM瓊脂

30℃、35℃或37℃培養(yǎng)24-48h

李斯特菌屬的確證：

-

挑取可疑菌接種TSAYE培養(yǎng)基

-

過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)

-

革蘭氏染色

-

動(dòng)力試驗(yàn)

單核細(xì)胞增生李斯特菌的確證：

-

溶血試驗(yàn)

-

碳源利用試驗(yàn)

-CAMP（協(xié)同溶血）試驗(yàn)

第53頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天單核細(xì)胞增生李斯特氏菌選擇性分離培養(yǎng)OXA瓊脂F(xiàn)DA：灰黑色菌落，周?chē)泻谏h(huán)。ISO：生長(zhǎng)在牛津瓊脂上24h的典型李斯特氏菌呈?。?mm）、灰色的菌落外圍是黑色的暈輪；48h后菌落變暗，可能見(jiàn)到綠色的輝光，直徑約2mm。有黑色的暈輪并且中間凹陷。Oxford瓊脂平板培養(yǎng)于30℃適合于僅受額外菌群輕度污染的食品，對(duì)于受額外菌群重度污染的食品，最好培養(yǎng)于35℃或37℃，因?yàn)槔钏固厥暇呌诤皖~外菌群一同生長(zhǎng)。第54頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天單核細(xì)胞增生李斯特氏菌選擇性分離培養(yǎng)PALCAM瓊脂菌名生長(zhǎng)情況菌落形態(tài)及培養(yǎng)基變化大腸桿菌完全抑制培養(yǎng)基顏色無(wú)變化金黃色葡萄球菌部分抑制菌落及其周?chē)囵B(yǎng)基變黃糞鏈球菌完全抑制培養(yǎng)基顏色無(wú)變化英諾克李斯特氏菌生長(zhǎng)良好灰綠色菌落，周?chē)囵B(yǎng)基變黑綿羊李斯特氏菌生長(zhǎng)良好灰綠色菌落，周?chē)囵B(yǎng)基變黑單增李斯特氏菌生長(zhǎng)良好灰綠色菌落，周?chē)囵B(yǎng)基變黑